增强来自生物对象的光学信号并将其成像的方法和应用的制作方法

专利名称：增强来自生物对象的光学信号并将其成像的方法和应用的制作方法
技术领域：
本公开涉及利用表面增强的拉曼光i普学衬底的拉曼成像。
背景技术：
表面增强拉曼光谱学("SERS")是一种有趣的现象，但是它既 不是众所周知的又不是可再现的也不是可控的。目前对增强拉曼信 号的微小金属粒子做最大限度的理解和SERS工作。目前，SERS用 以增强表面上相对地小的分子的拉曼信号，而不是增强大的生物实 体的拉曼信号。起初在用电化学的方法弄糙的贵金属表面上建立 SERS，所述SERS已证明难以表征和重现。大部分更近期的SERS 工作涉及使用微小的20-200nm直径的银或金的胶体微粒，这是由于 容易制造和可重现性的缘故。在某些情况下，处理这些粒子，使得 起与这些粒子结合的作用的配体被连附到特定化学实体上。在生物 样品的情况下，这样的配体称为免疫标签(immuno tags),所述免疫 标签可以结合到生物样品中轮廓清楚的蛋白质或受体上。这样的标 记广泛地用于其它医疗领域并且取决于特定的目标对象，从而使这 样的标记不是研究任何材料或目标实体的一般方法。
SERS研究主要受SERS探头的小&寸的限制，所述SERS探头 一般包括在所述结构处或其附近(一般离开这样的结构的距离在纳 米范围内，但是离开所述结构5纳米那样多)提供增强的纳米粒子 或结构，大部分SERS以及用以理解，指导SERS基片或目标的设计的现象学都基于要求将来自特定分子的结果信号最大化，不是生物 对象的增强的空间定位，也不是生物对象的增强的均匀性。大部分
大的SERS的实例要求分子被直接束縛在SERS表面上，从而提供导 致所述分子/表面(或粒子)复合体的强极化的新的电子状态和光跃 迁。以下情况也是众所周知的通过微小粒子或者通过在类似于诸 如Ag或Au (或者以微小粒子形式或者以微小粒子的集合体的形式) 的金属的自由电子中建立局部静止场或"等离子体"来增强局部电磁 场。已知设计好的物理的Ag或Au结构，诸如光栅或阵列，用以把 入射电磁场耦合到所述对象，以便产生与这些结构的等离子体相关 联的谐振场增强。这些增强的场产生拉曼信号的增强，所述增强与 任何较短程(short range)化学增强结合在一起。在微小粒子的许多 实例中，这些等离子体受到最大限度的约束并且产生大的SERS增 强。
已经在很宽的范围内研究SERS现象并且已经用许多方法来实 现SERS现象，例如举几个例子利用电化学弄糙的表面上的贵金 属Ag和Au、胶体微粒、溶胶-凝胶、淀积材料的微点阵、乳胶球体 和纳米光纤上的覆盖涂层、新型材料纳米制备法、用光刻方法形成 的纳米阵列和均匀光子晶体阵列。至今，声称一个范围很宽的结杲， 列举107至1014的各种不同的高水平的拉曼增强。
生物实体的SERS研究包括把微小纳米粒子引入细胞中，所 述微小纳米粒子可以连附在某些细胞内生物材料上；把胶体微粒连 附到溶液中的生物对象；破坏细胞以便把细胞内容暴露在基片的 SERS活性部位；或者把抗体活性SERS粒子的使用与抗体和SERS 配体两者结合。这样的SERS标记免疫标记粒子可以提供同荧光标 签竟争的拉曼散射强度，具有以下优点与利用荧光标签能够做到 的相比，拉曼将允许同时检测到多得多的标签。用于拉曼标记检定 的这后一种方法的缺点是免疫标记是、一种基于试剂的系统，亦即， 不通用，并且取决于具有正确的免疫标记和正确的化学原理，以侵_
把标签和拉曼配体两者都结合在同一粒子上。它还受以下限制必 须知道目标材料的识别性并且具有用以连附到生物对象中目标材料 上的适当的免疫检定。

发明内容
