专利名称：细胞内精氨酸酶检测方法
技术领域：
本发明涉及一种医学检测方法，具体地说，涉及一种细胞内精氨酸酶检测方法，属于医学检验领域。
背景技术：
近年研究发现精氨酸酶(ARG)是肝脏中的一种水解酶，它是三聚体结构，在鸟氨酸循环的最后过程中起催化作用最终形成尿素和鸟氨酸，这种酶已经在哺乳动物的组织中被发现，它能和鸟氨酸一样供给细胞，预防生物合成聚胺、并在细胞增生和分化过程中起重要调节作用，有诱导分化癌细胞作用。近年发现在患肿瘤和肝病病人的血清中，此酶活性都较高(Aminlari，MClin Biochem 199225.431-436)。
因此国内外学者均对精氨酸酶能否在癌症患者组织中和血液中准确稳定的检出感兴趣，并进行了以下尝试血清中检测结直肠癌患者ARG，血清中检测乳腺癌患者ARG，新鲜结直肠癌组织中ARG等。但是各家报道的阳性率有很大差异，例如1998年2期湖北医科大学学报石俊等报道，乳癌病人血清中ARG的阳性率可达90％(18/20)；2002年日本学者PorembskaZ等报道(PorembskaZ等 CANCER June1，2002/volume94/Number11)，乳癌病人血清中ARG的阳性率可达63％，乳癌病人新鲜组织中ARG的阳性率可达74％；在结直肠癌患者血清中ARG阳性率可达88.9％，新鲜组织中ARG的阳性率可达92.5％。
目前有2种经典的方法检测血清中ARG，即鸟氨酸法(Chinard FP.Photometric estimation of praline and ornithine.J Biol Chem.1952；19991-95)和尿素法(Jergovie I et al.A simple method for serum arginase determination.Chim Acta，1970；30765)。具体如下1.鸟氨酸法取病人末梢血2ml，离心，吸取上清备用。
取0.5ml巴比妥钠，0.1ml L-精氨酸，0.1mlMncl2，0.5ml血清，混合；
37℃30分钟；加入1.3ml三氯醋酸终止，沸水煮1分钟，冷却；离心去除沉淀，留取上清；分别从实验管和对照管取出2ml上清液加入试管中；每个试管分别加入2ml冰醋酸和1ml茚三酮溶液；在沸水煮10分钟，冷却1小时，在515nm比色，测定ARG活性。
2.尿素法取病人末梢血4ml，离心，吸取上清备用。
为了除去血清中尿素的干扰，待测血清需预先透析处理。
备用血清装透析袋透析12小时以上。
透析后血清1ml，缓冲液1ml，活化剂0.3ml混匀，37℃60分钟，加入底物1ml；37℃120分钟，加入三氯醋酸0.2ml；离心10分钟去除沉淀，留取上清；加入上清液1ml，着色剂4ml混匀，5分钟后440nm比色，测定ARG活性。
试剂配制同文献A simple method for serum arginase determination(ChimActa，1970；30765)，可以看出此法血清要前期处理，血清用量很大，所用试剂种类比鸟氨酸法多2种，实验时间长，这种方法不包括血清前期处理的时间，还需用200分钟左右才能完成实验。
目前，所采用的精氨酸酶测定方法还有如下缺点(1)血清中有尿素的干扰血液的组成由血球、血浆两大部分组成，血浆包括水、血浆蛋白、葡萄糖、无机盐和含氮废物(尿素就在其中)。
血液中尿素的浓度高低受多种因素影响，分生理性因素和病理性因素；病理性因素太多，只分析生理性因素高蛋白饮食就能引起血清尿素浓度和尿液排出量显著升高；而且男女水平也有差异，男性比女性高2--3mg/dl；随着年龄的增加有增高的倾向，成人的日间生理变动平均为3.8mg/dl。
尿素是如何生成的，那就是著名的鸟氨酸循环精氨酸酶能催化精氨酸将其水解成为尿素和鸟氨酸。由3个阶段构成一个循环，即鸟氨酸----瓜氨酸------精氨酸。他们在体内循环往复。
可以看出在血清中检测精氨酸酶影响因素很多，其中尿素的影响因素最大，生理性因素就已经使得精氨酸酶检测难以标准化，病理性因素影响就更多了。所以实验结果可以出现重复性试验不稳定、正常对照组精氨酸酶数值范围较大、很难摸索出正常值范围(国外有一位学者就采用患者自己与自己比较的方法来弥补没有正常值范围的问题)、正常人与病人精氨酸酶数值没有明显差异等一系列问题。
有的实验人员采取透析法去除血清中尿素的影响，但是没有统一的检测方法证实血清中尿素是否除净；他们还忽略了生理性因素的影响，如果一位患者今天多吃了高蛋白饮食，明天又没吃高蛋白饮食，血清中尿素的含量会相差很大，用同样的时间和方法去除尿素是不科学的。以上是以一位患者举例，如果是多位患者就更无法统一了，所以血清中尿素的干扰，是血清中检测精氨酸酶的最大缺点。
