专利名称：光激发彩色表面等离子体共振成像仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及表面等离子体共振、彩色成像原理，属表面动态监测和二维点阵芯片成像技术，具体地说涉及一种光激发彩色表面等离子体共振成像仪。
背景技术：
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance)简称SPR，是一种物理光学现象。当一束平面p-偏振光透过高折射率玻璃介质入射到与其紧密连接的金属膜和低折射率介质的界面时，在入射角或波长为某一合适值的条件下，表面等离子体与入射光消失波的频率和波数相同，二者将发生共振，入射光被吸收，反射光能量急剧下降，反射光强度达到最低值。这时的入射角、入射波长分别被称为共振角和共振波长。由于共振角或共振波长对紧靠在金属薄膜表面的介质(样品)折射率的变化非常敏感，基于这一原理，根据样品折射率性质的不同，可以实现对样品的实时和无损的光检测。由于SPR技术具有实时监测反应动态过程、分析样品不需要纯化、生物样品无需标记、灵敏度较高、无背景干扰等特点，在生物科学领域应用中具有无可比拟的优势。
随着生物技术的飞速发展，特别是人类基因组和蛋白质组计划的实施，大量的生物信息需要高通量且能够实时监测的分析技术来进行检测。为了提高分析通量和分析速度，国际和国内将SPR的优势和微阵列高通量技术有机结合起来，开展了基于SPR原理的成像研究，即SPR成像，目前已有专利报道。通过制作微通道和微阵列结构的芯片，使样品分析能力和速度都大大提高。然而当前SPR成像仪仅监测单波长反射光强度的变化(灰度值)，或简称单波长黑白SPRI。该方法简单，但只有角度调节一种模式。对于多波长和波段用于SPR成像，仅有一篇文献，是关于超薄有机固体膜性质的研究，且只简单涉及到定性分析。到目前为止，尚未见有任何专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种表面等离子体共振成像检测仪，改单波长SPR成像为多波长和波段SPR成像，以获取并提供更丰富的样品实验信息，同时使实验结果更易分析判断、实验检测更加人性化。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是以波长询测表面等离子体共振原理为基础，结合彩色图像记录技术，构建表面彩色信号产生、记录、存储、处理和再现的系统。据此设计研制了一种多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪，采用角度-波长共轭双调方法增加仪器的可优化参数，实现了不同性质的样品成像后色彩的变化，使得反应信息更为丰富。仪器主要由光源、入射光角度调制系统、样品分析系统、温控系统、检测系统、数据采集管理系统组成。
详细地说，本发明提供的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，主要由光源、入射光角度调制系统、样品分析系统、温控系统、检测系统、数据采集管理系统组成；其中一样品分析系统，其两侧分别设置一连续波入射光和一反射光检测器；该反射光检测器连接一数据采集管理系统；样品分析系统中样品池两侧设有样品进样管路和出样管路，一微量泵通过进样管路和样品池相通控制进样的流速和流量；样品池两端固定在一水平台上，池体朝下，与传感膜的膜表面用垫圈密封，传感膜底面与一棱镜背面粘连；传感膜的表面具有自由电子层的高电导物质；连续波入射光照射通过棱镜激发传感膜表面等离子体而产生共振，直接导致反射光的色彩发生变化。从棱镜射出的反射光进入检测系统，并由电信号传输到数据采集管理系统进行数据处理，实现定性定量分析。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中入射光经过一入射光角度调节系统射入样品分析系统，该入射光调节系统为一光学反射镜固定在一角度可调的反射镜支架上。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中入射光为卤钨灯、氙灯、能斯特灯、硅碳棒灯或发光二极管发出的白光或复色光，经过一光束扩展器或光束压缩器进行调制。如果入射光为非偏振光，需在光束扩展器或光束压缩器前加设p-型偏振光起偏器。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中棱镜为无机光学玻璃、化学合成光学树脂塑料或具透光性液体材料制成。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中反射光检测器为彩色CCD(电荷耦合器)、彩色CMOS(互补型金属氧化物半导体)图像传感器、电荷注入检测器、光电倍增管或照相机。作为反射光纠偏器的透镜与其同光轴地固定在一旋转支架上，组成检测系统，以对反射光进行校正和调焦。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中样品分析系统中的样品池的池体上方与一温控系统的散热管路相连接，该散热管路连接一冷却液容器，该冷却液容器连接一温控调节器的温控电路。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中传感膜为金膜、银膜或铝膜，厚度为10-200nm。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中数据采集管理系统用于完成信号的监测与存储、数据的分析处理及实验结果输出等任务。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中检测器前任何位置配置单色器或利用单色光电转换器，即可转换成黑白表面等离子体共振成像仪。
