专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器，特别涉及利用色谱法的生物传感器。
免疫色谱传感器的结构一般具有添加被检查溶液的添加层、多个展开层、展开层的终端上设有吸水层。并且，在该展开层的局部具有使被检查溶液中的测定对象物对应的抗体固定化的抗体固定化部，被标记在比该抗体固定化部更靠近添加层侧的抗体，以可以让被检查溶液溶出的干燥状态保持在标记试剂保持部。
这样的免疫色谱传感器通过在添加层添加必要量的被检查溶液，被检查溶液浸透在展开层上设有的多孔质材料中，由此开始测定。
作为被检查溶液的添加方法常使用将添加部分在被检查溶液中浸渍一定时间的方法，以及使用高精度的进样器、或者移液管等添加一定量的方法，或者在尿等作为被检测溶液时，排尿时直接使被检测溶液放置在添加部分一定时间的方法等。
免疫色谱传感器的测定结果通过结合在抗体固定化部的标记抗体检测。作为该标记抗体一般的标记物中有胶体金粒子，抗体固定化部的结合通过金胶体粒子可以目测，可以通过目测得到测定结果。另外，尽管这是将固定化抗体-测定对象物-标记抗体的复合体形成的抗原抗体反应的夹层反应作为测定原理，但是除此之外在将竞争反应作为测定原理的场合，同样可以通过确认抗体固定化或抗原固定化部上的标记抗体的结合状态，得到测定结果。
另外，对于所述的夹层反应得到的测定结果需要根据目测定性判定，但是所需要的测定结果为半定量或需要精度更高的判定时，有特开平10-274624号公报公开的使用光学读取装置，利用透过方式读取的方法；特开平10-274653号公报中公开的利用照相机等将测定结果进行照相读取、演算处理的方法等。
近几年在医疗诊断现场上依据POC(测试点.观察.护理)的观点、希望得到迅速、简便、正确、而且价格低、容易得到的测定装置，但是根据如前所述的方法在将被检查溶液添加到传感器部的情况，例如被检查溶液为血液，使用注射器进行采血，一般地利用离心分离等分离有形成分的血细胞和血浆，进行这样的操作之后，必须使用进样器或者移液管等用具，添加到传感器部。
这样的利用注射器采血的方法作为医疗技术需要特殊的机能，而且需要离心分离操作，一般家庭没有这些技术的人不能进行自己测定。
另外在定量被检查溶液时，由于需要进样器等器具，操作繁杂，存在问题。
在被检查溶液是尿等的情况，有如下方法可以取样一次储尿在纸杯等容器中，使传感器的局部浸渍一定时间的方法；以及如果需要定量一定体积的被检查溶液，将这些储尿物和血液一样使用进样器、或者移液管等进行添加的方法；或者如果是在不需要定量精度进行测定的精度比较低的传感器，在排尿时直接一定时间将尿放置到添加部分的方法，但是利用这些方法在需要一次储尿到纸杯中，直接接触到尿的场合没有正确地规定被检查溶液体积的方法，结果限定在精度低的定性测定等，存在问题。
本发明是为了解决相关的问题点而进行的，目的在于提供不需要高度装置或者操作，即使是微量体积的被检查溶液也可以简单而且高精度的进行测定的生物传感器。
本发明是一种生物传感器，在展开被检查溶液的展开层的局部上，具有被固定化的试剂固定化部，通过测定该试剂固定化部分上的所述标记试剂的结合量，由此定性或定量所述被检查溶液中的测定成分。其特征为，具有空间形成部，由所述被检查溶液流入的空间的间隙部在与所述展开层的之间形成，同时在所述间隙部中设有保持可以利用所述被检查溶液的流入而溶解的标记试剂的标记试剂保持部。由此被检查溶液被导入间隙部内时，由于间隙部内的被检查溶液中的标记试剂溶解以及扩散，标记试剂相对于被检查溶液可以更加均一地扩散，可以进行简单而且高精度的测定。
本发明的特征在于，所述间隙部临时地保持被检查溶液。由此，可以确认被检查溶液向间隙部浸透的吸取量，同时可以更加确实地向展开层浸透，减轻测定误操作以及检测物的不足，可以进行更高精度的测定。
本发明的特征在于，所述间隙部通过该间隙部的体积规定被检查溶液的流入量。由此，不需要预先定量一定体积的被检查溶液的操作，不需要检测物的采取等特殊的技能，通过简单的操作可以进行测定。
本发明的特征在于，所述间隙部具有流入展开所述展开层的足够的被检查溶液的体积。由此，通过相对测定必要的被检查溶液量，将空间体积设定为足够的体积，消除检测物不足，可以进行更高精度的测定。
本发明的特征在于，在所述间隙部中设有破坏细胞成分的细胞成分破坏试剂部。由此使含有血液等的细胞成分的被检查溶液的测定不需要预先离心分离等操作，可以直接作为被检查溶液添加到间隙部，添加的被检查溶液被吸引到间隙部，因而在添加被检查溶液时，不需要用于添加的装置以及被检查溶液的预处理装置，可以利用简单的操作进行测定。
本发明的特征在于，在所述间隙部中设有收缩细胞成分的细胞成分收缩试剂部。由此即使在使用具有细胞成分的被检查溶液的场合，利用细胞成分收缩剂的功能，不存在因细胞成分使所述展开层堵塞，可以进行简单的测定操作，同时得到高精度的结果。
本发明的特征在于在所述间隙部中设有漂白试剂部。由此可以降低被检查溶液具有的颜色等、对反应没有关系的颜色残留在反应读取的所述试剂固定化部产生的对测定的不好的影响，可以得到高精度的测定结果，具有效果。
本发明的特征在于所述间隙部具有20μl(微升)以下的体积。由此即使被检查溶液为极微量时、以及利用采血用穿刺器具等采取的微量未知体积的被检测溶液进行测定的场合，由于向规定的体积的间隙部内添加，所以可以导入正确的体积的被检查溶液，即使在微量被检查溶液的情况也可以进行高精度的测定。
另外，本发明的特征在于，所述间隙部具有确认从外部流入被检查溶液的方法。由此通过确认或检出测定的被检查溶液流入，可以检出测定开始时间，而且、通过得到适当的被检查溶液可以消除被检查溶液的不足和检出正确的测定开始时间，可以进行更高精度的测定。