(2)血清用量太大血清中检测精氨酸酶需要1毫升的血清，病人抽血至少3-4毫升，血清量少就会影响检测结果。如果采取透析法去除血清中尿素的影响需要的血清量还要大。因为血清的用量大，相应其他试剂用量也大，造成了试剂和耗材的浪费。
精氨酸酶主要存在于肝脏中，但近几年发现同时它还存在于细胞更新、生长迅速的组织细胞中；科学家们2004年最新研究发现，健康人肺部组织中没有精氨酸酶，但气喘患者肺部组织中却存在相当数量的这种酶。研究还显示，精氨酸酶在气喘发病中似乎起着主导作用，它会引发连锁反应，最终导致各种气喘症状出现。淋巴细胞是众所周知的免疫细胞，在这群细胞当中是否存在精氨酸酶呢？经过本发明研究人员近几年大量实验研究发现健康人淋巴细胞中精氨酸酶含量很低，但在许多种癌症患者淋巴细胞中却存在相当数量的这种酶。
因此，如何准确稳定地在癌症患者的病变组织或血液中对精氨酸酶进行检测，对于癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后有着极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的细胞内精氨酸酶检测方法，该方法采用直接检测外周血单个核细胞(PBMC)中精氨酸酶，细胞来源丰富，实验稳定性高，重复性好，节省试剂和耗材，可成为癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案一种细胞内精氨酸酶检测方法，包括如下步骤1)取人体末梢静脉血2～4ml抗凝处理，然后加入等体积的淋巴细胞分离液离心提取淋巴细胞层，细胞浓度控制在7×105～1×106个/ml，再加入100ul～500ul的裂解液，制成细胞悬液备用；2)然后对细胞悬液进行酶活化处理，并离心取上清液；3)最后对上清液进行显色处理及比色测定鸟氨酸含量。
其中，所述抗凝可采用肝素、枸橼酸钠或EDTA盐等抗凝剂进行处理，比如所述肝素抗凝法为先将肝素配成50u/ml浓度，再取50ul-100ul的肝素对血进行处理。枸橼酸钠法常用浓度为配成109mmol/L，试剂与血比例为1∶9。EDTA.Na2抗凝方法处理为先配成15mg/ml，取200ul～300ul，对血进行处理。
所述淋巴细胞分离液采用本领域常用的淋巴细胞分离液，用于分离人血液中的单个核细胞，比如天津市川页生化制品有限公司、Cedarlane公司Lympholyte淋巴细胞分离液，上海试剂厂的淋巴细胞分离液LymphocyteSeparation Medium(比重1.077)等。
所述裂解液可采用TritonX-100，其主要成分为聚乙二醇辛基苯基醚，主要作用是细胞破膜去污剂/细胞通透剂，即在细胞膜上打孔，起到溶解细胞膜并释放内含物的作用，另外，也可选用NP-40、Tween-80或SDS等，具有同TritonX-100的作用。
在离心提取淋巴细胞层时，离心的转速1500～2500rpm/分，15～20分钟。
为了减少淋巴细胞分离液的干扰，可先将淋巴细胞用生理盐水洗2～4遍。洗涤细胞时离心的转速1000～1500rpm/分，5～10分钟。
具体地说，步骤2)中为取125ul～500ul巴比妥钠缓冲液，25ul～100ul底物L-精氨酸，25ul～100ul活化剂Mncl2，125ul～500ul细胞悬液，混合；
在37℃保持30分钟；再加入325ul～1300ul终止液三氯醋酸，沸水煮1分钟，室温冷却10～20分钟；离心去除沉淀，取上清液。
离心提取上清液时，离心的转速2000～2500rpm/分，15～30分钟。
所用巴比妥钠缓冲液试剂的pH控制在9.5～9.9。L-精氨酸试剂的pH控制在7.5，在该范围内，底物精氨酸(L-arginine)解离带正电荷，而精氨酸酶的活性部位则解离成带负电荷，这样有利于酶与底物的结合。
步骤3)为从上清液中取出500ul～2ml，加入750ul～1.5ml冰醋酸和375ul～750ul茚三酮溶液；在沸水煮10分钟，冷却10～15分钟，在515nm下用光度计比色，测定鸟氨酸含量。
所用的光度计可为紫外分光光度计或普通光度计。
在检测过程中为了减少试剂、温度、酸碱度等对实验的影响。比色的时候用对照管调零，对照管不加细胞，细胞悬液由裂解液代替，其余各步同实验管。