所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中检测器前任何位置配置色散系统，即可换成波长询测的表面等离子体共振光谱仪。
本发明的具有以下创新性将图像色彩(真彩而不是伪彩)的动态变化用于表面等离子体共振成像的实时监测和定性、定量分析，使得实验的信息更加丰富化，使仪器的使用更加人性化，这是本发明仪器构建的最主要的优点和创新点。
本发明的多功能性a、成像色彩随样品性质的变化而变化，用彩色的变化来替代单一色彩灰度值的变化，增强了实验图像的对比度和可分辨性；b、采用角度-波长共轭双调方法实现实验条件的最佳化；c、可以根据实验需要选择成像方案和图像控制，实现图像局部或整体信息的最优化；d、可以制作成生物和化学探针，进行多种样品的高通量、平行动态分析，发展成为光学生物芯片技术；e、可以实现彩色图像和谱线的相互转换，也可以把图像信息转化为具体数值，进行定性和定量分析；f、检测的领域宽，对象广。适用于生物学、临床医学、药物、化学和物理等领域的检测；分析的对象从蛋白、核苷酸、DNA、RNA糖、脂类到无机离子、噬菌体、病毒颗粒、细胞等体系；能够做到实时动态监测和无损检测，还可进行定性和定量分析；且实验现象非常明显，使用简单，实验结果准确易懂。能够为功能基因研究和蛋白质组研究提供一种高通量、非标记的检测技术平台。
本发明的结构灵活可变a、光源系统可选择性强。可采用白光、或多波长发光二极管等复色光光源，且偏振和非偏振光都可使用；b、采用光学元件和机械结构精密调节优化，精确控制入射光的角度和检测系统的角度，可以减少成像的畸变和保持图像的清晰度；c、传感膜可以采用多种方法制备和表面构筑；d、样品池结构简单，容易制作。可设计制作成多通道，用作参比和平行比较分析；
e、整个仪器系统的可扩展性强。通过改装部分元件，可以转换为单波长表面等离子体共振成像系统和表面等离子体共振光谱仪。
图1为本发明的结构示意图。
图2和图3分别为图1中光源A的示意图；图4为图1中入射光角度调节系统B的示意图；图5为图1中样品分析系统C、温控系统D的示意图；图6为图1中检测系统E的示意图；图7为本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪的图像编辑处理和数据分析软件流程示意图；图8为本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪的控制系统程序流程示意图；图9为本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪的软件流程图；图10为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪测定的免疫球蛋白G微阵列的彩色成像图；图11为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪测定的胰岛素微阵列在水溶液中的彩色成像图；图12为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪测定的免疫球蛋白G微阵列在的彩色成像图通过自编制软件转化为的线性谱线图；图13为本发明仪器测定抗原(人免疫球蛋白G)抗体(羊抗人免疫球蛋白G和兔抗人免疫球蛋白G)相互作用的波长询测的表面等离子体共振谱线图。
具体实施例方式
本发明的光激发彩色表面等离子体共振成像仪基本构造为在一平台上，设置样品分析系统；在样品分析系统的左侧和右侧，分别独立设置入射光角度调制系统和检测系统；在样品分析系统的样品池附近连接设置温控系统；在入射光角度调制系统的后方独立设置光源；在检测系统的右侧电连接数据采集管理系统。仪器各系统均为模块化设计，除了数据采集管理系统，其它部分置于一外壳内。光路结构为光源发出的光线投射到入射光角度调制系统的光学反射镜上，经角度调制后光线穿透样品分析系统中的高折射透光性介质照射到传感膜表面，在传感膜表面发生全反射，反射后的光线穿透高折射透光性介质最后进入检测系统。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的彩色图像，是仪器实时检测到的样品的真彩图像，而非经任何技术手段(包括计算机软件)处理后得到的伪彩图像。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，在检测器之前任何可能位置加单色器，或利用单色光电转换器、即可转换成黑白表面等离子体共振成像仪。