本公开提供用于将生物对象成像的方法。提供SERS表面，所 述SERS表面具有分布在该表面上的多个增强结构，其中所述表面 包括至少5 x l05nm2的二维区域。在s6kS表面上淀积生物材料。借 助于单色光源照射SERS表面上的生物材料，以便产生拉曼散射光 子。利用二维可调谐滤波器把拉曼散射光子过滤成多个预定的波段。 二维阵列检测器以空间精确方式检测已过滤的拉曼散射光子。将过 滤和检测步骤的结果组合在 一起，以便产生生物材料的多个以空间 精确波长分辨的拉曼图像。在一个实施例中，增强结构均勻地分布 在所述表面上。在另一个实施例中，增强结构的高度、宽度和长度 中的至少一个维度的大小在从lOOnm至lOOOnm的范围内。
在一个实施例中，沿着笫一光路照射SERS表面上的生物材料， 以便产生沿着第二光路的拉曼散射光子，其中第一光路相对于笫二 光路成倾斜角度。
在另一个实施例中，在多个聚焦深度重复所述照射、过滤和检 测步骤，以便产生多个输出信号。组合所述输出信号，以便构成淀 积在SERS表面上的所述生物材料的体积图像。
在又一个实施例中，把SERS表面支撑在透明基片上。
本公开还提供用于将生物对象成像的方法。提供具有以下各项 之一的SERS表面均匀地分布在所述表面上的多个纳米结构；和 均匀地分布在所述表面上的多个细微结构(mesostructure)。在SERS 表面上淀积生物材料。在生物材料SERS表面之间设置试剂。借助 于单色光源照射SERS表面上的生物材料，以便产生拉曼散射光子。 利用二维可调谐滤波器把拉曼散射光子过滤成多个预定的波段。二 维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子。将过滤和检测步骤的结果相结合，以便产生所述生物材料的多个以空间精确 波长分辨的拉曼图像。
本公开还提供用于将对象成像的方法。提供SERS表面，所述 SERS表面具有分布在该表面上的多个增强结构，其中所述表面包括 至少5 x I05nm2的二维区域。在SERS表面上淀积材料，其中所述材 料的长度或宽度中的至少一个维度具有至少600nm的大小。借助于 单色光源照射SERS表面上的所述材料，以便产生拉曼散射光子。 利用二维可调谐滤波器将拉曼散射光子过滤成多个预定的波段。二
维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子。将过滤和 检测步骤的结果相结合以便产生所述材料的多个以空间精确波长分 辨的拉曼图像。在一个实施例中，所述增强结构均匀地分布在所述 表面上。在另一个实施例中，所述增强结构的高度、宽度和长度中 至少一个维度的大小在从i00nm至1000nm的范围内。
本公开提供用作设置在样品(诸如组织、器官或人体部分)上 的诊断探头的设备。所述设备包括单色光源、多个光纤、SERS表面、 二维可调谐滤波器、二维检测器和处理器。所述光纤把基本上单色 的光传送到样品并且接收由所述样品产生的拉曼散射光子。所述 SERS表面位于所述基片的外部。所述SERS表面具有分布在所述表 面上的增强结构，所述表面包括至少5x 105111112的二维区域，而所述 增强结构的高度、宽度和长度中至少一个维度的大小在从lOOnm至 lOOOnm的范围内。二维可调谐滤波器将所述拉曼散射光子过滤成多 个预定的波段。二维检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光 子并且响应所述拉曼散射光子产生多个预定波段的输出信号。处理 器组合二维检测器的输出信号而产生所述样品的多个以空间精确波 长分辨的拉曼图像。


用来提供对本公开的进一步理解并且包含在说明书中并构成说 明书的一部分的

本公开的实施例并且连同以下的描述一起用来解释本^Hf的原理。
附图中
图1图解说明与本公开结合使用的示范性系统；
图2图解说明与^/>开结合使用的示范性系统；
图3图解说明与本^^开结合使用的示范性系统；
图4图解说明具有均匀地分布在整个表面上的细微结构的SERS 表面；
图5图解说明分布在示范性SERS表面上的生物实体，所述SERS 表面具有均匀地分布在整个表面的细微结构；
图6A和6B图解说明拉曼增强的短程增强和长程增强的才莫拟；
图7图解说明本公开的示范性装置；