测定鸟氨酸含量，需要先绘制鸟氨酸标准曲线，基本过程为取3mg鸟氨酸(Ornithine)溶于1ml巴比妥钠缓冲液中，混匀。取上述溶液调成下列不同的溶液浓度3ug/ml，6ug/ml，12ug/ml，18ug/ml，24ug/ml，30ug/ml，36ug/ml，48ug/ml；每种浓度加纯水调至0.5ml。取0.5ml巴比妥钠缓冲液，0.1ml0.2M L-arginine，0.1ml 0.05M活化剂Mncl2，1.3ml20％三氯醋酸。将上述溶液混匀。取2ml混匀液，2ml冰醋酸，1ml茚三酮溶液，沸水中置1小时，冷却后在515nm比色。
计算公式ARG＝Ornithine(实验管-对照管)×0.5050.505＝2×1000×1/132×1/30；2×1000为103细胞中含有0.5ml Ornithine。
本发明所述细胞内精氨酸酶检测方法，采用直接检测外周血单个核细胞中(PBMC)精氨酸酶，其方法有以下优点1.淋巴细胞来源丰富，末梢血中就可以提取大量的淋巴细胞；2.取血量少，只需要抽血2毫升。
3.最关键是淋巴细胞中没有尿素的干扰，解决了实验不稳定的关键因素。
4.实验重复性好，简单易行，经济实用，可以用于标准化，用于临床筛查，更适合大范围普查。
5.节省试剂和耗材，大约4倍左右。
6.检测方法稳定性好、准确率高，敏感性高于常规方法的20～30％。
7.外周血单个核细胞中精氨酸酶方法的建立，可成为癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后的一个敏感型的标志物。
8、本发明所述细胞内精氨酸酶检测方法可用于结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等癌症的检测。检测的准确率高于常规的肿瘤标志物，例如CEA、AFP、CA199、CA242、CA153、NSE等等。
图1为鸟氨酸标准曲线；图2为本发明检测法对不同细胞浓度ARG的测定。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1取结直肠癌患者末梢静脉血2ml采用50u/ml肝素进行抗凝处理，再加入等量的淋巴细胞分离液，经转速2000rpm/分，20分钟离心提取淋巴细胞层，细胞浓度控制在7×105个/ml，生理盐水洗3遍，离心的转速1000rpm/分，10分钟；然后加入100ul的0.1％Triton X-100裂解液，制成细胞悬液备用。淋巴细胞分离液采用天津市川页生化制品有限公司。
再取125ul 0.1M巴比妥钠pH9.5，(中国淄博，分析纯)，25ul 0.2M L-精氨酸(pH7.5)，25ul 0.05M Mncl2(中国北京，分析纯)，125ul细胞悬液，混合；37℃30分钟；加入325ul 20％三氯醋酸(中国天津，分析纯)终止，沸水煮1分钟，室温冷却10分钟；转速2500rpm/分，15分钟离心去除沉淀，留取上清液；对照管不加细胞，细胞悬液由裂解液代替，其余各步同实验管。
分别从实验管和对照管取出500ul上清液加入试管中；每个试管分别加入750ul冰醋酸和375ul茚三酮溶液(中国北京，分析纯)；在沸水煮10分钟，冷却10分钟，在515nm下用紫外分光光度计比色，测定鸟氨酸含量。
测定鸟氨酸含量，需要先绘制鸟氨酸标准曲线，基本过程为取3mg鸟氨酸(Omithine)溶于1ml巴比妥钠缓冲液中，混匀。取上述溶液调成下列不同的溶液浓度3ug/ml，6ug/ml，12ug/ml，18ug/ml，24ug/ml，30ug/ml，36ug/ml，48ug/ml。每种浓度加纯水调至0.5ml。取0.5ml巴比妥钠缓冲液，0.1ml0.2M L-arginine，0.1ml 0.05M活化剂Mncl2，1.3ml20％三氯醋酸。将上述溶液混匀。取2ml混匀液，2ml冰醋酸，1ml茚三酮溶液，沸水中置1小时，冷却后在515nm比色。
计算公式ARG＝Ornithine(实验管-对照管)×0.5050.505＝2×1000×1/132×1/30；2×1000为103细胞中含有0.5ml Ornithine。
选择了125例结直肠癌患者按本实施例进行检测，ARG含量在17.881±15.308ug/ml，阳性检出率达76.8％(96/125)。
实施例2取慢性乙型肝炎末梢静脉血4ml采用EDTA.Na2抗凝方法处理(1.5mg可以阻止1ml血液凝固)，加入等量的淋巴细胞分离液，经转速1500rpm/分，20分钟离心提取淋巴细胞层，细胞浓度为8.5×105个/ml，生理盐水洗4遍，离心的转速1500rpm/分，6分钟；加入300ul的0.1％SDS裂解液，制成细胞悬液备用。