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，在检测器之前任何可能位置配置色散系统，即可换成波长询测的表面等离子体共振光谱仪。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的光源，典型光源为平行光、点状或球状光源可通过光束扩展(或压缩)器或类似光学系统进行调制。对于非偏振光，需加p-型偏振光起偏器。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的光源，包括卤钨灯、氙灯、能斯特灯、硅碳棒灯和发光二极管等任何复色光光源。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述偏振光起偏器包括聚合物偏振片、双折射偏振棱镜或波片堆偏振器等。偏振器可置于检测器之前的任何可能位置。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述入射光角度调节系统，由光学反射镜和角度调节器组成。其中光学反射镜与角度调节器的旋转轴心连接。角度调节器可联动光学反射镜的角度旋转，从而实现入射光角度的精细调节。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述入射光的角度，可由入射光角度调节系统精确调节，方式包括自动、半自动和手动等形式。角度的选择范围可以根据实验需要进行设定，角度调节分辨率由角度调节器决定。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的温控系统，由冷却液、散热管、温度传感器、和温控电路组成。冷却液流经样品池内部，样品分析系统的温度由冷却液精确调节和控制。既可实现恒温，也可以程序升温。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的样品分析系统，由样品输送和电磁波耦合传感器两部分组成。
其中样品输送部分由样品流路系统和微量泵组成。样品进样管路和出样管路分别位于样品池的两侧，且与样品池池体的两端相通。微量泵通过进样管路和样品池相通，通过设定调节微量泵的压力指示表，可以控制进样的流速和流量。进样和流路清洗可以手动控制，也可自动、半自动控制。
其中电磁波耦合传感器部分，由样品池、传感膜、高折射透光性介质和定位卡组成。样品池两端被固定在一水平台上，池体朝下，与传感膜的膜表面用垫圈密封。传感膜底面与高折射透光性材料介质用液体粘连。定位卡用来固定高折射透光性高折射透光性介质。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的高折射透光性介质的材料，包括无机光学玻璃和化学合成光学树脂以及高介质透光性液体等材料。其所述的样品池可以用聚四氟乙烯、硅橡胶等生化惰性材料制作。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的传感膜是表面有自由电子层的高电导物质，包括金膜、银膜、铝膜等金属膜。
传感膜可以通过真空喷镀、电镀和化学镀膜等方法制备，厚度在10-200nm以内。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的传感膜可以通过化学或生物修饰构筑微阵列探针，形成生物芯片。用于各种靶标分子的识别、检测、高通量筛选和平行分析。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的检测系统由反射光纠偏器、检测器、角度调节器组成。反射光纠偏器和检测器机械连接在同一水平位置，并通过接杆置于角度调节器之上。角度调节器可实现检测系统角度的精确调节，既可以手动调节，也可以自动、半自动调节。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的反射光纠偏器，能对反射光进行校正和光学调焦，使其清晰成像在检测器的焦面上。其所述的检测器，可以是对多波长光有响应并能够实现动态彩色成像的传感器或图像检测记录仪，包括彩色CCD、彩色CMOS、电荷注入检测器、光电倍增管、照相系统等。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的入射光角度系统的角度调节器和检测系统的角度调节，可以同步控制，也可以各自独立调节。
本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其所述的数据采集管理系统，用于完成信号的监测与存储、数据的采集与分析处理及实验结果输出等任务。由计算机、图像采集卡、图像编辑处理和数据分析软件组成。其中，图像采集卡进行图像的实时采集、显示、储存和输出。图像编辑处理和数据分析软件对图像进行离线分析，能够提供整体、局部图像采集的随意选择和实时优化功能，可以进行二维图像中的信号比较以及图像和谱线的转换，实现图像的功能优化调控以及根据图像信号的变化实时监测样品点的动态过程。还可将图像的色彩根据函数关系转化为绝对数值，对样品进行定性和定量分析。