本发明的特征在于，所述空间形成部其局部或全部具有光透过性。由此，使用目测或光学测定法可以从外部观察被检查溶液的吸引量，可以消除被检查溶液量的不足时导致的测定误操作，可以进行更高精度的测定。
本发明的特征在于，在所述间隙部中设有分离测定时不需要的有形成分的分离部。由此可以获得在测定被检查溶液时可分离不需要的有形成分的效果，不需要通过离心分离、过滤等操作预先除去测定被检查溶液时不需要的有形成分，可以进行简易而高精度的测定。
本发明的特征在于，具有接触所述间隙部，保持被检查溶液的检测物保持部，由此可以不需要将被检查溶液采取后转移到另一个容器的操作，以及定量一定体积的采取的被检查溶液的操作，同时可以用检测物保持部保持被检查溶液，降低检测物对外部的污染，可以卫生、快速、而且简易地进行高精度的测定。
本发明的特征在于，所述检测物保持部可以保持比所述间隙部的体积大的被检查溶液量。由此可以保持在测定时必要体积的被检查溶液，可以防止被检查溶液向外部扩散、污染，进行更加安全、卫生的测定，同时可以消除被检查溶液的不足，进行正确的测定。
本发明的特征在于，所述检测物保持部的底面高度的位置处于相对所述间隙部内的底面的高度位置的相同或高处的位置。由此被检查溶液容易流入间隙部，可以进行正确的测定。
本发明的特征在于，在所述间隙部具有100μl以下的体积。由此可以吸入微小的被检查溶液，同时也可以使测定操作容易，保持高的操作性。
此外，本发明的特征在于，在所述间隙部设有帮助被检测溶液流入的空气孔。由此确实地除去间隙部内检测物流入以前存在的空气，可以迅速地而且确实地使被检测溶液向间隙部流入。
本发明的特征在于，在所述间隙部设有利用被检测溶液的浸透可以湿润的多孔质材料。由此在使被检查溶液流入间隙部时，多孔质材料成为流入的辅助材料，容易流入，另外多孔质材料使被检查溶液中的杂质滤去，可以降低展开层流入、浸透障碍。
本发明的特征在于，包括所述试剂固定化部的试剂以及所述标记试剂的所有的试剂为干燥状态，同时其整体为干燥状态。由此可以得到保存稳定性能好、而且搬运自如的生物传感器。
本发明的特征在于，所述生物传感器用于免疫色谱法。由此在作为简易法使用的免疫色谱法中，不需要利用高精度等进样器定量一定体积的被检查溶液，通过添加不太准确的量的被检查溶液，通过所述间隙部可以准确定量一定体积的被检查溶液，实现更高精度的测定。
本发明的特征在于，所述生物传感器用于免疫色谱法。由此在作为简易法使用的一步免疫色谱法中，测定时不需要使用者预先定量被检查溶液的体积，另外，降低液体量测定的误差带来的误判断，不影响已有的一步免疫色谱法具有的简易操作，可以实现更高精度的测定。
图2是本发明实施方案1的具有分离层的生物传感器的结构图。
图3是本发明实施方案1的具有细胞成分破坏试剂部的生物传感器的结构图。
图4是本发明实施方案2的生物传感器的结构图。
图5是显示本发明实施例1的hCG浓度和吸光度的关系的图。
图6是本发明实施方案3的生物传感器的结构图。
图7是显示使用本发明实施方案3的生物传感器测定时的状况图。
图8是显示本发明实施方案2的CRP浓度和吸光度的关系的图。
在
图1上，2是展开被检查溶液的展开层，由硝化纤维素构成。3表示展开层2上的吸水层，由玻璃纤维滤纸构成。在展开层2上使用的材料只要是可以由被检查溶液湿润的材料就可以，也可以如滤纸、无纺布、薄膜、布等任意的多孔质材料构成。另外在本说明书中，被检查溶液和检测物实质上是指相同的物质。
4是在展开层2的局部、以可以利用被检查溶液的展开而溶出的干燥状态，将被检查溶液中的测定对象物相对应的抗体利用金胶体标记，保持着的标记试剂保持部。5是在展开层2的局部使被检查溶液中的测定对象物对应的抗体固定化的试剂固定化部分，该被检查溶液中的测定对象物对应的抗体在和标记试剂保持部4保持的标记试剂不同的表位结合，以可以和被检查溶液中的测定对象物形成复合体的干燥状态被固定化。
另外，利用所述的标记试剂保持部4标记抗体的金胶体是作为检出该试剂固定化部5上的结合的方法而选择的，除此之外还可以任意选择有酶、蛋白质、色素、荧光色素、胶乳等的着色粒子等。
6是除了展开层2的局部，密封包覆的液体不透过性薄片材料，这里由透明PET带构成。在此通过由该液体不透过性薄片材料6包覆在展开层2上，遮断保护向被检查溶液的添加部分之外的斑点部分，同时可以防止来自外部的污染，如无意地接触被检查溶液以及被检查者用手等直接接触展开层2等。另外包覆试剂固定化部5的液体不透过性薄片材料6由于是确认测定结果的部分，所以优选透明的材料，至少优选被检查溶液具有可以透过的状态。另外在需要进行更高精度的测定时，也可以采取如下的结构，不只是液体不透过性薄片材料6包覆的展开层2的上部，也使被检查溶液的浸透方向相对的平行侧面密封。
7是保持展开层2的基板，由白色PET薄膜构成。该基板7具有增强展开层2的作用，同时在使用血液、唾液、尿等具有感染危险的溶液作为被检查溶液的情况，也具有将其遮断的作用。而且也可以在展开层2湿润时具有光透过性的情况下具有遮断光的效果。
8是形成利用毛细管现象使被检查溶液流入展开层2所用的空间的间隙部1的空间形成材料，是由透明PET薄膜层压而构成。该空间形成材料8在使用添加被检查溶液后的生物传感器时，也具有保护无意的被检查溶液向外部的附着或者飞散等污染的作用。
另外，在空间形成材料8上也可以设有帮助间隙部1对应的被检查溶液的流入的空气孔。根据空间形成材料8的形状，有时使间隙部1的被检查溶液附着所用的端部以外的端部由侧壁等堵塞，在这种情况下，即使使检测物附着在间隙部1的开口的端部，在该检测物导入以前间隙部1存在的空气也不从间隙部1除去，或者由于难于除去，不是被检查溶液向间隙部1的导入变慢，就是形成没有完全导入的状态，出现提供精度低的测定结果或者错误的测定结果的情况。对此，在空间形成材料8上设有空气孔，可以除去间隙部1内的空气，被检测物容易流入间隙部1，可以防止出现对测定具有不好的影响。该空气孔优选设置在所述间隙部被检测溶液流入方向看最靠里面的部分，根据需要即使设置在最里部以外，也没有问题。作为空间形成材料8的材料除使用ABS、聚苯乙烯、聚氯乙烯等合成树脂材料之外，也可以使用金属、玻璃等溶液不透过性材料，为确认向检测溶液的间隙部1流入，优选透明或半透明者。也可以利用不透明的有色或者不透明的材料构成。
