专利名称：预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过测定血管和内皮功能调节、血管紧张素II降解通路上的重要酶基因的单核苷酸多态性(SNP)，预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的方法。属于医药领域。
背景技术：
高血压病是我国及全球最常见的慢性疾病之一。高血压病人全球约有6.9亿人，发病率高达31.3％。流行病学研究显示，血压水平与心血管病发病率呈线性相关；血压升高是脑卒中和冠心病发病的独立危险因素。高血压是引起危及生命的心、脑血管病如心肌梗死、脑卒中、肾脏功能不全等的主要原因。因此，有效控制血压对防止高血压患者心脑血管并发症的发生具有重大的临床意义。
肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在机体血压调节及高血压发病中起着重要的作用。血管紧张素原在肾素作用下转化成血管紧张素I，再经血管紧张素转化酶(ACE)的作用，生成血管紧张素II，血管紧张素II可引起血管收缩、刺激醛固酮分泌，心肌肥厚，血管壁增厚等，从而导致血压升高及促进高血压的发生。
临床上用于治疗高血压的药物主要分为六类利尿剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、α-肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂。后两者都是作用于RAAS系统的抗高血压药物。为了降低相关的病死率及致残率，高血压患者通常需要长期服用降压药物。
虽然人们对血压的认识和干预越来越完善，但是对于高血压患者降压治疗的血压达标率仍不满意。血压的低控制率的原因是多方面的，如医生对控制目标的认识不同，患者不能改变不良生活习惯，对药物不耐受，治疗依从性差，单药治疗的血压控制率低(40％-50％)等，更重要的是，与临床上缺乏有效的针对患者个体差异的药物疗效预测系统有关。临床上用于预测药物疗效的方法仅仅凭借医生的临床经验，这种预测方法具有明显的滞后性及盲目性，不能给医生选择药物提供准确的个体化信息。
苯那普利(benazepril)是一种非巯基血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)，目前广泛用于降压治疗，它主要通过抑制RAAS系统中ACE酶的活性来发挥降压药效。但药效存在着显著个体差异，一般而言10mg的苯那普利约对50％的轻中度高血压患者有效。药物在人体内需要经过转运(吸收、分布、排泄)和转化(代谢)的过程才能发挥作用；药物在体内发挥效应同样需要一些介质的参与，如促进或抑制相应的酶的活性，激活或阻滞相应的受体等，之后再进行一系列的信号传导，最终导致生物学效应。编码参与上述过程的酶、受体等的基因发生突变可能导致酶活性及数量、受体功能等发生改变，从而产生不同的效应。
目前认为药物的个体化差异是一个复杂的表型，是遗传和环境因素共同作用的结果。已知药物疗效和副作用的个体差异与遗传因素有关。在家系和双生子研究中发现，约30％～60％的血压变异是由遗传因素造成的Lancet，1994；344169-171，并且存在小部分的单基因遗传性高血压。药物反应的遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异Science，2000；2871977-1978J Clin Invest，1994；94；1872-1882。
疾病相关或药物反应相关的基因多态性，是药物反应个体差异性的重要遗传学基础。药物基因组学是利用高通量的基因组学和生物信息学的手段，分析和发现可能与疾病发病差异或药物反应差异相关的候选因及其单核苷酸多态性(SNP)，为预测药物反应的个体差异性提供遗传性标志物(Genetic marker)。用以预测患者对某一种类或特定药物可能产生的药物反应(疗效和/或毒副作用)，为临床医生根据个体特征选择疗效更高，毒副作用更低的更个体化的治疗方案，减少可以避免的医疗费用，提供客观参考依据。
SNP是指不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异，平均每1000对碱基出现一个SNP，两个无关个体间大约有300万个SNP。SNP在个体化用药上可谓是举足轻重。影响药物有效性的因素包括药物前体因代谢而激活，药物与靶细胞的结合能力，药物与药靶的结合和活性，活性药物被代谢、降解和排出；而药物的安全性则取决于药物在体内的代谢、降解和排出环节以及药物在体内的非特异性结合和活性。在这些环节上的任一处存在SNP位点基因型的个体遗传特征差异，最终都可能表现为不同个体对同一药物的不同反应差异(疗效或副作用)，有时其差异可达数百倍。
目前发现原发性高血压涉及到的相关基因已超过70个，不同的基因导致的药物疗效对高血压患者有差别。多数研究集中于观察基因多态性对降压药物治疗引起的心血管反应的影响。例如，携带α-adducin基因460W等位子的高血压患者，与应用其他类降压药治疗相比，利尿剂治疗出现心肌梗死和中风的几率降低Lancet，1997；3491353-7。在降压作用方面，发现一氧化氮合酶(NOE)基因多态性和利尿剂、α-adducin基因多态性和利尿剂、G蛋白α-亚型基因多态性和β-肾上腺素受体阻滞剂、ACE基因多态性和血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂等都存在相互作用Drugs，2004；641801-1816。ACE插入缺失的多态性与ACEI存在相互作用，表现为不同基因型在AT1受体蛋白的mRNA表达、左心室肥大、动脉硬化等方面的差异。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一种重要的血管紧张素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先发现。