再取250ul 0.1M巴比妥钠pH9.5，(中国淄博，分析纯)，50ul 0.2M L-精氨酸(pH7.5)，50ul 0.05M Mncl2(中国北京，分析纯)，250ul细胞悬液，混合；37℃30分钟；加入650ul 20％三氯醋酸(中国天津，分析纯)终止，沸水煮1分钟，室温冷却15分钟；
经转速2000rpm/分，20分钟离心去除沉淀，留取上清液；分别从实验管和对照管取出1ml上清液加入试管中；对照管不加细胞，细胞悬液由裂解液代替，其余各步同实验管。
每个试管分别加入1ml冰醋酸和500ul茚三酮溶液(中国北京，分析纯)；在沸水煮10分钟，冷却10分钟，在515nm下用紫外分光光度计比色，测定鸟氨酸含量。
测定鸟氨酸含量，需要先绘制鸟氨酸标准曲线，基本过程为取3mg鸟氨酸(Ornithine)溶于1ml巴比妥钠缓冲液中，混匀。取上述溶液调成下列不同的溶液浓度3ug/ml，6ug/ml，12ug/ml，18ug/ml，24ug/ml，30ug/ml，36ug/ml，48ug/ml。每种浓度加纯水调至0.5ml。取0.5ml巴比妥钠缓冲液，0.1ml0.2M L-arginine，0.1ml 0.05M活化剂Mncl2，1.3ml20％三氯醋酸。将上述溶液混匀。取2ml混匀液，2ml冰醋酸，1ml茚三酮溶液，沸水中置1小时，冷却后在515nm比色。
计算公式ARG＝Ornithine(实验管-对照管)×0.5050.505＝2×1000×1/132×1/30；2×1000为103细胞中含有0.5ml Ornithine。
按照本实验例的方法对慢性乙型肝炎患者87例进行检测，阳性诊断率4.5％(4/87)，ARG含量在1.996±0.21 6ug/ml，为正常值范围。
实施例3先取食道癌患者末梢静脉血3ml采用330ul的109mmol/L枸橼酸钠进行抗凝处理，加入等量的淋巴细胞分离液，经转速2500rpm/分，18分钟离心提取淋巴细胞层，细胞浓度为1×106个/ml，加入500ul的NP-40裂解液，其成分50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1％NP-40pH＝8.0。制成细胞悬液备用。淋巴细胞分离液为Cedarlane公司Lympholyte淋巴细胞分离液。
再取500ul 0.1M巴比妥钠pH9.9，(中国淄博，分析纯)，100ul 0.2ML-精氨酸(pH7.5)，100ul 0.05M Mncl2(中国北京，分析纯)，500ul细胞悬液，混合；37℃30分钟；加入1300ul 20％三氯醋酸(中国天津，分析纯)终止，沸水煮1分钟，室温冷却20分钟；经转速2000rpm/分，30分钟离心去除沉淀，留取上清液；分别从实验管和对照管取出2ml上清液加入试管中；对照管不加细胞，细胞悬液由裂解液代替，其余各步骤同实验管。
每个试管分别加入2ml冰醋酸和1.5ml茚三酮溶液(中国北京，分析纯)；在沸水煮10分钟，冷却15分钟，在515nm下用紫外分光光度计比色，测定鸟氨酸含量。
测定鸟氨酸含量，需要先绘制鸟氨酸标准曲线，基本过程为取3mg鸟氨酸(Omithine)溶于1ml巴比妥钠缓冲液中，混匀。取上述溶液调成下列不同的溶液浓度3ug/ml，6ug/ml，12ug/ml，18ug/ml，24ug/ml，30ug/ml，36ug/ml，48ug/ml。每种浓度加纯水调至0.5ml。取0.5ml巴比妥钠缓冲液，0.1ml 0.2M L-arginine，0.1ml 0.05M活化剂Mncl2，1.3ml20％三氯醋酸。将上述溶液混匀。取2ml混匀液，2ml冰醋酸，1ml茚三酮溶液，沸水中置1小时，冷却后在515nm比色。
计算公式ARG＝Ornithine(实验管-对照管)×0.5050.505＝2×1000×1/132×1/30；2×1000为103细胞中含有0.5ml Ornithine。
按照本实验例的方法对食道癌患者27例进行检测，阳性诊断率33.3％(9/27)，ARG含量在2.529±0.847ug/ml。
实验例1采用本发明的方法检测125例结直肠癌，36例结肠息肉和92例正常人外周血单个核细胞中精氨酸酶阳性率，并与CEA、CA242、CA199比较。
一.材料和方法1.1.1材料以往均采用患者的末梢血血清作为实验材料，但是最大的缺点就是血清中有尿素的干扰，造成试验稳定性差。本发明采用外周血单个核细胞避免了血清中有尿素的干扰。
1.1.2患者 患者均为北京军区医院2004年3月-2006年2月住院病人，其诊断均经病理证实。
实验组125例，男77例，女48例，年龄15岁-92岁。
对照组36例，男23例，女13例，年龄15岁-84岁。
