专利名称：农药速灭威残留量检测方法
技术领域：
本发明农药速灭威残留量ELISA检测方法，属于生物技术领域。专用于农产品和农业生产环境中速灭威(metolcarb)农药残留量的高灵敏度快速检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。
背景技术：
速灭威(metolcarb)属于氨基甲酸酯类化学杀虫剂，是我国大吨位生产的农药品种之一。速灭威制剂毒性中等，主要用于防治棉花、水稻、茶树、柑橘等作物的害虫，具有杀虫谱广、残效长、杀死率高等特点。目前国内许有厂家进行原药或其复配制剂的大规模生产并得到很好的推广。
自20世纪70年代以来，由于有机氯农药受到禁用或限用，以及抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增多，现在国家已经对一些高毒性如克百威等农药进行禁用，因而速灭威等氨基甲酸酯类农药的用量必然逐年增加，这就使得这类农药残留量的检测倍受关注。速灭威虽然相对已经被禁用的农药来说优点明显，但速灭威的大量使用及其具有的残留期较长、毒性较高等特点，都使得速灭威残留量的检测监控显得十分迫切和必要。
文献报道的对速灭威有效成分检测方法有分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析法等。但只靠这些常规的检测方法已经越来越不能满足农药残留大批量、快速检测工作的需求。
1971年Ercegovich等首次用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对DDT和马拉硫磷进行了残留分析，这是免疫化学技术首次用于农药残留分析。20世纪80年代后，免疫化学分析技术已成为优先研究、开发和利用的农药残留快速检测技术，美国化学学会将免疫分析方法与GC、HPLC方法一起列为化学农药残留分析的三大支柱技术，是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技术。利用ELISA(酶联免疫吸附分析)方法不仅可以定性而且可以定量检测样品中的农药残留，这种分析方法对仪器设备要求不高，快速简便，一般无需对样品进行复杂的预处理，灵敏度高，特异性强。而且价格便宜，易于标准化、自动化和适于大容量样本分析等优点。已有文献报道了60多种杀菌剂、杀虫剂、除草剂等的ELISA检测方法的建立，其检测水平可达纳克(ng)甚至皮克(pg)。国外一些公司已开发出商品化的农药残留检测试剂盒，如Immunosystems Inc.的Res-I-Mune试剂盒，NeoGen公司的Agriscreen Tickets试剂盒，Millipore公司的EnviroGard试剂盒，Environmental Diagnostics公司的EZ-Screen试剂盒等。我国在这方面起步较晚，只是90年代后才有越来越多的单位和研究人员重视并从事农药免疫速测技术研究，如刘曙照等已经先后报道了氨基甲酸酯类杀虫剂克百威和甲萘威的免疫检测技术研究等等。
氨基甲酸酯类杀虫剂免疫速测方法国外报道的除了克百威和甲萘威外，1998年，Antonio Abad等人制备出了甲硫威(methiocarb)抗原与单克隆抗体并建立甲硫威ELISA检测方法；2001年，Maria J.Moreno等人报道了识别残杀威(propoxur)的单克隆抗体的制备并建立了残杀威ELISA检测方法。2003年，刘凤权、张奇等率先合成了速灭威人工抗原并在中国申报了速灭威人工抗原合成方法的专利，但速灭威ELISA检测方法目前在国内外还未见报道。
发明内容技术问题 现有的速灭威检测方法要么操作较复杂、检测费用较高、检测效率低下，要么检测准确性不高、灵敏度较低、检测极限不足，本发明的目的是为速灭威农药残留找到一种既快速准确又简单低廉的超微量检测方法。提供速灭威ELISA检测方法，对速灭威农药的残留量进行检测，准确度高、灵敏度高、检测极限低、简单、快速、低廉。
技术方案本发明农药速灭威残留量ELISA检测方法，包括1)速灭威多克隆抗体制备采用速灭威人工抗原的免疫原HOM-BSA，常规免疫方法免疫新西兰白兔，制备得到抗速灭威的兔多克隆抗体抗血清；2)包被采用速灭威人工抗原的包被抗原HOM-OVA 0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；3)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μl，37℃反应2小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；4)加抗体及抗体与待测样品的混合液用稀释10000倍的速灭威抗血清与待测样品和空白抗原抗体反应基质PBST液等体积充分混合，后以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；5)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的常规洗涤缓冲液PBST将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μl，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；6)显色
TMB底物溶液50μl/孔，37℃显色反应10分钟7)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，50μl/孔终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B；8)数据处理计算出结合率B/Bo及Logit(B/Bo)，Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C为微量分析板孔中测得的速灭威浓度，通过公式1和公式2可以求得；X＝n·2C，n为反应前样品被稀释的倍数 公式3待测样品中以浓度X表示的速灭威残留量可通过公式3求得。
上述农药速灭威残留量ELISA检测方法中，抗原抗体反应基质PBST中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为3.2mol/L，微量分析板中每孔50μl。