图8图解说明与本公开结合使用的示范性系统；和
图9是说明本公开的实施例的流程图。
具体实施例方式
下面将详细涉及本^Hf的实施例，附图中图解说明其中的示例。
只要可能，在所有的附图中相同的标号将用来指明相同或类似的部 分。
本公开提供SERS表面，所述SERS表面具有分布在该表面上的 增强结构，其中所述表面包括至少5《105111112的二维区域。在一个实 施例中，所述增强结构的高度、宽度和长度中的至少一个维度的大 小在从100nm至1000nm的范围内。所述表面用于淀积和检测具有 增强的拉曼散射的生物对象。本公开还提供产生淀积在增强结构 SERS表面上的生物材料的具有增强拉曼信号的多个光谱分辨图像和 多个空间分辨光谱的方法。所^均匀SERS表面将以这样一种方式 将拉曼信号增强100-1000倍，即，所述表面在整个区域范围内是均 匀的并且进一步显著地远离所述表面扩展，以便获得大生物对象的 空间精确拉曼图像。与以前可能的结果相比，本公开的方法将显著 地加快生物对象的空间分辨拉曼成像。将在不需要所述生物对象的分子成分的化学标记的情况下完成所述威像。
图1图解说明可以用来执行本公开的方法的系统的一个实施例。
样品100淀积在定位于基片105上的均匀结构的SERS表面102上。 光源110利用多个光子照射样品100,..产生从所述样品散射的拉曼光 子。光源110可以包括任何传统的光源，包括激光器、发光二极管
和其他红外或近红外器件。还可以将光源iio定向或选择光源no， 以便提供对样品的消散照射。
在一个实施例中，把单色光源110放在适当位置以便提供沿笫 一光路113的入射光，第一光路113与样品100成一定角度，与正 交于样品100的光发射相对立，如图1中图解说明的。换句话说，
用来照射样品的辐射不一定要经过传统显微镜(或视场显微镜)的
光学系统，相反，它可以以倾斜的角度从样品100的上面或下面照 射所述样品。光子束112被反射镜115^收并偏转，穿过透镜120。 透镜120可以任选地用来把光线聚焦在样品100上。作为另一方案， 光子束112可以射向样品100而不需要反射镜115。
光子束112中到达样品100的i午多光子照射所述样品并且从所 述样品上或所述样品内的不同位置散射。散射光子被示意地表示为 射束116和118，同时镜面反射光子被示意地表示为射束114。
散射光子被示意地表示为射束116和118,同时镜面反射光子被 示意地表示为射束114。产生沿着第二光路119的散射光子，其中笫 一光路113相对于第二光路119成倾斜角度。
图3图解说明用来执行本公开的方法的系统的另一个实施例。 把单色光源110放在适当位置以便提供沿着正交于样品100的光路 119的入射光。，用来照射样品的入射光经过传统显微镜的光学系统。 把产生的沿着光路119的^L射光子示意地表示为射束116和118。
参见图1，沿着第二光路119设置光学透镜125,以便收集散射 光子。光学透镜125可以用来收集和聚焦接收的光子束。这包括既 收集和聚焦极化光子又收集和聚焦非极化光子。可以通过改变光学
透镜125相对于样品100的位置来改变聚焦深度。 一般说来，样品 大小和所需的放大倍数决定了对光收集光学透镜125的选择。例如， 显微镜可以用来分析亚微米至微米的样-品。对于4交大的样品，可以 使用微距镜头。光学透镜125 (以及透镜120)可以包括筒单的低分 辨率/像差透镜，所述低分辨率/像差透镜具有较大的数字孔径，^Mv而 增大系统的光通过量和工作效率。把反射镜130放在适当位以便将 散射光子束118射向可调谐滤波器140。应该指出，在把可调谐滤波 器设置在样品100上方的配置中，反射镜130的设置是可选的并且 可以是不必要的。
可以在可调谐滤波器140之前设置激光带阻滤波器(rejection filter)135,以便过滤出用射束116表示的弹性散射照射光并且优化系 统的性能。换句话说，阻带滤波器135允许对照射波长下的光子进 行光谱滤波。