1.1.3正常人92例正常人，男56例，女36例。年龄20-52岁，为北京军区医院工作人员，利用每年工作人员体检的机会，采取体检合格者。
1.2方法(细胞内精氨酸酶测定法)1.2.1主要试剂和设备Ornithine(Sigma)；0.2M L-arginine(Sigma ZAs131)；0.1M巴比妥钠(中国淄博，分析纯)；0.05M活化剂Mncl2(中国北京，分析纯)；茚三酮(中国北京，分析纯，用时一定新鲜配制)；20％三氯醋酸(中国天津，分析纯)；0.1％TritonX-100(Sigma)；淋巴细胞分离液(Ficoll-hypaque中国天津)。CEA、CA199、CA242瑞典康乃格，ELISA法。
所需实验仪器紫外分光光度计；恒温箱；水浴箱；水平离心机；显微镜；电子天平等。
1.2.1鸟氨酸标准曲线的绘制3mg Ornithine溶于1ml巴比妥钠缓冲液中，混匀。取上述溶液调成下列不同的溶液浓度3ug/ml，6ug/ml，12ug/ml，18ug/ml，24ug/ml，30ug/ml，36ug/ml，48ug/ml，每种浓度加纯水调至0.5ml。取0.5ml巴比妥钠缓冲液，0.1ml0.2ML-arginine，0.1ml 0.05M活化剂Mncl2，1.3ml20％三氯醋酸。将上述溶液混匀。取2ml混匀液，2ml冰醋酸，1ml茚三酮溶液，沸水中置1小时，冷却后在515nm比色。
计算公式ARG＝Ornithine(实验管-对照管)×0.5050.505＝2×1000×1/132×1/30；2×1000为103细胞中含有0.5ml Ornithine。
1.2.2操作取病人末梢血2ml抗凝，加入淋巴细胞分离液离心提取淋巴细胞层，生理盐水洗3次，计数后将细胞调整为同样数量，加入裂解液30分钟后备用。
取125ul巴比妥钠，25ul L-精氨酸，25ul Mncl2，125ul细胞悬液，混合；
37℃30分钟；加入325ul三氯醋酸终止，沸水煮1分钟，冷却；离心去除沉淀，留取上清；分别从实验管和对照管取出500ul上清液加入试管中；每个试管分别加入750ul冰醋酸和375ul茚三酮溶液；在沸水煮10分钟，冷却10分钟，在515nm比色，测定精氨酸酶(ARG)活性。
在上述标准曲线中测定鸟氨酸含量，以ug/ml表示。
1.2.3对检测性能进行评价包括确定最佳细胞浓度、温度和酸碱度；分析灵敏度、精确度、以及方法学比较。
1.3统计学方法用spss统计软件进行均数(x)、标准差(s)和变异系数(CV)分析，采用直线回归分析和配对t检验。
二.结果1.标准曲线线性评价从图1看出测定的鸟氨酸标准曲线线性良好，稳定，符合临床要求。
2.确定最佳细胞浓度采用淋巴细胞分离液常规分离白细胞，并计数。本发明技术人员采用不同的细胞浓度进行摸索，分别在ARG阳性和阴性标本中设置不同的细胞浓度，最后找到了最佳细胞浓度为7×105-1×106个/ml，患者只抽血2ml就可以达到这个浓度。在实验中可以根据实际情况规定自己认为合适的细胞浓度，要求所有待测标本均为同样浓度，这样才有可比性。结果图2。
3.重复性和精密度批内变异系数将ARG阳性病人细胞配成2个浓度的细胞悬液，分别为7×105、8×105/ml，每种浓度配制两管进行平行试验。正常人细胞为阴性对照，细胞浓度同上，计算每种浓度批内x±S和CV％，检测该方法的重复性。
日间变异系数再将数份阳性病人细胞混合配成同样浓度，加入细胞冻存液，分装后液氮保存，以后隔日测定一次，连续测定5次，计算日间的x、±S和CV％，混合细胞悬液也可以作为阳性对照，结果见表1。
表1 细胞内ARG测定的精密度
从表1看出本发明的方法检测精氨酸酶重复性较好，通过阴性和阳性样品2个浓度的检测，本法的批内CV＜5％，日间＜8％，符合临床要求。
4.每批实验设定空白对照管每次实验设定2个空白对照管，不加细胞，细胞悬液由裂解液代替，其余各个步骤同实验管。对照管一定要从始至终完成每步操作。比色的时候作为对照调零，以减去试剂、温度、酸碱度等对实验的影响。
5.温度本试验对温度要求非常严格，每个步骤的实验温度需要严格掌握误差不能超过±1℃；只有第一步的试验在孵箱，其余均为水浴箱。
6.酸碱度严格控制试剂的酸碱度，酶促反应中只有在其最适pH时才能发挥充分的催化活性，尤其L-arginine和巴比妥钠用前要调整酸碱度。精氨酸酶的最适宜pH9.5～9.9，在该范围内，底物精氨酸(L-arginine)解离带正电荷，而精氨酸酶的活性部位则解离成带负电荷，这样有利于酶与底物的结合。酸碱度过高或过低都会严重影响结果的准确性，如果溶液偏碱所得到的数值和本底就会偏高，反之溶液偏酸所得到的数值就会偏低。所以严格控制试剂的酸碱度，尤其L-arginine和巴比妥钠一定用前调整酸碱度，前者为PH7.5，后者为PH9.5-9.9。