下面结合附图对本发明的仪器装置和具体样品的检测进行实例说明。
仪器装置实例本发明为多功能光激发表面等离子体共振成像仪，主要由光源A、入射光角度调制系统B、样品分析系统C、温控系统D、检测系统E、数据采集与管理系统F组成。图1为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪的一种以棱镜作为耦合模式的基本结构示例图。
光源A的基本结构如图2所示，主要由激发光源、光束扩展器组成。光束扩展器可以是商品化光学元件，也可以自行制作。激发光源和光束扩展器既可以分开安装，也可以整体组装在平行光管中，光源和光束扩展器之间的距离可以调节，但它们的轴心保持一致。光源包括平行p-偏振复色光光源21、光束扩展器(透镜22、光阑23、透镜24)。
图3为本发明多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪的其中一种球状白光的光路结构示例图。主要球状白光光源31、光阑32、光束扩展器(透镜33、光阑34、透镜35)、偏振片36组成。
入射光角度调节系统B的基本结构如图4所示。入射光角度调节系统主要包括光学反射镜41和角度调节器。角度调节器可以是旋转台，能手动调角，也可是步进电机电控调角。其构造为光学反射镜41固定在反射镜支架42上，接杆43一端连接反射镜支架42，另一端固定在旋转台44的旋转轴心上的螺孔上，调节旋转台的角度，可以联动光学反射镜的角度旋转。当光源射出的光束水平照射到光学反射镜上时，调节旋转台的测微螺杆，反射光的角度随光学反射镜的角度变化而变化，从而实现入射光角度的精细调节。
样品分析系统C和温控系统D的基本结构如图5所示。其中样品分析系统主要由样品输送和电磁波耦合传感器两部分组成。样品输送部分主要由微量泵及相关流路系统组成。样品进样管路53和出样管路54分别位于样品池56的两侧，且与样品池池体的两端相通。微量泵52的一端与样品贮存器51相连接，另一端通过进样管路53和样品池56相通，通过设定调节微量泵52的真空指示表，可以控制进样的流速和流量。出样管路54连接一废液接收器55。电磁波耦合传感器由样品池56、传感膜57、棱镜58和定位卡59组成。样品池56两端被固定在一水平台510上，样品池的池体下面是传感膜57的膜表面，相互之间用垫圈密封。传感膜57的下面是棱镜58，它们之间用液体粘连。棱镜58的下面用定位卡59固定。
温控系统主要由传热介质、散热管、温度传感器、和温控电路组成。其中传热介质512流过样品池56，通过调节温度传感器513和温控电路514来控制样品池56的温度。
检测系统E的基本结构如图6。主要由反射光纠偏器、检测器和角度调节器组成。角度调节器可以是旋转台，能够机械调角，也可是步进电机电控调角。系统构造为反射光纠偏器由透镜61和透镜62组成一透镜组，与彩色CCD检测器63由固定支架64联在一起，由接杆65将它们固定在旋转台66的旋转轴心上的螺孔。调节旋转台的角度可以使反射光纠偏器和检测器一起围绕轴心转动。
数据采集管理系统F该部分主要由图像采集卡、图像编辑处理和数据分析软件组成，用于完成信号的监测与存储、数据的采集与分析处理及实验结果输出等任务。其中图像采集卡(可以采用OK-C30A图像采集卡或其它型号的图像采集卡)进行图像的实时采集、显示、储存和输出。图像编辑处理和数据分析软件对图像进行离线分析，能够提供整体、局部图像采集的随意选择和实时优化功能，可以进行二维图像中的信号比较以及图像和谱线的转换，实现图像的功能优化调控以及根据图像信号的变化实时监测样品点的动态过程。还可将图像的色彩根据函数关系转化为绝对数值，对样品进行定性和定量分析。图7为本发明光激发彩色表面等离子体共振成像仪的图像编辑处理和数据分析软件流程图。
仪器系统工作原理为光源A发出的平行光经入射光角度调制系统B的反射和角度调制后照射到样品分析系统C的传感膜和样品池的界面上。当在传感膜发生表面等离子体共振后，会导致反射光的色彩发生变化。从棱镜反射出的光线进入检测系统E，检测系统将检测到的光信号转变为电信号实时传输到数据采集管理系统F，数据采集管理系统对图像进行实时监测，并对数据分析处理，实现定性定量分析。在检测过程中，可以启动温控系统D精确调控样品池的温度。图8为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪的实验控制系统的程序流程图。图9为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪的软件流程图。
样品的检测实例实施例一棱镜底部镀有一层纳米级厚度的金膜作为传感膜，以彩色CCD作检测器，测定不同体积百分比浓度的乙醇水溶液的彩色表面等离子体共振成像图和色彩响应值，见表1，表1为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪测定的不同体积百分比浓度的乙醇水溶液的彩色共振成像图及其色彩亮度值。