PRCP在pH等于5时，具有最佳的酶活性，当pH升高到7时酶活性只剩下最大时的20-50％。PRCP属于丝氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在内皮细胞的外膜表达。PRCP降解血管紧张素II，使得具有强烈缩血管活性的血管紧张素II转变成具有舒血管活性的血管紧张素1-7，参与RAAS系统功能的调节。此外，PRCP还是一种独立于XIIa之外的血浆激肽酶原激活物，能够使得激肽酶原激活生成缓激肽。由于PRCP既能降解血管紧张素II，增加血管紧张素1-7的生成又能促进缓激肽的释放，两种作用都能使得NO的生成增多，进而舒张血管，起到降低血压的作用。PRCP基因定位于人类染色体11q14区域。位于其外显子上的一个A-C的碱基突变，导致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天门冬氨酸(Asp)。我们的研究发现，该多态性位点与PRCP的mRNA的表达及活性等有关。鉴于PRCP对RAAS系统和血压的重要调节作用，该功能性单核苷酸多态性位点很有可能会影响到ACEI类药物的疗效。
高血压患者的降压疗效与同型半胱氨酸(Hcy)通路的基因多态性有关。有研究表明亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T的基因多态性与ACEI类降压药疗效有关Thrombosis Research 2004，113361-369。对于444名中国的原发性高血压患者进行为期2周的ACEI类降压药物苯那普利的降压治疗，结果提示MTHFR C677T基因为TT的原发性高血压患者与基因型为CT或者CC的患者相比较基础血压值明显增高，而且对于ACEI类降压药物的降压效果较好，尤其对于舒张压的降压效果较好。
由于药物反应的个体差异是一个复杂表型特征，是由多种遗传因素和多种环境因素交互作用的结果。今后根据个体患者的遗传环境特征设计的个体化的用药方案，需要医生在选择治疗高血压药物时，能够根据患者多种遗传特征综合地预期患者对特定的药物产生的反应，选出对于相应患者个体最适的治疗方案，指导医生为患者提供个体化的医药服务。
发明内容
为了克服临床选择ACEI类药物的盲目性，本发明为个体化用药提供一种预测ACEI类药物的作用效果的方法，即通过测定生物样品中调节血管和内皮功能的血管紧张素II降解通路上的脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因的多态性位点基因型，预测ACEI类药物的作用效果。在分析多态性位点基因型的基础上，可以预测个体患者使用ACEI类药物的有效性和安全性，指导临床用药，实施个体化医疗，早期有效地控制血压，降低医疗成本。
为实现上述发明目的，采取以下技术方案本发明的预测苯那普利(benazepril)等血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类药物的作用效果的方法，通过检测生物样品中对血管和内皮功能调节、血管紧张素II降解通路的重要酶为脯氨酸羧肽酶(PRCP)基因的多态性位点E112D(rs2298668)的基因型，预测含有ACEI类药物的作用效果当PRCP多态性位点基因型为突变基因型(包括112DD纯合突变型和112ED杂合突变型)时，预测ACEI类降压药物的作用效果弱；当PRCP多态性位点基因型为纯合野生型112EE时，预测ACEI类降压药物的作用效果增强。本发明的预测方法还为开发应用本方法研制的预测试剂盒，及开发作用于脯氨酸羧肽酶的新药提供了依据。
在本发明中，所述的作用效果除了降压作用效果还涉及因降压导致的靶器官保护作用，包括肾脏功能保护，预防PTCA术后再狭窄以及预防动脉硬化、冠状动脉硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、脑出血、脑梗塞、腔隙性脑梗塞、视网膜动脉硬化等并发症。
在本发明的实施方案中，所述药物为含有ACEI的药物，所述待预测的药物及其组合物的作用效果主要是降低血压的作用效果。具体的，ACEI类药物主要通过影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)而起到调节血压的作用效果。ACEI通过与血管紧张素I转换酶结合，抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，以此达到抑制血管紧张素II的生成，减少醛固酮的分泌；另外，限制缓激肽的降解，进而激活一氧化氮合成酶，保护血管内皮细胞功能，降低交感神经引发的血管壁张力，最终实现血压调节作用效果。用于本发明所述含有的ACEI类药物选自苯那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapail)、西拉普利(cilazapril)、培哚普利(perindopril)、地拉普利(delapril)、喹那普利(quinapril)、赖诺普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、咪达普利(imidapril)、佐芬普利(zofenopril)、群多普利(trandolapril)、和福辛普利(fosinopril)等。其中依那普利、苯那普利和赖诺普利是ACEI类药物中常用的、具有代表性的药物。优选为依那普利、苯那普利、赖诺普利或福辛普利。
本发明所述的方法中，所述的PRCP E112D(rs2298668)多态性位点和包括苯那普利在内的ACEI类药物的降压疗效发生有关，具有显著预测效果。具体的，当(1)所述PRCP多态性位点基因型为112ED杂合突变基因或者多态性位点基因型为112DD纯合突变型时，预测上述ACEI类药物及其药物组合物降低血压作用效果弱；(2)所述PRCP多态性位点基因型为112EE纯合野生型时，预测上述ACEI类药物及其药物组合物降低血压的作用效果增强。