有益效果本发明与现有速灭威检测技术相比，其优点和积极效果表现在(1)实用性好传统的农药分析主要在实验室进行，其前处理过程烦琐，分析速度慢、成本高，使用的大量有机溶剂易造成环境污染，且对实验室的仪器化程度和人员素质要求较高，不能满足农产品贸易对快速、简便、准确、大量检测的需求。而我们提供的速灭威ELISA检测方法具有操作简单、快速(以封闭好的微量分析板做检测只需要2～3小时即可)、分析成本低、分析容量大、安全可靠等优点，一般不需贵重仪器，可大量简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广，特别适用于大批量样本检测和现场监测。
(2)准确性高与我国目前市场上常用的快速检测方法速测灵、速测卡、速测仪等检测方法相比，速灭威ELISA检测方法准确度较高，重复性较好(平均变异系数低于5％)，速灭威抗体特异性识别速灭威农药，对其他农药几乎不识别。
(3)灵敏性高检测极限远低于其他常规方法，已经达到0.013ppb，可以精确检测到10-9(1ppb)，远低于国家要求的10-7(100ppb)的检测要求。检测曲线的斜率在1左右，较为合理。
(4)检测范围宽适宜的检测范围为1～10000ppb
具体实施例方式
速灭威抗原(免疫原HOM-BSA和包被抗原HOM-OVA)的合成方法为1)间-甲基苯氧甲酰氯(分子式C8H7O2Cl，结构式 的合成称取双光气28g，小心加入0.135g活性碳，36℃水浴加热，用51.5g甲苯收集光气，甲苯液在23℃水浴中磁力搅拌，尾气通入碱液(注意光气剧毒，且气味难闻，应在通风橱中进行)。至双光气反应完，甲苯相增重16.5g，得24％光气/甲苯溶液。称取间-甲基苯酚7.7g，溶进100ml 10％的NaOH水溶液，40℃水浴加热磁力搅拌1小时，冷却到室温后缓慢加入上光气/甲苯溶液，40分钟加完，开始计时，4小时后结束反应。取有机相减压蒸馏得9.012g黄色油状物。GC法测定目标物的含量，5℃冰箱存放备用。
2)β-(间-甲基苯氧甲酰)氨基丙酸(HOM)(分子式C11H13O4N，结构式 的合成称取间-甲基苯氧甲酰氯3.275g(约12.1mmol)，溶进4ml 4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得A液；称取β-丙胺酸1.989g(约22.3mmol)，溶进4ml 4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得B液；另取3ml 4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷却，得C液。将A液与C液均分成5等份，每间隔5～10分钟向B液中同时各加入1份，整个反应置冰水中，磁力搅拌下进行。加样全部完成开始记时，2小时后结束反应。用浓盐酸调节反应终液的pH值为4，目标产物用乙酸乙酯(3个50ml份)抽提；乙酸乙酯相用稀HCl洗涤数次，用1MNaHCO3溶液(2个50ml份)抽提；水相再用浓盐酸酸化，乙酸乙酯再抽提；无水Na2SO4干燥，所得物减压蒸馏浓缩至13.8ml，向浓缩液中逐渐加入31ml正己烷，白色结晶物析出，过滤。结晶物经低温干燥得3.898g；再经过甲苯与去离子水5℃下洗涤，低温干燥后称重得到H速较纯品1.871g，回收率为48％。
3)速灭威人工抗原(HOM-OVA、HOM-BSA)的合成称取H速结晶物223mg和NHS 130mg，用1000μl DMF溶解于反应装置中；称取300mg DCC，用500μlDMF溶解；将DCC/DMF溶液滴加到上反应装置中。反应在磁力搅拌下室内温度进行7小时(过夜)。反应终液置5℃冰箱冷却2小时以上，经1.2万rpm离心5分钟，取上清活泼酯液并将其均分为2等份，分别缓慢滴加到2.5ml 12mg/ml的BSA溶液与2.5ml 12mg/ml的OVA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M pH8.0的PB液。反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时(从加样结束开始记时)。将反应液置透析袋内，于0.2M pH6.8的PB中4℃搅拌透析，每4小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后将透析袋中的白色乳状液装于若干1ml离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。所合成的速灭威人工抗原(HOM-OVA、HOM-BSA)保存期限为3年。
实施例1河水样品中检测速灭威残留量速灭威ELISA反应体系主要条件HOM-OVA包被物0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，速灭威抗血清稀释20000倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应基质(PBST)中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为3.2mol/L，微量分析板中每孔50μl。待测样品准备河水样品量取河水1L，加入速灭威净重50μg，配制成50ppb的液体样品。采用速灭威ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下1)包被HOM-OVA作为包被物，0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；2)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μl，37℃反应2小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；3)加抗体及抗体与待测样品的混合液取待测样品200μl加到800μl反应基质中配制成待测液，稀释10000倍的速灭威抗血清与待测液和空白基质液等体积充分混合，后以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；4)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的PBST缓冲液液将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μl，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干。