间隙部1通过空间形成材料8配置在展开层2上而形成，该间隙部1和展开层2接触，所以被检查溶液流入间隙部1，由此开始向被检查溶液的展开层2浸透，进行测定。在被检查溶液为极微量的情况，或者测定由采血用穿刺器具等采取的微量未知体积的被检查溶液的情况，为了进行高精度的测定，该间隙部1的体积优选20μl(微升)以下。
另外在将具有细胞成分的被检测溶液作为检测物时，优选在间隙部1上设定保持细胞收缩试剂的构成，例如作为细胞收缩试剂使用氯化钾。通过设置这样的细胞收缩试剂，即使在使用具有细胞成分的被检查溶液的情况，也不需要使用高精度的进样器预先定量一定体积的被检查溶液，可以进行简易的测定操作，另外，利用细胞成分收缩剂的作用，不出现细胞成分使所述展开层堵塞，可以得到高精度的测定结果。细胞收缩试剂是在所述检查溶液中含有细胞成分的情况应该设置的试剂，在使用不含细胞成分的被检查溶液的情况不是特别需要。另外细胞收缩剂只要具有使细胞收缩的效果就可以，除了所述氯化钾之外，也可以同样可以使用包括无机盐、氯化钠、磷酸钠等盐的无机化合物，以及甘氨酸、谷氨酸等氨基酸，脯氨酸等亚氨酸、葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖类，山梨醇等的糖醇。含有这样的细胞成分收缩剂体系特别在将全血作为被检查溶液的情况有效。
另外根据需要可以使过碳酸钠作为具有漂白作用的试剂成分保持在间隙部1中。设置这样的漂白试剂，降低被检查溶液具有的颜色产生的、相对反应读取的试剂固定化部5产生的、所谓的本底，结果可以增大S/N比，获得尽管简易但是具有高精度测定的结果的效果。这里所谓的本底是指与反应无关的颜色、例如被检查溶液自身有颜色时，包含试剂固定化部分，在展开层整体上存在颜色残留的现象。另外S/N比是指这种情况，反应中的所述标记试剂得到的信号和所述展开层以外、不是来自所述标记试剂的本底引起得到的所谓的噪音的比。
另外图2是显示所述图1表示的生物传感器上设置分离层的一个例子的图，图2(a)是生物传感器的分解图，图2(b)使生物传感器的立体图。另外对于和图1相同的构成，使用相同的符号，省略说明。
9是可以分离测定时不需要的有形成分的分离层，由玻璃纤维滤纸构成。另外分离层9是使用玻璃纤维滤纸的一个例子，和展开层2上使用的材料同样，只要是利用被检查溶液可以湿润的材料就可以，如可以利用如无纺布、滤纸、玻璃纤维、膜滤器、布等任意的多孔质材料构成。特别是作为分离层9使用可以湿润的多孔质材料时，过滤杂质，可以防止杂质向展开层流入，以及杂质产生的测定时必要成分浸透堵塞，同时，该分离层9具有被检查溶液流入的辅助材料的功能，使被检查溶液向间隙部1的流入容易。
另外，图3是由图1表示的生物传感器上设有细胞成分破坏试剂部的一个实例，图3(a)是生物传感器的分解图，图3(b)是生物传感器的立体图。另外对于和图1相同的构成，使用相同的符号，省略说明。
10是保持破坏细胞成分的细胞成分破坏试剂的细胞成分破坏试剂部，将氯化钠处理成干燥状态，以利用被检查溶液的浸透可以溶解的状态保持。另外细胞成分破坏试剂部10除了利用氯化钠构成之外，只要是破坏细胞成分的试剂就可以，例如可以由表面活性剂、氯化物、皂甙类、溶菌酶等任意的试剂构成。
下面使用图1、图2、图3对本发明的实施方案1的生物传感器进行说明。
首先使被检查溶液接触间隙部1，利用毛细管现象被检查溶液流入间隙部1中。流入间隙部1的被检查溶液从间隙部1和展开层2接触的部分浸透到展开层2的终端侧。被检查溶液到达标记试剂保持部4时，在标记试剂保持部4标记的标记试剂开始溶出。这是，只要被检查溶液中存在测定对象物，从标记试剂保持部4开始，金胶体标记抗体一边反应一边进行浸透。然后被检查溶液中的到达试剂固定化部5时，如果测定对象物存在，根据存在的量形成固定化抗体和测定对象物和标记抗体的复合物。另一方面，如果测定对象物不存在，或者是检出灵敏度以下的量，标记抗体其大半不形成复合体，就通过展开层2上。之后浸透展开层2上的被检测溶液由吸水层3吸收，结束测定。另外通过确认试剂固定化部5的标记试剂的结合状态可以得到测定结果。
如图2所示，在间隙部1的空间内具有分离层9的场合，被检查溶液接触间隙部1，设在间隙部1内的分离层9分离被检查溶液中测定时不需要的杂质，或者分离有形成分，除去杂质或有形成分的被检查溶液向展开层2浸透，进行测定。
另外，在使用含有全血等的细胞成分的检查试剂液时，使用如图3所示的间隙部1的空间部上具有细胞成分破坏试剂部10的生物传感器的情况下，被检查溶液接触间隙部1，设在间隙部1内的细胞成分破坏试剂部10破坏处理被检查溶液中所含的全血等细胞成分，除去细胞成分的被检查溶液向展开层2浸透，进行测定。
这样利用本实施方案1得到的生物传感器，在展开层2上配置形成空间的空间形成材料8，使被检查溶液接触由展开层2和空间形成材料8形成的间隙部1，由此进行测定，所以不用使用高精度的进样器，即使在微量未知体积的被检查溶液的液滴中，通过使其液滴接触间隙部1，被检查溶液确实地被吸引到空间中，可以进行简易且高精度的测定。
另外，通过根据需要在间隙部1的空间部设有分离层9，由于测定时使用的被检查溶液中存在不需要的有形成分、或者在可能存在的情况下，可以除去其不需要的有形成分，所以不需要进行预先离心分离以及过滤等操作，利用简易的操作可以进行高精度的测定。
另外，通过在展开层上设有细胞成分破坏试剂部10，可以进行使用含有血液等的细胞成分的被检查溶液的测定，不需要预先进行离心分离等操作，可以直接将全血作为被检查溶液进行测定，进行简易而且高精度的测定。