本发明中，可利用多态性分型寡核苷酸来检测上述多态性位点的基因型，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，用于扩增含有所述多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断，它能够检测血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP(脯氨酸羧肽酶)基因的多态性位点基因型，和/或(2)用于检测它能够检测血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP(脯氨酸羧肽酶)基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与它能够检测血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP(脯氨酸羧肽酶)基因上的多态性位点的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
由此，本发明预测ACEI类药物的降压疗效的方法，具体可包括以下步骤1)利用上述多态性分型寡核苷酸试剂盒检测来自个体的生物样品中所述关键酶基因的多态性位点基因型；2)建立含有检测样品PRCP多态性位点基因型的预测模型；3)根据所述多态性位点基因型预测AECI类药物的降压作用效果。
在本发明所述的方法中，可用于预测AECI类药物的作用效果的多态性位点至少包含上述PRCP的E112D(rs2298668)多态性位点，还可以进一步包含同一基因上该位点附近与之存在连锁不平衡的其他多态性位点来确定，这样的多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点及其位点。
常见的单核苷酸多态性(SNP)位点可以位于基因的外显子部位、内含子部位和非编码区部位，优选为外显子部位，尤其是能改变编码的氨基酸序列的多态性位点。
在本发明所述的方法中，测定所述多态性位点的基因型可以使用以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、测序法、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、Taqman生物检测方法。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP、Taqman技术、生物芯片、核酸芯片或者试剂盒。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、测序法、Teqman基因扫描技术是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法。生物芯片是指采用广岛原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量或质量。
本发明对于位点基因型的检测方法的说明并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测以AECI类药物降压疗效为核心的其他风险均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点功能型基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测ACEI类降压药物作用效果的事例。
在本发明所述的方法，其中所述来自个体的生物样品选自如外周全血、外周血细胞、白细胞、血清等的血液样品，尿液、唾液等体液样品，口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织等组织样品，组织样分泌物，排泄物样本，培养细胞，优选的，所述样品为血液样品，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总核酸。
本发明涉及的研究发现脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)是一种重要的血管紧张素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先发现。PRCP在pH等于5时，具有最佳的酶活性，当pH升高到7时酶活性只剩下最大时的20-50％。PRCP属于丝氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在内皮细胞的外膜表达。PRCP是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和激肽-缓激肽系统(KKS)之间的调节剂，是血管和内皮功能的另一种重要的调节系统。PRCP降解血管紧张素II，使得具有强烈缩血管活性的血管紧张素II转变成具有舒血管活性的血管紧张素1-7，参与RAAS系统功能的调节。此外，PRCP还是一种独立于XIIa之外的血浆激肽酶原激活物，能够使得激肽酶原激活生成缓激肽。由于PRCP既能降解血管紧张素II，增加血管紧张素1-7的生成又能促进缓激肽的释放，两种作用都能使得NO的生成增多，进而舒张血管，起到降低血压的作用。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人类11号常染色体的长臂上(11q14)，编码一种溶酶体酶，作用是酶切如血管紧张素II、血管紧张素III和缓激肽等肽类与脯氨酸连接的C末端氨基酸。位于其外显子上的一个A-C的碱基突变，导致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天门冬氨酸(Asp)。我们研究发现，该多态性位点与PRCP的mRNA的表达及活性等有关。鉴于PRCP对RAAS系统和血压的重要调节作用，该功能性单核苷酸多态性位点很有可能会影响到ACEI类药物的药物作用。但与ACEI类药物降压作用的关系及其预测方法、试剂盒尚无文献报道。