7.方法学比较收集新鲜临床血清样品35例，正常人新鲜血清38例，用原始鸟氨酸方法测定，进行了多次实验历时3个月，每次试验均有临床已经确诊为结直肠癌血清样品和正常人血清样品，但是存在以下问题1/特异性差病人和正常人的数值没有明显差异，P＞0.05，甚至后者高于前者，见表2；2/重复性差12例正常人血清同样方法分2次试验，但同一份样品重复实验不稳定，数据差异较大，结果见表4；3/杂质影响大ARG在血清透析前后比较透析后有的标本ARG下降，有的则上升，没有规律。血清透析后未见明显改善上述不足(见表3)，考虑主要是血清中尿素干扰。
表2结直肠癌患者和正常人血清ARG的测定(原始法)
表3血清法透析前后ARG水平比较
在研究过程中先利用双向电泳技术在结直肠癌患者癌组织、肝转移灶、正常肠粘膜三类组织的2-DE凝胶图像中发现在碱性蛋白端有明显差异，通过质谱分析发现在转移灶精氨酸酶明显上调，故本发明研究人员拟建立精氨酸酶检测方法。经过筛选找到2种比较适合临床大量筛查的方法，鸟氨酸法和尿素法。通过试验摸索我们发现血清中检测精氨酸酶特异性差，可重复性较低，患者和正常人之间没有差异，P＞0.05(见表2)。血清透析前后也未见明显差异(见表3)。众所周知血液中尿素的浓度高低受多种因素影响，分生理性因素和病理性因素；病理性因素太多，我们只分析生理性因素高蛋白饮食就能引起血清尿素浓度和尿液排出量显著升高；而且男女水平也有差异，男性比女性高2～3mg/dl；随着年龄的增加有增高的倾向，成人的日间生理变动平均为3.8mg/dl。
可以看出在血清中检测精氨酸酶影响因素很多，其中尿素的影响因素最大，生理性因素就已经使得精氨酸酶检测难以标准化，病理性因素影响就更多了。所以实验结果(表2、3)出现重复性试验差、正常对照组精氨酸酶数值范围较大、很难摸索出正常值范围，造成正常人与病人精氨酸酶数值没有明显差异等一系列问题。有的实验人员采取透析法去除血清中尿素的影响，但是没有统一的检测方法证实血清中尿素是否除净；他们还忽略了生理性因素的影响，如果一位患者今天多吃了高蛋白饮食，明天又没吃高蛋白饮食，血清中尿素的含量会相差很大，用同样的时间和方法去除尿素是不科学的。以上是以一位患者举例，如果是多位患者就更无法统一了，所以这就是血清中检测精氨酸酶的最大缺点。
表4 12例正常人血清和细胞内ARG的测定值比较
本发明的研究人员经过大量实验研究发现健康人淋巴细胞中精氨酸酶含量很低，没有尿素干扰，很好地克服了上述不足。将12例正常人血清法和细胞内ARG测定值(均分2次测定)进行比较，发现细胞内ARG测定重复性好，明显低于血清法测定值，见表4。
通过12例正常人用两种方法配对测定(表4)，可以看到改良细胞法的正常人ARG明显下调，与血清法比较有非常显著差异，P＜0.001。本发明有以下优点1.淋巴细胞来源丰富，末梢血中就可以提取大量的淋巴细胞；2.取血量少，只需要抽血2毫升；3.最关键是淋巴细胞中没有尿素的干扰，解决了实验不稳定的关键因素；4.实验重复性好、可以标准化，可用于临床大样本筛查；5.节省试剂和耗材。
8.确定正常值范围--正常人精氨酸酶测定健康人淋巴细胞中精氨酸酶含量很低，采用本发明的检测方法将正常人分为3组进行分析，发现在正常人群中ARG呈正态分布，正常值范围是1.114±0.722 ug/ml，平均值+3S＝3.28，测得男女两组ARG活性分别为1.231±0.74和1.099±0.56ug/ml，P＞0.05，男女间无明显差异。结果见表5。
表5 92例正常人精氨酸酶测定结果
9.ARG在结直肠癌组、结肠良性疾病组及正常人中的检出率用本发明的检测方法测定结直肠癌患者125例，其中96例阳性，阳性率为76.8％；结肠息肉36例，13例阳性，阳性率为36.11％；正常人92例，1例阳性，阳性率为1.1％。结直肠癌患者ARG阳性率明显高于良性疾病组，X2＝21.162，P＜0.01。结果见表6。本法灵敏度为76.8％；特异性为63.8％；实验的总有效率73.91％。
表6 ARG在结直肠癌、结肠良性疾病及正常人细胞中的检出率
10.ARG与CEA、CA199、CA242在结直肠癌患者中敏感性比较结直肠癌患者125例，同时测定细胞内ARG和常规肿瘤标志物CEA、CA199和CA242。以ARG结果分为两大组，即阳性组和阴性组，每组分为2项分析。结果显示ARG阳性组96例，其中62例(49.6％)和其他标志物均有不同阳性率，但是有34例(27.2％)ARG阳性，而CEA、CA199和CA242均为阴性。采用本发明的检测方法可以检出27.2％的假阴性结直肠癌患者，明显提高了结直肠癌的早期诊断率。有9例ARG阴性而其他标志物均有不同的检出率，可以达到互补减少假阴性，如果四项肿瘤标志物联合检测结直肠癌的早期诊断率可以提高到84％。(见表7)。