另外，为了确认被检测溶液的流入量是否充分，或者确定测定的开始，或者为了确认被检查溶液的种类等，也可以做成透过空间形成材料8可以确认的结构。另外通过间隙部1的体积规定流入间隙部1内的被检查溶液的体积，因此可以进行适合采取的被检查溶液的量的测定。另外通过在间隙部1内具有足够的流入被检查溶液的体积，可以消除检测物不足，进行正确性更高的测定。
另外，在需要定性判定的情况下，可以利用目测进行测定。另外，在进行精度高的测定时，利用液体不透过性材料使相对被检查溶液的浸透方向展开层2的平行侧面、以及展开层2上面密封密闭，由此使被检查溶液的浸透整齐，形成相应于被检查溶液中的测定对象物的量的更加均一的量的复合体。另外，也可以使用光学方法，测定标记物的结合量，由此得到定量的结果。
另外，本发明的实施方案1中，对形成固定化抗体和测定对象物和标记抗体的复合物的夹层反应上的抗原抗体反应进行了说明，通过试剂的选择，在使用和被检查溶液中的测定对象物竞争性反应的试剂的情况下，也可以进行竞争反应。另外，对抗原抗体反应以外也同样，在欲利用特异的结合的情况下，也可以由任意的试剂成分构成。
实施方案2图4是本发明实施方案2的生物传感器的结构图的一个例子，图4(a)是生物传感器的分解图；图4(b)是生物传感器的立体图。另外对于和图1相同的构成，使用相同的符号，省略说明。
图4和图1的结构的不同是图1中标记试剂保持部4标记在展开层2上，相应地图4是使保持标记试剂的标记试剂保持层14在展开层2上层叠。
下面使用图4对本发明的实施方案2的生物传感器的测定方法进行说明。
首先使被检查溶液接触间隙部1，利用毛细管现象被检查溶液流入间隙部1中。流入间隙部1的被检查溶液从标记试剂保持层14和间隙部1和展开层2接触的部分，浸透到展开层2的终端侧。这时，从被层叠在展开层2上的标记试剂保持层14开始溶出被标记的标记试剂。只要被检查溶液存在测定对象物，从标记试剂保持部14开始，金胶体标记抗体一边反应一边进行浸透。然后被检查溶液到达试剂固定化部5时，如果测定对象物存在，根据存在的量形成固定化抗体-测定对象物-标记抗体的复合物。另一方面，如果测定对象物不存在，或者是检出灵敏度以下的量，标记抗体其大半不形成复合体，就通过展开层2上。之后浸透展开层2上的被检测溶液由吸水层3吸收，结束测定。另外通过确认试剂固定化部5的标记试剂的结合状态可以得到测定结果。
这样利用本实施方案2得到的生物传感器，使在展开层2上保持标记试剂的标记试剂保持层14层叠，通过使被检查溶液接触由展开层2和标记试剂保持层14形成的间隙部1，进行测定，所以溶解在被检查溶液的标记试剂不保持在滤纸等担体上，由于标记试剂在间隙部1内的被检查溶液中溶解以及扩散，所以标记试剂相对被检查溶液可以进行更均一的扩散，可以提供更高精度的生物传感器。
另外，测定时必要的试剂成分也可以通过以干燥状态形成在和标记抗体同样的空间内，从而可以使测定时必要的被检查溶液整体均一地溶解。这里所述的测定时必要的试剂成分是指细胞成分破坏试剂、酶底物、凝集试剂、缓冲液试剂、蛋白质保护试剂等，可以任意地导入测定时必要的各种试剂成分。
另外，通过根据需要在间隙部1的空间部设有分离层9，由于测定时使用的被检查溶液中存在不需要的有形成分、或者在可能存在的情况下，可以除去其不需要的有形成分，所以不需要进行预先离心分离以及过滤等操作，利用简易的操作可以进行高精度的测定。
另外，通过在展开层上设有细胞成分破坏试剂部10，可以进行使用含有血液等的细胞成分的被检查溶液的测定，不需要预先进行离心分离等操作，可以直接将全血作为被检查溶液进行测定，进行简易而且高精度的测定。
另外，为了确认被检测溶液的流入量是否充分，或者确定测定的开始，或者为了确认被检查溶液的种类等，也可以做成透过空间形成材料8可以确认的结构。
另外通过间隙部1的体积规定流入间隙部1内的被检查溶液的体积，由此可以进行适合采取的被检查溶液的量的测定。
另外通过在间隙部1内具有流入足够的被检查溶液的体积，可以消除检测物不足，进行正确性更高的测定。
另外，在需要定性判定的情况下，可以利用目测进行测定。另外，在进行精度高的测定时，利用液体不透过性材料使相对被检查溶液的浸透方向展开层2的平行侧面、以及展开层2上面密封密闭，由此使被检查溶液的浸透整齐，形成相应于被检查溶液中的测定对象物的量的更加均一的量的复合体。另外，也可以使用光学方法，测定标记物的结合量，由此得到定量的结果。
另外，本发明的实施方案2中，对形成固定化抗体和测定对象物和标记抗体的复合物的夹层反应中的抗原抗体反应进行了说明，通过试剂的选择，在使用和被检查溶液中的测定对象物竞争性反应的试剂的情况下，也可以进行竞争反应。另外，对抗原抗体反应以外也同样，在欲利用特异性结合的情况下，也可以由任意的试剂成分构成。
实施方案3图6是本发明实施方案3的生物传感器的结构图，图6(a)是生物传感器的分解图；图6(b)是生物传感器的立体图。在图上和图1相同的符号表示相同或相当的部分。
在图6(a)以及图6(b)上，保持展开层2的基板17由白色PET薄膜构成。基板17比展开层2纵向的长度长，基板17的端部附近设有展开层2不配置的区域的检测物保持区域17a。该基板17具有增强展开层2的作用，同时在使用血液、唾液、尿等具有感染危险的溶液作为被检查溶液的情况，也具有将其遮断的作用。而且也可以在展开层2湿润时具有光透过性的情况下具有遮断光的效果。18是形成利用毛细管现象使被检查溶液流入展开层2所用的空间的间隙部1的空间形成材料，这里，利用透明PET薄膜层压的物质而构成。该空间形成材料18呈覆盖展开层2以及检测物保持区域17a上而配置，空间形成材料18的试剂固定化部5相对侧的端部以外的端部和基板17的周边部分密封。空间形成材料18在使用添加被检查溶液后的生物传感器时，也具有保护无意的被检查溶液向外部的附着或者飞散等污染的作用。空间形成材料18除使用ABS、聚苯乙烯、聚氯乙烯等合成树脂材料之外，也可以使用金属、玻璃等溶液不透过性材料，优选透明或半透明材料，也可以用不透明的有色或者不透明的材料构成。在空间形成材料18的检测物保持区域17a的区域上设有开口部18a。该开口部18a、检测物保持区域17a和空间形成材料18的包围检测物保持区域17a的部分构成从外部添加被检查溶液的部分的检测物保持部11。1是间隙部，通过空间形成材料8配置在展开层2上而形成。