本发明发现并证明在高血压的患者中(表1)，PRCP 112DD纯合突变型和112ED杂合型的降压幅度比112EE纯合野生型患者降压幅度显著减弱，收缩压降低幅度差异更大。经过矫正调整了年龄、地域、性别、职业、烟酒嗜好、教育程度、基线血压和BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型和112ED杂合型比PRCP 112EE纯合野生型基因型的收缩压的血压下降值少8.61mmHg(95％CI4.51-10.71mmHg，p＜0.001)；舒张压的血压下降特征与收缩压具有同样趋势，下降值少6.10mmHg(95％CI4.60-7.60mmHg，p＜0.001)。结果提示脯氨酸羧肽酶基因(PRCP)的E112D(Glu112Asp)多态性与苯那普利的降压效果有关，携带112D(112Asp)等位基因的个体对苯那普利的反应差，血压下降幅度小。舒张压下降的幅度比收缩压的更小。这一结果在两个不同地区的人群中相互得到了有力证实(表2)。
因此，PRCP基因E112D(Glu112Asp)多态性或与其附近的存在连锁关系的其它基因多态性可以用于预测苯那普利等ACEI类药物的作用效果及研制预测试剂盒；上述结果也为开发作用于脯氨酸羧肽酶的新药提供了依据。为临床医生更科学地为患者提供个体化的用药方案，预测和把握药物作用，提高ACEI类药物的有效性提供客观依据。
图1是使用PCR-RFLP方法检测PRCP基因的E112D多态性位点基因型的凝胶电泳图。
图2是使用Taqman方法检测PRCP基因的E112D多态性位点基因型的荧光图谱。
其中1——167bp片断；2——101bp片断； 3——66bp片断；4——发出FAM荧光区域； 5——发出两种荧光区域；6——发出VIC荧光区域。
具体实施例方式
实施例1PCR-RFLP法测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA按照常规的分子生物学方法操作。
(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；(b)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。
(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测PRCP E112D多态性位点根据PRCP E112D基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列正向引物5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.1)反向引物5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.2)PCR反应体系基因组DNA 15ng/μl，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 1.25mmol/l，10×buffer 1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，dH2O补足总体积至6.55μl。
PCR反应条件94℃预变性3min后；94℃变性45sec，62℃退火45sec，72℃延伸1sec，38个循环周期；最后72℃延伸7min；得到167bp的扩增片段。
酶切条件及体系(15μl)
PRCP E112D位点PCR产物目的片段长度为167bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10μl，10×NEBuffer#2 1.5μl，AVaII内切酶(其识别片断为G/GWCC，其中W为A或T)4U(0.4μl)，和3.1ul ddH2O，37℃过夜。
基因型结果判定将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，37℃酶切过夜后，在紫外灯下读取胶图(如图1所示)并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下酶切片段为167bp，PRCP基因型为112EE(野生型)；酶切片段为167+101+66bp，PRCP基因型为112ED(杂合子)；酶切片段为101+66bp，PRCP基因型为112DD(纯合子)。
实施例2Taqman法测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型(1)在标准的操作方法和操作规程上采用同实施例1中所述的常规方法提取宿主细胞的基因组DNA(2)使用Taqman方法检测PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多态性位点基因型(a)用PCR仪扩增PRCP功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix NoAmpERAASe UNG(组成成份包括AmpliTaq Gold DNA PolymeRAASe，dNTPs withDutp，Passive Reference，以优化的缓冲液)，及0.90μM的正向引物，0.90μM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.25μM.