进一步参考图1，滤波器140把散射光子变成多个预定的波,殳。 滤波器150可以包括对应于例如以下各种滤波器的可调谐渡波器 电光可调谐滤波器、液晶可调谐滤波器("LCTF')、声光可调谐滤波 器("AOTF')、法布里-珀罗角度调谐滤波器、里奥滤波器、Evans分 束元件液晶可调谐滤波器、Sole液晶可调谐滤波器、光语分集滤波 器、光子晶体滤波器、固定波长法布里-珀罗可调谐滤波器、空气调 谐法布里-珀罗可调谐滤波器、机械调谐法布里-珀罗可调谐滤波器和 液晶法布里-珀罗可调谐滤波器。把滤波器140放在第二光路119中 适当位置。所述多个预定波段包括特定波长或波长范围。在一个实 施例中，所述预定波段包括经受分析的样品的波长特性。可以通过 滤波器140的波长可以在从200nm (紫外区)至2000nm (亦即，近 红外)范围内。滤波器的选择取决于所需的光区域和/或所分析的样 品的特性。选择所述滤波器以便工作在以下光谱范围中的一个或多 个光谱范围紫外线(UV)、可见光和近红外。
在另一个实施例中，所述滤波器可以包括二维光栅色散器，所
述二维光栅色散器包括全息光栅。利用电子束加工光刻来制造所述 全息光栅。可以把光栅制造成实现可见光、紫外、红外或近红外波 长范围内的光镨波长分辨率。把所述光栅制造成在对应于碳氬拉伸
模的2800cm-1至3200cm-1光谱范围的拉曼位移值范围内实现光谱分 辨率。在第二实施例中，把光栅108制造成在对应于500cm"至 2000cm-1的指紋区域的拉曼位移值范围内实现光谱分辨率。在题为" 用于拉曼计算机断析成像光语术的方法"的美国专利申请
No.11/336,588中描述了用作光谱成像工具的计算机层析成像光谱术 ("CTIS"),通过引用将所述专利申请全部包括在本文中。
检测元件的第一二维阵列145 ("第一检测器")以空间精确方式 检测滤波的拉曼^L射光子，以便产生输出到处理器150的输出信号。 第一检测器可以包括数字装置，诸如像焦点平面阵列("FPA")电荷 耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。用 来表征感兴趣的样品的光区域(optical regicm)决定对所述第一二维阵 列检测器的选择。例如，硅电荷耦合器件("CCD")的二维阵列检 测元件可以用于利用可见光波长荧光,和拉曼光语学来进行图像分 析，而砷化镓(GaAs )和砷化镓铟(GalnAs )焦平面阵列(FPA ) 检测器可以用于在近红外波长进行图像分析。对这样的器件的选择 取决于正在被分析的样品的类型。氣一检测器145以空间精确方式 检测通过可调谐滤波器140的散射光子。在一个实施例中，用来形 成检测阵列145的检测元件的第一二维阵列中每一个检测元件用于 检测从所述样品上或所述样品内不同空间位置散射的光子。在一个 实施例中，检测元件的第一二维阵列145产生由可调谐滤波器140 处理的样品的整个视图的数字图像。
检测元件的第二二维阵列117 ("第二检测器")可以包括诸如用 来检测反射光子的CCD或CMOS传感器的数字器件。
图2示意地表示按照本z^开的又一个实施例的系统。更具体地 说，图2示意地示出用于利用低光级以可变放大率成像的高光通量
配置。光学部件的集合类似于图1中图解说明的，但是利用来自样
品100的下侧的照射。
应该指出，在图1和2两者中，都以倾斜的角度照射样品100。 具体地参考图2，光子束113和样品100的平面轴线形成倾斜的角度。 已经发现，通过倾斜的照射，开发了所谓"暗场拉曼成像"。与传统 的亮场拉曼配置相反，暗场拉曼成像消除了图像捕获光学部件与激 发辐射的输送的相互影响。因而，已经把入射辐射的内部散射和衰 减减到最小，以便改善信噪比。此外，把光源安置在光学系统的外 面还允许使用较低成本、较低功率照射光源以及把若干照明光源较 筒单地成本较低地结合到所述系统中。另外，它便于把照射光束耦 合到器件(诸如波导、集成光学部件和微流体器件)中。