所述实施方案1所示的例子适合利用微量采血针等进行微量采血的指尖血直接添加的情况。但是在医疗现场也多使用注射器采血或真空采血管进行的真空采血等。本实施方案3是适合这样的利用注射器等添加被检查溶液的场合的生物传感器。
图7是显示本发明实施方案3的测定状态的模式图，在图中和图6相同的符号表示相同或相当的部分，12显示采血后的采血注射器的顶端附近。该图7显示在所述注射器采血后除去针头，由注射器12直接添加被检查溶液的状态。这里显示的除去针头的例子，不过即使是连接针头的状态也同样可以实施。
另外，具有细胞成分的被检查溶液作为检测物的场合，可以在间隙部1保持细胞收缩试剂，作为该细胞收缩试剂的一个例子使用氯化钾。细胞收缩试剂是一种在所述被检查溶液中含有细胞成分的场合应该设置的试剂，在使用不含细胞成分的被检查溶液的场合不特别需要。细胞收缩试剂只要具有使细胞收缩的效果就可以，氯化钾之外的无机盐、包括氯化钠、磷酸钠等盐的无机化合物，以及甘氨酸、谷氨酸等氨基酸，脯氨酸等亚氨酸，葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖类，山梨醇等的糖醇同样可以实施。含有这样的细胞成分收缩剂体系特别在将全血作为被检查溶液的情况有效。
根据需要也可以使可以使过碳酸钠作为具有漂白作用的试剂成分保持。在不能忽视被检查溶液具有的色素可以忽视对测定结果的影响的情况下，利用以全血检测物作为被检测溶液时有效。这里只要是使用过碳酸钠具有漂白作用的试剂，考虑过氧化氢、次氯酸钠等对反应的影响，可以自由选择。
在从注射器12直接将被检查溶液添加到生物传感器的操作中，只设有所述的实施方案1中说明的间隙部1的构成时，因生物传感器的间隙部1吸入的被检查溶液以外的被检查溶液附着在传感器外部，而污染外部的可能性高。另外由于间隙部1端部的被检查溶液相对的接触方法不完全等原因，测定时必要的足够量的被检查溶液没有被吸入时，可能得到错误的测定结果。在这种情况，对于使用者非常难于操作，而且所述被检查溶液为体液等情况下，在安全性或者卫生方面存在问题。而且得到缺乏正确性的结果。这里所述的安全性是指测定者因被检查溶液感染、附着等。
而本实施方案3中，通过设置在间隙部1的端部附近保持检测物的检测物保持部11，使用者添加被检查溶液到检测物保持部11上，由此可以使被检查溶液容易而且确实地保持在生物传感器上，可以测定被检查溶液。为此，在使用利用注射器进行采血而采取的被检查溶液进行测定的情况，不需要采血后将被检查溶液转移到其他的容器中的操作，或者采取的被检查溶液定量一定体积的操作，降低检测物对外部的污染，可以进行安全、卫生、迅速、简易的测定。
另外，通过将被检查溶液保持在检测物保持部11，可以确实地使被检查溶液接触间隙部1，可以使检查时充分量的被检查溶液吸入间隙部1。
另外利用间隙部1具有的吸入检测物的效果，不预先定量一定量的被检查溶液，即使是添加不确定量的被检查溶液之后的情况，也可以和添加一定体积的被检查溶液的情况一样进行高精度的测定。
而且用于形成间隙部1的空间形成材料18使用所述可以透光的材料，可以确认是否可以添加了测定时足够的被检查溶液。
另外在本实施方案3中对注射器采血进行了说明，在本发明中除注射器采血之外，也可以使用简易的移液管、巴斯德氏移液管等进行被检查溶液的测定，另外被检查溶液不限于全血，根据使用者的目的同样可以适用水溶液、尿、唾液、血清、血浆等，在这样的情况，也可以得到和所述实施方案3同样的效果。
另外，在本实施方案3中，间隙部1优选具有100μl以下的体积的结构。通过制成这样的结构，在难于得到所述被检查溶液的情况，以及使用极少量的被检查溶液进行测定的场合等、在被检查溶液为微小量的测定中，间隙部1具有被检查溶液可以足够地吸入的大小，同时形成具有容易测定的操作的大小，生物传感器的操作性高，可以对微少被检查溶液进行测定。
检测物保持部11做成可以保持比间隙部1的体积大的量的检测物，由此可以保持测定时必要的足够体积的被检查溶液，消除被检查溶液不足，可以进行正确性高的测定。另外再将检测物保持部11的体积做大，可以接纳相对测定必要量的超量的大量待测溶液，防止被检查溶液向外部飞散、污染，可以进行更安全、卫生的测定。这样为了在检测物保持部11上容许比间隙部大量的被检查溶液，检测物保持部11优选的构成为，如图7所示的生物传感器，由侧壁等包围，以使被检查溶液不向周围漏。
另外在本实施方案3中，以保持展开层2的基板17以及形成间隙部1的空间形成材料18的局部，构成检测物保持部11，在本发明中，对于实施方案1所示的生物传感器可以另外设置由和生物传感器使用着的部件不同的其他的部件构成的检测物保持部。另外作为检测物保持部只要是可以保持检测物，连接在间隙部1上的结构，可以设置任何结构的部件。
另外在本实施方案3中，检测物保持部11的底面做成保持展开层2的基板17的检测物保持区域17a，将设置在检测物保持区域17a周围附近的空间形成材料18做成防止检测物漏出的侧壁，在本发明中，优选做成使被检查溶液流入间隙部1的结构，做成相对间隙部1的底面，增加检测物保持部11的底面的高度的结构，使用于检测物保持部11的检测物添加到间隙部11的添加口的宽度足够窄，通过做成面向间隙部1的结构，被检查溶液容易流入所述间隙部，结果，可以进行更加准确地测定。