实施例二棱镜底部镀有一层纳米级厚度的金作为传感膜，以彩色CCD作检测器，测得实际白酒样品的体积百分比浓度和标定浓度值的比较，见表2，表2为多功能光激发彩色表面等离子体共振成像仪测定的实际白酒样品的浓度值与样品标定浓度值的比较。
实施例三棱镜底部镀有一层纳米级厚度的金作为传感膜，传感膜通过化学修饰自组装上免疫球蛋白G微阵列，采用彩色CCD作检测器，在空气中测得彩色表面等离子体共振成像图，见图10。图12为其通过其编制软件转化为的线性谱线图。
实施例四与实施例三用相同的方法修饰传感膜，修饰胰岛素。仪器采用CCD作检测器，测定水溶液中彩色表面等离子体共振成像图，见图11。
实施例五固定入射光角度采用CCD作检测器并配接光栅，与实施例三采用相同的方法修饰传感膜，传感膜上共价键合羊抗人免疫球蛋白G。首先在样品池中通入人免疫球蛋白G的缓冲溶液，反应30分钟，同时启动实时检测操作，监测溶液共振波长的变化，然后再向样品池中注入兔抗人免疫球蛋白G的缓冲溶液反应30分钟，抗原抗体相互作用后导致共振波长发生位移见图13，由此实现对抗原抗体相互作用的实时与动态分析。
表1 表2
权利要求
1.一种光激发彩色表面等离子体共振成像仪，主要由光源、入射光角度调制系统、样品分析系统、温控系统、检测系统、数据采集管理系统组成；其中一样品分析系统，其两侧分别设置一连续波入射光和一反射光检测器；该反射光检测器连接一数据采集管理系统；样品分析系统中样品池两侧设有样品进样管路和出样管路，一微量泵通过进样管路和样品池相通控制进样的流速和流量；样品池两端固定在一水平台上，池体朝下，与传感膜的膜表面用垫圈密封，传感膜底面与一棱镜背面粘连；传感膜的表面具有自由电子层的高电导物质；连续波入射光照射通过棱镜激发传感膜表面等离子体而产生共振，直接导致反射光的色彩发生变化。从棱镜射出的反射光进入检测系统，并由电信号传输到数据采集管理系统进行数据处理，实现定性定量分析。
2.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中连续波入射光经过一入射光角度调节系统射入样品分析系统，该入射光调节系统为一光学反射镜固定在一角度可调的反射镜支架上。
3.如权利要求1或2所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中连续波入射光为卤钨灯、氙灯、能斯特灯、硅碳棒灯或发光二极管发出的白光或复色光，经过一光束扩展器或光束压缩器进行调制；对于非偏振光，在光束扩展器或光束压缩器前加设p-型偏振光起偏器。
4.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中棱镜为无机光学玻璃、化学合成光学树脂塑料或具透光性液体材料制成。
5.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中反射光检测器为彩色电荷耦合器、彩色互补型金属氧化物半导体图像传感器、电荷注入检测器、光电倍增管或照相机，作为反射光纠偏器的透镜与其同光轴地固定在一旋转支架上，组成检测系统，以对反射光进行校正和调焦。
6.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中样品分析系统中的样品池的池体上方与一温控系统的散热管路相连接，该散热管路连接一冷却液容器，该冷却液容器连接一温控调节器的温控电路。
7.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中传感膜为金膜、银膜或铝膜，厚度为10-200nm。
8.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中数据采集管理系统进行图像的实时采集、显示、储存和数据的分析处理及实验结果输出。
9.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中检测器前任何位置配置单色器或利用单色光电转换器，即可转换成黑白表面等离子体共振成像仪。
10.如权利要求1所述的光激发彩色表面等离子体共振成像仪，其中检测器前任何位置配置色散系统，即可换成波长询测的表面等离子体共振光谱仪。
全文摘要
一种光激发彩色表面等离子体共振成像仪，主要由光源、入射光角度调制系统、样品分析系统、温控系统、检测系统、数据采集管理系统组成。该仪器以复色光作为激发光源，利用全反射介质耦合来激发传感膜的表面等离子体并与之共振，由此产生与实验样品性质相关的彩色(包括黑白)图像，进而实现对样品进行分析与检测的目的。本发明既可以进行单种样品分析，还可以对传感膜进行微点阵处理，形成彩色光学芯片成像技术，实现样品的高通量、多点平行分析。根据样品所引起的彩色共振图像的变化，本仪器不但可以对各种生物分子及非生物样品组分进行定性和定量分析，还可实时动态研究样品性质和生物分子相互作用。
文档编号G01N21/25GK101074928SQ20061001192
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月18日 优先权日2006年5月18日
发明者陈义, 申刚义, 齐莉 申请人:中国科学院化学研究所