引物序列为正向引物5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.3)反向引物5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’(SEQ ID No.4)等位基因特异性探针的序列为VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.5)对应于“T(或Glu)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.6)对应于“G(或Asp)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
PCR反应条件95℃10min，1个循环；92℃15s，60℃1min，
50个循环。
(b)在ABI Primer 7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息进行基因型的鉴定将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用SDS 2.1软件中“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断(如图2所示)发出FAM荧光者的基因型为Asp/Asp纯合子；发出VIC荧光者的基因型为Glu/Glu纯合子；发出两种荧光者的基因型为Asp/Glu杂合子。
实施例3PRCP基因E112D多态性基因型和苯那普利降压疗效的相关分析在高血压的患者中，PRCP 112DD纯合突变型和112ED杂合型的降压幅度比112EE纯合野生型患者降压幅度显著减弱，收缩压降低的差异更大(表1)。经过矫正调整了年龄、地域、性别、职业、烟酒嗜好、教育程度、基线血压和BMI等因素后的预测方程分析，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型和112ED杂合型比PRCP 112EE纯合野生型基因型的收缩压的血压下降值少8.61mmHg(95％ CI4.51-10.71mmHg，p＜0.001)；舒张压的血压下降特征与收缩压具有同样趋势，下降值少6.10mmHg(95％ CI4.60-7.60mmHg，p＜0.001)。结果提示脯氨酸羧肽酶基因(PRCP)的E112D(Glu112Asp)多态性与苯那普利的降压效果有关，携带112D(112Asp)等位基因的个体对苯那普利的反应差，血压下降幅度小，舒张压下降的幅度比收缩压的更小。这一趋势在两个不同地区的人群中相互得到了证实(表2)。
表1.PRCP基因E112D多态性基因型和苯那普利降压疗效的相关分析
注(1)调整变量为Age，Age2，County，Gender，Occupation，Drinking and Smoking Status，Education，Baseline SBP and DBP，Body Mass Index.(2)EE代表纯合野生型，ED代表杂合型，DD代表纯合突变型。
因此，PRCP基因E112D(Glu112Asp)多态性或与其存在连锁关系的其它基因多态性可以用于预测苯那普利等ACEI类药物的降压效果及研制预测试剂盒；本发明所述预测方法中，PRCP E112D(rs2298668)多态性位点和包括苯那普利在内的含有ACEI类药物的药物组合物的降压疗效有关，具有显著预测效果。具体的，当(1)所述PRCP多态性位点基因型为112ED杂合突变基因或者多态性位点基因型为112DD纯合突变型时，预测上述含有ACEI类药物的药物组合物降低血压的作用效果弱；(2)所述PRCP多态性位点基因型为112EE纯合野生型时，预测上述药物组合物降低血压的作用效果增强。
本发明可指导医生实施预测用药，根据个体差异进行选择，提高了临床用药的有效性与安全性。同时研究结果也为开发作用于PRCP降压的新药及其个体化应用提供了依据。
表2.两研究地区PRCP基因E112D多态性基因型和苯那普利降压疗效分析比较
注(1)调整变量为Age，Age2，County，Gender，Occupation，Drinking and Smoking Status，Education，Baseline SBP and DBP，Body Mass Index.(2)EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型。
实施例4通过测定个体基因型参数及其他生理参数预测含有ACEI类药物作用效果通过测定个体基因型参数及其他生理参数建立预测模型，可以更准确地预测ACEI类药物的作用效果。
1、获得如本实施例相似的数据资料结果，即PRCP E112D多态性位点基因型参数和基本生理参数年龄、性别、吸烟史、饮酒史、职业、教育程度、基础收缩压、基础舒张压和体重指数。
2、根据多元线性回归分析，得到用来预测含有ACEI类药物的作用效果的预测模型。
预测方程分别为降压疗效的预测方程(1)舒张压下降幅度的预测方程Δdbp＝C1+a1×112DD+b1×112ED-c1×年龄+d1×BMI+e1×性别-f1×饮酒史+g1×吸烟史+h1×职业+j1×教育程度+k1×基础舒张压Δdbp为治疗后的舒张压的下降值。
(2)收缩压下降幅度的预测方程Δsbp＝C2+a2×112DD+b2×112ED-c2×年龄+d2×BMI+e2×性别-f2×饮酒史+g2×吸烟史+h2×职业+j2×教育程度+k2×基础收缩压Δsbp为治疗后的收缩压的下降值。
以上步骤中的基因型参数值的取值方式如下按照测定的PRCP基因型多态性位点的基因型取值。当个体的基因型为DD纯合突变型时，预测方程中112DD基因型参数取值为1，112ED基因型参数取值为0；当个体的基因型为112ED杂合型时，预测方程中112DD基因型参数取值为0，112ED基因型参数取值为1；当个体的基因型为EE纯合野生型时，预测方程中112DD基因型参数取值为0，112ED基因型参数取值为0。
以上步骤中的基本生理参数值的取值方式如下年龄参数取实际年龄数值，单位为岁；BMI(体重指数)参数为体重(公斤)/身高(米)2(kg/m2)；性别参数为男性取0，女性取1；饮酒史参数为从不饮酒取0，曾经饮酒或者现在饮酒取1；吸烟史参数为从不吸烟取0，曾经吸烟或者现在吸烟取1；身高参数取实际身高值，单位为厘米(cm)；体重参数取实际体重值，单位为公斤(kg)；职业参数为农民取0，非农民取1；教育程度参数为中等以上教育程度取0，其他为1；基础收缩压参数为实际基础收缩压值，单位为毫米汞柱(mmHg)。
实施例5预测ACEI类药物的降压疗效采用病例-对照研究方法，对高血压患者根据其位点基因型检测结果，预测其服用ACEI类药物后血压下降达到卫生部标准的比例，其随访结果归纳如表3表3.PRCP基因E112D多态性位点基因型对降压疗效预测作用