另外本发明中，在所述实施方案1至3说明的生物传感器中，也可以使包括试剂固定化部的试剂以及标记试剂的所有的试剂呈干燥状态。即使在这样的场合，也可以得到所述实施方案1至3同样的效果，同时试剂都是干燥状态，可以得到保存稳定性好，而且搬运自如的生物传感器。
另外，将和所述实施方案1至3所示的生物传感器同样的生物传感器做成免疫色谱法使用的生物传感器，由此在本发明中作为简易法市场不断广阔的免疫色谱法中，不用使用高精度进样器定量一定体积的所述被检查溶液，通过添加不确定的量的被检查溶液，可以利用所述间隙部定量正确的一定体积的被检查溶液，可以实现更高精度的测定。这里，免疫色谱法是使用可以湿润的多孔质材料，使其形成固定化试剂和标记试剂的复合物，由此进行测定的免疫测定法，是利用了抗原抗体反应的测定体系，相对于通常免疫测定法中B/F分离等必要的洗净操作，是通过被检查溶液浸透色谱法担体的过程，实现B/F分离的测定体系。通常所有的试剂处于干燥状态，在测定时通过被检查溶液湿润。作为标记物一般为金胶体、胶乳等，也使用磁性粒子、酶、金属胶体等。标记物为酶的场合等的，包含使用者作为测定操作添加酶底物以及反应中止试剂的操作。
另外，在本发明中，将所述实施方案1至3所示的生物传感器同样的生物传感器做成一步免疫色谱法使用的生物传感器，由此在作为简易免疫色谱法市场不断广阔的一步免疫色谱法中，不需要使用者预先定量被检查溶液的体积，通过在测定时可以确认被检查溶液量，降低误判断，可以实现正确性高而且已有的一步免疫色谱法具有的简易操作。所谓的一步免疫色谱法是使用可以润湿的多孔质材料，通过被检查溶液的添加而开始测定的免疫测定法，是利用了抗原抗体反应的测定体系，相对于通常的免疫测定法中，B/F分离等必要的洗净操作，一步免疫色谱法是通过被检查溶液浸透色谱法担体的过程，实现B/F分离的测定体系。通常所有的试剂处于干燥状态，在测定时利用被检查溶液湿润。由于使用者的基本的测定操作只是添加被检查溶液的操作，所以称为一步免疫色谱法。作为标记物一般使用金胶体、胶乳，也使用磁性粒子、酶、金属胶体等。
下面利用实施例更具体地说明本发明。另外本发明只要不超过其宗旨，不限于这些实施例。
实施例1尿hCG测定用试片的制作制造在硝化纤维素膜中含有抗hCG-β抗体固定化的线、以及抗hCG-α抗体和金胶体的复合物的宽带的免疫色谱法展开层2。利用空间形成材料8使该免疫色谱法展开层2，在被检查溶液添加部分形成间隙部1，制造免疫色谱试片。该试样具有如图1的结构。由图1可知，试样含有抗体固定化部5，与此相比被检查溶液更接触的一侧、含有抗hCG-α抗体和金胶体的复合物的标记试剂保持部4。这些试样按如下进行制造。
a)免疫色谱法展开层的配制首先准备以磷酸缓冲溶液稀释，调整好浓度的抗hCG-β抗体溶液，使用溶液流出装置将该抗体溶液涂敷在硝化纤维素膜上。这样可以在硝化纤维素膜上得到检测用的抗体固定化的线。将该硝化纤维素膜干燥后，浸渍在含有1％的脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中，缓慢地摇动30分钟。30分钟之后，将膜转移到Tris-HCl缓冲溶液槽中，缓慢振动10分钟，之后在另外的Tris-HCl缓冲溶液槽中再缓慢振动10分钟，洗净膜。进行2次如上的洗净操作之后，从洗净液中取出膜，在室温干燥。
利用0.01％氯金酸、在回流中的100℃的溶液中加入柠檬酸溶液配制金胶体。金胶体再连续回流30分钟之后冷却，利用0.2M的碳酸钾溶液调整为pH9。该金胶体溶液中加入hCG-α抗体，进行数分钟的搅拌，之后只添加10％BSA(牛血清白蛋白)溶液pH9使其最终为1％量，进行搅拌，配成抗体金胶体复合物(标记抗体)溶液。其后利用20000G50分钟的离心分离，单独分离标记抗体，将其悬浊于洗净缓冲液(1％BSA磷酸缓冲液)中，之后进行离心分离，分离洗净标记抗体。用洗净缓冲溶液悬浊该标记抗体，用0.8μm的过滤器进行过滤，配成最初的金胶体溶液量的10分之一，在4℃储藏。
然后，将这样配制的标记抗体溶液放置在溶液流出装置上，涂敷在与抗hCG-β抗体固定化干燥膜上的抗体固定化位置分离的位置上，之后使膜干燥。这样在固定化膜上可以得到标记抗体保持部位。这样可以完成免疫色谱法反应层、即展开层。
b)免疫色谱法试片的制作在厚度为0.5mm的白色PET制成的基板上粘贴如上所述制成的疫色谱法展开层，以2.5mm的宽度切断。切断后，将免疫色谱法的各片从标记抗体保持部分到终端部分，卷起厚度为100μm的透明带。在没有卷起的透明带的始端部分的中央，粘贴厚度100μm的透明PET层叠制成的预先具有空气孔的空间形成材料，形成间隙部(宽2.0mm×长6.0mm×高0.5mm)。这样制成免疫色谱法试片。
c)试液的配制通过在人尿中添加已知浓度的hCG溶液，配制成各种已知浓度的hCG溶液。
d)测定将浓度配制好的含有hCG的尿15μl滴至PET基板上，在PET基板上形成液滴。将形成的液滴接触免疫色谱法试件的间隙部，使其导入间隙部中。导入的液滴沿吸水层方向展开处理，使其进行抗原抗体反应，进行固定化部上的显色反应。这里使用反射型分光光度计(CS9300；岛津制作所制)测定在向该试件件中添加试样5分钟之后的显色状况，计算处理显色度。
首先在免疫色谱试件上添加含有hCG浓度各为100、1000、10000U/l的hCG的尿，进行展开处理。然后，使用反射型分光光度计测定各hCG的尿对应的试件上的抗体固定化部的显色状况。利用反射型分光光度计测定520nm的波长的吸光度，带入预先做成的显示hCG浓度和吸光度的关系的检测线，结果示于图5。
图5显示将液体试样添加到免疫色谱法试片上，开始添加5分钟之后的显色程度的测定值为基础，将分析对象物的浓度进行换算的结果。结果显示，利用各浓度n＝10进行测定，CV值为5％～10％，具有非常好的相关性。