5)显色TMB底物溶液50μl/孔，37℃显色反应10分钟6)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，50μl/孔终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照，Bo＝0.798，待测样品吸光值B＝0.561。
7)数据处理计算出结合率B/Bo＝70.3％，代入公式1Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1得到Logit(B/Bo)＝0.861代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C为微量分析板孔中测得的速灭威浓度，求得C＝4.95ppb。待测样品中速灭威残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得X＝5×2C 公式3求得待测样本浓度X＝49.5ppb，结果与实际浓度相当。
实施例2土壤样品中检测速灭威残留量速灭威ELISA反应体系主要条件同实施例1。
待测样品准备土壤样品称取1kg田间自然土壤，加入速灭威净重500μg，配制成500ppb的固体样品。
采用速灭威ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下步骤1)、2)同实施例1。
3)加抗体及抗体与待测样品的混合液称取待测样品0.1g，用0.2ml甲醇浸泡1小时左右，取100μl加到900μl反应基质中配制成待测液，稀释10000倍的速灭威抗血清与待测液和空白基质液等体积充分混合，后以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；步骤4)、5)、6)同实施例1；7)数据处理计算出结合率B/Bo＝63.0％，代入公式1Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1得到Logit(B/Bo)＝0.533代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C为微量分析板孔中测得的速灭威浓度，求得C＝11.05ppb。待测样品中速灭威残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得X＝20×2C 公式3求得待测样本浓度X＝442ppb，与实际浓度基本接近。
权利要求
1.农药速灭威残留量ELISA检测方法，包括1)速灭威多克隆抗体制备采用速灭威人工抗原的免疫原HOM-BSA，常规免疫方法免疫新西兰白兔，制备得到抗速灭威的兔多克隆抗体抗血清；2)包被采用速灭威人工抗原的包被抗原HOM-OVA 0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；3)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μl，37℃反应2小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；4)加抗体及抗体与待测样品的混合液用稀释10000倍的速灭威抗血清与待测样品和空白抗原抗体反应基质PBST液等体积充分混合，后以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；5)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的常规洗涤缓冲液PBST将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μl，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液PBST洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；6)显色TMB底物溶液50μl/孔，37℃显色反应10分钟7)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，50μl/孔终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B；8)数据处理计算出结合率B/Bo及Logit(B/Bo)，Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C为微量分析板孔中测得的速灭威浓度，通过公式1和公式2可以求得；X＝n·2C，n为反应前样品被稀释的倍数公式3待测样品中以浓度X表示的速灭威残留量可通过公式3求得。
2.根据权利要求1所述的农药速灭威残留量ELISA检测方法，其特征在于，抗原抗体反应基质PBST中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为3.2mol/L，微量分析板中每孔50μl。
全文摘要
本发明速灭威(metolcarb)ELISA检测方法属于农药残留分析及农产品安全检测范畴。检测方程为Logit(B/Bo)=－0.9404LogC+1.5146(其中B为样品孔吸光值，Bo为阳性对照吸光值，C为板孔中测出的速灭威浓度)，检测条件为速灭威包被抗原HOM－OVA 0.6μg/ml在微量分析板中每孔加 50μl，速灭威抗血清稀释20000倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应基质(PBST)中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为3.2mol/L，本方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为速灭威超微量检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。
文档编号G01N21/31GK1609618SQ200410065318
公开日2005年4月27日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者刘凤权, 胡白石, 张奇, 徐丽娜, 姜英华 申请人:南京农业大学