在图1、 2和3中所示的每一个实施例中，至少一个处理器150 耦合到图1和2中图解说明的设备的光学装置并且用来控制所述光 学装置，所述光学装置包括透镜120、 125、 135、反射镜115、 130、 可调谐滤波器140;第一检测器145和第二检测器117。处理器150 组合来自可调谐滤波器14Q和第一检测器145的结果，以便产生多 个空间分辨拉曼光谱和/或多个光语分辨拉曼图像。然后利用可以应 用于光谱数据的参考数据库155或统许技术来处理作为结果产生的 空间精确波长分辨的拉曼图像，以便产生关于所述样品的相关生物 信息的图像。
由图1、 2和3中图解说明的示范性系统产生的输出包括三维数 据块或具有在x和y方向的空间维度和z方向的波长或频率的超立 方体。从所述超立方体，可以选择图像平面的每一个像素的多个光 镨用于分析或者可以选择多个以空间精确波长分辨的图像用于分 析。可以通过多变量(化学计量)分析技术(诸如主成分分析法、 主成分回归和部分最小二乘方建;f莫)来分析包含在所述超立方体中
的数据，以便产生化学图像。所述化学图像内的信息包括表征分析 的材料的空间、化学、结构和功能信息。
参照图4，示意解说明具有分布在整个表面的增强结构410 的SERS表面，其中所述表面包括至少5 x 105nm2的二维区域。在一 个实施例中，增强结构均勻地分布在整个所述表面上。在另一个实 施例中，所述增强结构在高度或宽度或长度中的至少一个维度中具 有100-1000nm的大小，所述增强结构均匀地分布在整个所述表面 上。图中示出增强结构的SERS表面，与纳米结构表面420 (所述纳 米结构表面具有0.1至10nm的显著地较小维度的结构)形成对比。 增强结构SERS表面将呈现拉曼信号的、电磁增强和/或化学增强。可 以想像，增强结构SERS表面将具有扩展的等离子体场，以便在离 开所述表面的微米距离上对生物实体的细胞内材料采样。可以通过 调谐入射角度以便光学耦合到所述表面上的较长周期光学或细微结 构来实现对这些扩展的等离子体的激励。可以通过以下方法来制造 所述增强结构电化学或气相淀积、气相合金淀积或賊散、化学(反 应)淀积、化学或电化学蚀刻、金属表面的电化学弄糙法、电子束 曝光(光刻)、半导体光刻制造法、胶体制备法和/或这些工艺过程的 各种不同组合。在一个实施例中，通过蚀刻金属而从合金薄膜制造 所述增强结构。在另一个实施例中，通过对多孔金属薄膜执行电化 学弄糙法来制造所述增强结构。在另一个实施例中，所述增强结构 SERS表面包括金表面。在又一个实施例中，所述增强结构SERS表 面包括银表面。在美国专利公开No.2006/0061762中描述了形成增强 结构SERS表面的方法，通过引用将所述专利全部包括在本文中。
在一个实施例中，把具有分布在所述表面上的多个增强结构的 SERS表面想像为多孔薄膜，所述多孔薄膜在信号增强方面呈现逐点 变化，具有仅仅士 15%的标准偏差。这与具有200 %至200000 %的 逐点变化的先有技术SERS表面形成对比。在另一个实施例中，把 所述增强结构SERS表面想像为具有孔隙区域和金属薄膜区域的金 属薄膜。
参见图5，示意解说明分布在示范性SERS表面上的示范性生物材料520、 530，所述示范性SERS表面具有分布在整个表面505 上的增强结构510。代表性的生物实体、大小和形状包括葡萄^^菌 属 700nm直径球体；大肠杆菌 600 x 2000nm成型棒；炭疽嚢肿 (anthrax cyst) 1000-2000nm成长方形；血细胞~2000 x 8000nm成型 碟；上皮细胞 10000 x 50000nm成平板渍(flat blob)。在一个实施例 中，可以想像，所述结构将在SERS表面的x和y方向上均匀地分 布，使得生物材料的表面与SERS增强结构有基本上均一的接触， 不存在表面结构有缺陷的区域。