实施例2全血CRP定量用试片的制作制造在硝化纤维素膜中含有固定化抗CRP抗体A的试剂固定化部、以及保持抗CRP抗体B和金胶体的复合物的标记试剂的免疫色谱法试片。该免疫色谱法试片具有如图6所示的生物传感器一样的结构，该免疫色谱法试片包括在比抗体被固定化的试剂固定化部5更接近添加被检查溶液的展开开始点的部分的、含有抗CRP抗体B和金胶体的复合物的区域的标记试剂4和检测物保持部11。该免疫色谱试片进行如下制造。
a)免疫色谱法试片的制备准备以磷酸缓冲溶液稀释，调整好浓度的抗CRP抗体A溶液。使用溶液流出装置将该抗体溶液涂敷在硝化纤维素膜上。这样可以在硝化纤维素膜上得到试剂固定化部的抗体固定化的线。将该硝化纤维素膜干燥后，浸渍在含有1％的脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中，缓慢地摇动30分钟。30分钟之后，将膜转移到Tris-HCl缓冲溶液槽中，缓慢振动10分钟，之后在另外的Tris-HCl缓冲溶液槽中再缓慢振动10分钟，洗净膜。进行2次如上的洗净操作之后，从液槽中取出膜，在室温干燥。
利用0.01％氯金酸、在回流中的100℃的溶液中加入柠檬酸溶液配制金胶体。再连续回流30分钟之后冷却，利用0.2M的碳酸钾溶液，在调整为pH9的所述金胶体溶液中加入抗CRP抗体B进行数分钟的搅拌，之后只添加10％BSA(牛血清白蛋白)溶液pH9使其最终为1％量，进行搅拌，配成检测物质的抗体-金胶体复合物(标记抗体)。其后利用20000 G50分钟的离心分离所述标记抗体溶液，分离洗净标记抗体，将其悬浊于洗净缓冲液(1％BSA磷酸缓冲液)中，之后进行离心分离，分离洗净分离标记抗体。用洗净缓冲溶液悬浊该标记抗体，用0.8μm的过滤器进行过滤，之后配成最初的金胶体溶液量的10分之一，在4℃储藏。
将所述金胶体标记抗体溶液放置在溶液流出装置上，涂敷，呈从抗CRP抗体固定化A干燥膜上的固定化的线分开、由被检查溶液添加开始方向依次为标记抗体、固定化的线的位置关系，之后使膜进行真空冻结干燥。这样可以得到固定化膜上具有标记试剂的反应层担体。
然后，将配制好的含有标记试剂的反应层担体粘贴在厚度为0.5mm的白色PET组成的基板上，以5.0mm的宽度切断。切断后，将各片从标记抗体保持部分到终端部分，卷起厚度为100μm的透明带。在没有卷起的透明带的始端部分的中央，粘贴厚度100μm的透明PET层叠制成的预先具有空气孔的空间形成材料，形成间隙部(宽5.0mm×长12.0mm×高0.5mm)。在空间形成材料上形成着预先防止检测物保持部的液漏的壁。而且，所述空间形成材料是如下制成的，在每单位面积上点着2μl预先配成1.5M的氯化钾水溶液，之后利用液氮立即冷冻，进行冷冻干燥，由此制造具有氯化钾以干燥状态保持的收缩剂保持部的空间形成材料。这样制造免疫色谱法试片。
b)试样的配制将添加EDTA.2K作为抗凝固剂的人血液配制成血细胞比容值为45％。通过在该血液中添加已知浓度的CRP溶液，配制成各种含有已知浓度CRP的血液。
c)试片上的显色程度的测定使用所述配制好的全血，考虑实际的采血状况，使其填充20ml体积用的注射器，不用测定一定体积的含有CRP的全血，适量地添加到检测物保持部。添加之后，被检查溶液被吸入间隙部。再向吸水部方向展开处理，使其进行抗原抗体反应，进行抗体固定化部的显色反应。向该生物传感器上添加试样5分钟之后，利用反射吸光度测定仪测定其显色状况。
作为血浆浓度含有0.1mg/dl、1.0mg/dl、3.0mg/dl的全血由所述20ml注射器直接适量添加到生物传感器上，进行展开处理。各CRP浓度的血液对应的生物传感器上的试剂固定化部分的显色状况利用(CS-9300；岛津制作所制)测定。测定635nm的波长的吸光度，根据个CRP浓度作图。将该图示于图8。图8是显示本实施例2的多浓度测定结果的图。横轴显示使用市售的测定装置测定的CRP浓度。这里市售测定装置使用胶乳免疫凝集法的试剂。另外纵轴显示得到的吸光度。所谓检测线是指在相对CRP浓度上升吸光度上升的区域，通常预先利用已知浓度的被检查溶液进行计算，然后测定位置被检查溶液之后，从得到的吸光度可以计算该未知被检查溶液中的CRP浓度的计算式。如图8所示，与所述的实施例1同样可以得到良好的结果。
另外，在本实施例2中的生物器件使用硝化纤维素以及玻璃纤维滤纸这样的由任意的多孔质性担体构成的色谱法材料组成的生物传感器。这样材料构成的生物传感器使用例如抗原抗体反应类的任意测定原理，具有分析检出某种特定物质，进行定性或定量的功能。
在本实施例2中，使用在同一硝化纤维素膜上设有标记试剂和试剂固定化部的生物传感器，以在和硝化纤维素不同的材料例如无纺布类的多孔质性担体上担持标记试剂的作为标记试剂，即使放在支撑体上也没有任何问题。构成标记试剂的标记物使用金胶体已有实例，也可以是着色物质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原物质、酶、核酸、内质网，只要是在反应前后产生某些变化的物质都可以使用。
作为测定的被检查溶液例如有水或水溶液、尿、血液、血浆、血清、唾液等体液，固体以及粉体或使气体溶解的液体等，其用途为尿检查及妊娠检查、水质检查、便检查、土壤分析、食品分析等。另外被检物质C反应性蛋白质(CRP)已有实例叙述，另外还有抗体、免疫球蛋白、激素、酶以及肽等蛋白质以及蛋白质衍生物以及细菌、病毒、真菌类、支原体、寄生虫以及这些产物及其成分等的感染性物质、治疗药以及乱用药等的药物以及肿瘤标记。具体的即使是绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体激素(LH)、甲状腺刺激激素、滤胞形成激素、甲状亲腺刺激激素、肾上腺皮质刺激激素、雌二醇、前列腺特异性抗原、乙型肝炎表面抗原、肌红蛋白、CRP、心肌肌钙蛋白、HbAlc/蛋白质等也没有问题。另外，也可以用在水质检查、土壤分析等环境分析、以及食品分析等方面。根据如前所述的形态，可以实现简便快速、高灵敏度高性能、高正确性的测定。