表7 125例结直肠癌ARG和其它肿标比较
(+)代表阳性；(-)代表阴性表8 125例结直肠癌ARG和其它肿标比较
ARG和常规肿瘤标志物CEA、CA199和CA242四项总阳性率依次分别为76.8％，52.8％，36.8％和40％。结直肠癌患者ARG敏感性明显高于CEA、CA199和CA242。X2＝17.42，P＜0.01。结果见表8。
本发明采用从外周血单个核细胞中检测精氨酸酶的方法，其在结直肠癌患者中检出率较高，与CEA、CA199和CA242联合检测可达到优势互补，明显提高肿瘤阳性检出率。外周血单个核细胞中精氨酸酶方法的建立，可能成为结直肠癌早期诊断、预测复发转移和判断预后的一个敏感型的标志物。
实验例2采用本发明的方法检测118例胃癌，136例乳腺癌、124例肝癌、122例肺癌外周血单个核细胞中精氨酸酶阳性率，结果如下。
一.材料和方法1.1.1材料以往均采用患者的末梢血血清作为实验材料，但是最大的缺点就是血清中有尿素的干扰，造成试验稳定性差。本发明采用外周血单个核细胞避免了血清中有尿素的干扰。
1.1.2患者 患者均为北京军区医院2004年3月-2006年2月住院病人，其诊断均经病理证实。118例胃癌，120例乳腺癌、124例肝癌、122例肺癌。
1.1.3 ARG检测取病人末梢血2ml肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液离心取淋巴细胞层，洗3次，计数后将细胞调为同样数量，加入裂解液备用。取125ul巴比妥钠，25ulL-精氨酸，25ul Mncl2，125ul细胞悬液，37℃30分钟；加入325ul三氯醋酸沸水煮1分钟；离心弃沉淀取上清；每个试管分别加入500ul上清液、750ul冰醋酸和375ul茚三酮溶液；沸水煮10分钟，在515nm比色，测定ARG活性。在标准曲线中查找鸟氨酸含量，以ug/ml表示。
结果1.ARG在其他恶性肿瘤中的检出率 用本发明的检测方法测定肝癌患者124例，其中66例阳性，阳性率为53.2％；肺癌122例，62例阳性，阳性率为50.8％；胃癌118例，52例阳性，阳性率为44.1％；乳腺癌123例，65例阳性，阳性率为52.8％。结直肠癌患者ARG阳性率明显高于其他癌症疾病组，X2＝13.666，P＜0.01。而其他四组之间经过统计学处理未见明显差异，X2＝3.715，P＞0.05，结果见表9。
表9 ARG在结直肠癌和其他恶性肿瘤中的检出率
2.ARG与其它常规肿瘤标志物敏感性比较
2.1肝癌AFP在胚胎期是功能蛋白，合成于卵黄囊、肝和小肠，脐带血含量为1000-5000μg/L，1年内降为成人水平＜40μg/L，终生不变。AFP在临床上用于以下辅助诊断(1)产前诊断胎儿宫内死亡、神经管畸形、无脑儿和脊柱裂。(2)急慢性肝炎，在1100例肝炎患者测定中发现16.7％AFP20-90μg/L，8.7％AFP 90-400μg/L，2.8％AFP400-1000μg/L，其中1例维持1000μg/L以上达6周，后逐步下降。原发性肝细胞癌约70％以上AFP在400μg/L以上，多逐渐升高，亦有不高于400μg/L，甚至在正常水平的患者。我们同步比较了124例肝癌患者的ARG和AFP，阳性率分别为53.2％和50.8％。经过统计学处理未见明显差异，X2＝0.1452，P＝0.05。提示两种方法检测肝癌的敏感性没有差别。
2.2乳腺癌癌抗原15-3是一种乳腺癌相关抗原，属糖蛋白，分子量超过400000，用一对单克隆抗体(MAbll5D8和MAbDF3)进行双抗体夹心法来识别。对乳腺癌的诊断和术后随访监察有一定的价值。但在乳腺癌的早期敏感性较低是其不足。乳腺癌患者常有CA15-3升高，但在乳腺癌的初期敏感性较低约为30％，转移性乳腺癌阳性率可达80％。在欧洲国家CA15-3测定作为原发性乳腺癌的辅助诊断指标，也是手术后随访，监测肿瘤复发，转移的指标。我们同步比较了123例肝癌患者的ARG和CA15-3，阳性率分别为52.8％和34.1％。经过统计学处理有明显差异，X2＝7.367，P＜0.01。提示ARG在乳腺癌的早期诊断上比CA15-3敏感的多。