注(1)依据中国卫生部标准，定义“有效”为服用后dbp下降＞10mmHg或dbp降至＜90mmHg或sbp下降＞＝30mmHg；定义“无效”为服用后血压仍为异常，且下降幅度不满足dbp下降＞10mmHg和dbp降至＜90mmHg和sbp下降＞＝30mmHg中的任何一个标准。(2)EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型。(3)敏感性＝149/180*100％＝83％；特异性＝50/239*100％＝21％；阳性预告值(PV+)＝149/338*100％＝44％；阴性预告值PV-＝50/81*100％＝62％。(4)*卡方值＝4.691，p＝0.030。
上述结果表明纯合野生型112EE位点基因型的患者中，服用ACEI类药物后降压达到有效的比例较高，而杂合型112ED位点基因型和纯合突变型112DD位点基因型患者降压有效的比例较低，这与本发明方法的预测结果一致。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110> 安徽省生物医学研究所<120> 预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的方法<130> JSP060102<160> 6<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 1atggtttgcc aaaaggttca 20<210> 2<211> 20<212> DNA
<213> 人工序列<400> 2tgtcaccaaa ggggagagac 20<210> 3<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<400> 3gtttgccaaa aggttcagtg actt 24<210> 4<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<400> 4tctccatagt atcgatgttc agcaaac 27<210> 5<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 5catagctttc agttcctca 19<210> 6<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 6atagctttca ggtcctca18
权利要求
1.一种预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的方法，通过测定来自受试者的生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型来预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果当基因型为112EE纯合野生型时，血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果增强；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果较弱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血管紧张素转换酶抑制剂类药物选自苯那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利、和福辛普利。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自血液样品、体液样品、组织样品、组织样分泌物、排泄物样本、培养细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血液样品选自外周全血、外周血细胞、白细胞、血清；所述体液样品选自尿样、唾液；所述组织样品选自口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中测定脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型的方法选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应、PCR-限制性片段长度多态性分析、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、以及Taqman生物检测方法。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过利用多态性分型寡核苷酸检测生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多态性位点基因型，其中，所述的多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，用于扩增含有所述多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断，和/或(2)用于检测所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与含有所述脯氨酸羧肽酶基因多态性位点的核酸杂交。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型是通过该多态性位点附近与之存在连锁不平衡的其它多态性位点的基因型来确定的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的其它多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
全文摘要
本发明提供了一种利用单核苷酸多态性位点基因型预测苯那普利等血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)作用效果的方法及其应用。临床实践表明ACEI类药物存在的个体化差异，目前认为这是由遗传和环境因素共同作用的结果。本发明发现脯氨酸羧肽酶基因(PRCP)的Glu112Asp多态性与苯那普利的降压效果有关，携带112Asp等位基因的个体对苯那普利的反应差，血压下降幅度小。PRCP基因E112D多态性或与其存在连锁关系的其它基因多态性可以用于预测ACEI类药物的降压效果，从而便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药的有效性与安全性，同时研究结果也为开发作用于PRCP用于治疗高血压的新药提供了依据。
文档编号G01N33/48GK101063165SQ20061001183
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者邢厚恂, 张岩, 王滨燕, 李志平, 吴涤, 臧桐华, 徐希平 申请人:安徽省生物医学研究所