产业上利用的可能性如上所述，本发明涉及的生物传感器作为一种在免疫色谱法、即一步免疫色谱法等中使用的生物传感器是有用的，特别适合作为用于面向医疗诊断现场以及一般家庭等的操作简便化以及迅速化所要求的状况下测定的生物传感器，以及用于微量体积的被检查溶液的测定的生物传感器。
权利要求
1.一种生物传感器，在展开被检查溶液的展开层的局部上，具有被固定化的试剂固定化部，和保持可以利用所述被检查溶液的展开而溶出的标记试剂的标记试剂保持部，通过测定所述试剂固定化部分上的所述标记试剂的结合量，定性或定量所述被检查溶液中的测定成分，其特征为，具有空间形成部，由所述被检查溶液流入的空间的间隙部在与所述展开层的之间形成。
2.一种生物传感器，在展开被检查溶液的展开层的局部上，具有被固定化的试剂固定化部，通过测定该试剂固定化部分上的标记试剂的结合量，定性或定量所述被检查溶液中的测定成分，其特征为，具有空间形成部，由所述被检查溶液流入的空间的间隙部在与所述展开层的之间形成，同时在所述间隙部中设有保持可以利用所述被检查溶液的流入而溶解的标记试剂的标记试剂保持部。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述间隙部临时地保持被检查溶液。
4.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述间隙部通过该间隙部的体积确定被检查溶液的流入量。
5.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述间隙部具有流入展开所述展开层的足够的被检查溶液的体积。
6.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，在所述间隙部中设有破坏细胞成分的细胞成分破坏试剂部。
7.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，在所述间隙部中设有收缩细胞成分的细胞成分收缩试剂部。
8.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，在所述间隙部中设有漂白试剂部。
9.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述间隙部具有20μl(微升)以下的体积。
10.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述间隙部具有确认从外部流入被检查溶液的方法。
11.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述空间形成部其局部或全部具有光透过性。
12.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，在所述间隙部中设有分离测定时不需要的有形成分的分离部。
13.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，具有接触所述间隙部、保持被检查溶液的检测物保持部。
14.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述检测物保持部可以保持比所述间隙部的体积大的被检查溶液量。
15.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述检测物保持部的底面高度的位置处于相对所述间隙部内的底面的高度位置的相同或高处的位置。
16.如权利要求13所述的生物传感器，其中，在所述间隙部具有100μl以下的体积。
17.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，在所述间隙部设有帮助流入被检测溶液的空气孔。
18.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，在所述间隙部设有利用被检测溶液的浸透可以湿润的多孔质材料。
19.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，包括所述试剂固定化部的试剂以及所述标记试剂的所有的试剂为干燥状态，同时其整体为干燥状态。
20.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述生物传感器用于免疫色谱法。
21.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述生物传感器用于一步免疫色谱法。
全文摘要
设有展开被检查溶液的展开层(2),在该展开层(2)的局部上,具有使所述检查溶液中的测定对象物对应的抗体固定化的试剂固定化部(5),和保持以干燥状态标记,可以利用所述被检查溶液的展开溶出的抗体的试剂保持部(4),通过测定所述试剂固定化部分(5)上结合的标记试剂的结合量,定性或定量所述被检查溶液中的测定成分。在该生物传感器中,设有所述被检查溶液流入的空间的间隙部(1),和展开被检查溶液的展开层(2)之间形成的空间形成部(8)。这样的生物传感器不需要高度的装置或操作,即使对于微量体积的被检查溶液也可以进行简易而且高精度的测定。
文档编号G01N33/558GK1380976SQ01801437
公开日2002年11月20日 申请日期2001年5月25日 优先权日2000年5月26日
发明者滩冈正刚, 高桥三枝, 田中宏桥, 北胁文久 申请人:松下电器产业株式会社