2.3胃癌CEA是一种酸性糖蛋白，胚胎期在小肠、肝脏、胰腺合成，成人血清含量极低(＜5μg/L，如吸烟者为15-20μg/L，6.5％可达20-40μg/L)。CEA1965年被发现时，认为是结肠癌的标志物(60％患者升高)，但以后发现胰腺癌(68％)、胃癌(36％)、肺癌(55％)和乳腺癌(40％)也有较高表达。
CA19-9为唾液酸化的乳-N-岩藻戊糖II，是一种类粘蛋白的糖蛋白成分，与Lewis血型成分有关。血清内正常值＜37U/mL，异常升高也是在多种肿瘤出现，如69％胰腺癌、48％结肠癌、39％肝癌、57％胃癌、如胆囊癌、肺癌、乳腺癌皆有10％左右是升高的。我们同步比较了124例肝癌患者的ARG和CEA、CA199，阳性率分别为44.1％、50.9％和49.5％。经过统计学处理未见明显差异，X2＝1.685，P＝0.05。提示三种方法检测胃癌的敏感性没有差别。
结论精氨酸酶在外周血单个核细胞(PBMC)中检测方法的建立为国内外首创，其在结直肠癌患者中检出率较高，可以达到76.8％，与CEA、CA199和CA242联合检测可达到优势互补，明显提高肿瘤阳性检出率。另外，用该方法我们还检测了其他的恶性肿瘤也均有一定的阳性率，尤其是对乳腺癌的早期诊断比目前常规项目CA15-3敏感。该方法敏感性高，重复性强，稳定性好，可能成为结直肠癌早期诊断、预测复发转移和判断预后的一个敏感性的标志物。
权利要求
1.一种细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，包括如下步骤1)取人体末梢静脉血2～4ml抗凝处理，然后加入等体积的淋巴细胞分离液离心提取淋巴细胞层，细胞浓度控制在7×105～1×106个/ml，再加入100ul～500ul的裂解液，制成细胞悬液备用；2)然后对细胞悬液进行酶活化处理，并离心取上清液；3)最后对上清液进行显色处理及比色测定鸟氨酸含量。
2.根据权利要求1所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，所述抗凝采用肝素、枸橼酸钠或EDTA盐抗凝剂进行处理。
3.根据权利要求1所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，所述裂解液为聚乙二醇辛基苯基醚、NP-40、Tween-80或SDS。
4.根据权利要求1所述的细胞内精氨酸酶检测方法，所述离心提取淋巴细胞层时，离心的转速1500～2500rpm/分，15～20分钟。
5.根据权利要求1-4中的任意一种所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，离心提取淋巴细胞层后用生理盐水洗2～4遍，洗涤细胞时离心的转速1000～1500rpm/分，5～10分钟。
6.根据权利要求1所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，步骤2)为取125ul～500ul巴比妥钠缓冲液，25ul～100ul底物L-精氨酸，25ul～100ul活化剂Mncl2，125ul～500ul细胞悬液，混合；在37℃保持30分钟；再加入325ul～1300ul终止液三氯醋酸，沸水煮1分钟，室温冷却10～20分钟；离心去除沉淀，取上清液。
7.根据权利要求6所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，离心提取上清液时，离心的转速2000～2500rpm/分，15～30分钟。
8.根据权利要求1或6所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，步骤3)为从上清液中取出500ul～2ml，加入750ul～1.5ml冰醋酸和375ul～750ul茚三酮溶液；在沸水煮10分钟，冷却10～15分钟，在515nm下用光度计比色，测定鸟氨酸含量。
9.根据权利要求所述的细胞内精氨酸酶检测方法，其特征在于，所用巴比妥钠缓冲液试剂的pH控制在9.5～9.9，L-精氨酸试剂的pH控制在7.5。
全文摘要
本发明公开一种细胞内精氨酸酶检测方法，该方法采用直接检测外周血单个核细胞(PBMC)中精氨酸酶含量，其在结直肠癌中阳性检出率达76.8％，检测细胞来源丰富，实验稳定性高，重复性好，节省试剂和耗材，可成为癌症患者早期诊断、预测复发转移和判断预后的方法。
文档编号G01N1/28GK101021468SQ200610011798
公开日2007年8月22日 申请日期2006年4月26日 优先权日2006年4月26日
发明者李世拥, 安萍, 徐一石 申请人:安萍