均匀增强结构SERS表面将在其整 个表面上提供基本上均匀的拉曼信号增强。例如，具有延伸在1000nm 直径范围内的增强结构的均匀结构SERS表面可以用来增强葡萄球 菌属细菌的拉曼"R射信号。例如，具有在x方向上3000nm范围内和 在y方向上1000nm范围内延伸的增彈结构的均匀结构SERS表面可 以用来增强炭疽芽胞(anthrax spore)的拉曼散射信号。如图5中所示， 较大生物实体的电磁增强和/或化学增强将要求与用于绑定在所述表 面上的小分子的电磁场模式不同的电磁场模式。密集的均匀结构 SERS表面的局部电磁场很可能具有足够的电磁增强来探索生物对象 最外层的内部。为了在空间上探索更深的深度，要求图4中所示的 均匀树枝样结构特征的更加扩展的电磁场。在改变入射角时，长程 增强(short range enhancement)和短程增强的比率将变化，因而允 许人们区别SERS增强的这两个成分。
在一个实施例中，所述材料包括组织样品，诸如新鲜或石腊嵌 入的组织的薄的切片。在另一个实施例中，所述样品包括细胞样品， 诸如在细针管吸出(Fine Needle Aspiration )、尿细胞学(urine cytology )、支气管冲洗法(bronchial lavage )、腹膜冲洗法(peritoneal lavage )和子宫颈刮削法(cervical scraping )中按照惯例获得的细胞 样品。在另一个实施例中，所述材料的长度或宽度中至少一个维度 具有至少600nm的大小。
图6A和6B图解"i兌明关于SERS表面的局部短程纳米结构化学增强和弱得多的较长程场增强的拉曼增强的现象才莫拟。如图6A中所 示，最高短程增强取决于微小粒子的强局部场，或者如这里所描绘 的，取决于根据金属部位和分子及其局部电子配置的波函数的重叠 的化学效应。与这样的波函数重叠相关联，这些增强在距离SERS 表面5nm距离处消失。参照图6B,较长增强取决于表面结构的电动 力学及其借助于底层金属或者与其它介质层的相互作用的屏蔽或无
屏蔽。图6B的增强结构的高度或宽度或长度中至少一个维度的大小 在从IOO證至1000nm的范围内。金属的粒子/特征的空间特征(诸 如大小和形状)确定较长程扩展场的长度和屏蔽。图6B示出用于较 长程场增强的两种屏蔽;f莫型，其中，把来自强局部场的电子密度按 比例制图，以便反映借助于基片的不同的屏蔽。这种模拟利用所述 电磁场的屏蔽的等离子体模型。由银光栅结构引起的表面等离子体 的空间扩展是众所周知的并且先前已经观察到其有助于总的SERS 增强。
在一个实施例中，本公开提供用于将水平地设置在整个增强结 构SERS表面上的生物材料成像以便准确找出生物材料内细胞器的 位置并且更精确地检测不同的生物化学制品。所实现的较高的信噪 比("S/N")允许检测这些细胞化学制品的更敏感的变化，所述变化 反映生物化学问题，例如，癌或新陈代谢机能紊乱。在一个实施例 中，在不需要任何特殊的免疫标记剂(agent)的情况下增强不同生物 材料的拉曼信号。
在另一个实施例中，类似地，利用增强结构SERS表面的体积 成像将实现这些生物材料的实际空间坐标以及细胞或其它生物材料 中的它们的分子识别性。通过收集多个聚焦深度的多个空间分辨拉 曼光谱和/或多个光谱分辨拉蔓图像来获得所述体积图像。然后把在 多个聚焦深度产生的输出组合起来，以便构成生物实体的体积图像。 虽然细胞的细胞器内的某些化学制品的自然定位是众所周知，但是， 必须具有用以纟企测化学制品的灵敏度和分辨率。否则，必须从许多
细胞获取这样的材料，以便获得用于逸样的分析的足够的材料，如 果人们仅仅具有用以研究的少量癌细胞，那么这种必要性就成问题。
增强结构SERS表面的距离相关特性将允许重新校准在z方向上在 空间上变化的实际信号电平并且反映遍及所述细胞的这些化学制品 的实际相对浓度。
在又一个实施例中，本公开提供这样的表面可以预计该表面 在SERS表面生物实体界面具有试剂储器。这种表面将允许进行宽 范围的细胞膜和细胞新陈代谢研究，包括细胞膜处理法以及细胞膜 化学组成和性质。由于极薄的脂双层层( 60nm)的缘故，至今难 以研究这种界面及其特性，所述脂双层层包括这种膜以及存在于其 中的少量细胞生物化学制品。还可以预计，用于局部和扩展的增强 的既具有细微结构(在至少一个维度上具有100nm至1000nm大小) 又具有纳米结构(在至少一个维度上具有lnm至10nm大小)的SERS 表面结构允许对任一种结构或两种结构进行采样。
在另一个实施例中，本公开预计利用增强结构SERS表面既辨 别局部生物实体又辨别更远的生物实体。通过改变和选择入射光的 角度，人们可以调谐结果场，以便探索生物对象的膜上或更远离它 的局部束缚结构。釆样距离的这种差异实质上利用长程和短程增强， 所述长程和短程增强可以由以偏离法向入射激励的不同的等离子体 产生。此外，入射光的角度调制可以允许两个区域的比较和这些不 同信号贡献的直接比较，从而允许更清晰地描绘每一个信号。这种 信号调制法是广为人知的并用来分离信号，并且称为微分调制或"锁 相检测"。
在另 一个实施例中，本公开预计在透明基片上制造具有增强结 构SERS表面的装置。参照闺7，装置710包括单色光源712、多个 光纤714、 SERS表面715、增强扩展场716、透明基片717、 二维可 调谐滤波器718、 二维检测器720和处理器722。光纤714把基本上 单色的光传送到样品并且接收由所述样品产生的拉曼散射光子。SERS表面716具有分布在基片表面717外面的结构，其中所述表面 包括至少5x 105111112的二维区域。在一个实施例中，所述结构均匀地 分布在整个所述表面上。在另一个实施例中，所述增强结构的高度 或宽度或长度中至少一个维度的大小在从100nm至1000nm的范围 内。二维可调谐滤波器718将拉曼散射光子过滤成多个预定波段。 二维检测器720以空间精确方式检测已滤波的拉曼散射光子并且响 应多个预定波段中的拉曼散射光子而产生输出信号。处理器722组 合所述二维检测器的输出信号，以便产生所述样品的多个以空间精 确波长分辨的拉曼图像。装置710允许后向散射几何结构中的照射 和拉曼收集的投影模式，所述后向散射几何结构允许对其上设置探 头的固体对象的照射和检测。如图7中图解说明的，多个光纤714 传送和收集所述照射和拉曼散射光。在一个实施例中，所述装置可 以用作外科手术期间设置在或压入组织的主体部分的接触探头，用 以确定特定的分子特性。在另一个实施例中，所述装置可以用作便 携式传感探头，用以检测毒性粉末或液体。
在又一个实施例中，想像具有软柔韧基片上的SERS表面的装 置，所述软柔韧基片允许用于手持装置(handle held units)的一次 性采样头。或者具体地说，用作一次性探头，所述一次性探头在病 人使用之后可以被废弃。这种装置的使用将既提供信号增强又提供 一次性使用在病人身上的可废弃表面。对于这样的病人应用，还希 望在可能接触到病人的生物材料的外SERS表面上具有光学透明保 护层。所述保护覆盖层可以保护所述SERS表面免受环境引起的损 坏。理想的是，所述保护层应当是薄的，以便将感兴趣的材料与SERS 粗糙特征的隔离减到最小。保护层还应当具有简单的拉曼光谱，以 避免混淆来自感兴趣的材料的拉曼信号,。
在另一个实施例中，可以想像增强结构SERS表面可以用于与 蛋白质手性相关联的较弱的拉曼特征和拉曼旋光性(optical activity)的 测量。拉曼手性虽然具有极微弱的信号，但是可以提供关于蛋白质
折叠的独特和新颖的信息。把这样的测量加速一千倍将能够使过去 花费一个星期的测量变成花费10分钟。或者，在一定区域范围内产 生拉曼增强的能力可以允许测量空间分辨拉曼旋光性。这可以允许 准确找出细胞中出现异常拉曼旋光性的位置。另外，还可以利用允 许亚细胞级分子分离度这样的表面不仅在细胞中而且在特定的细胞 器中更有效地检测错误的蛋白质折叠。这些蛋白质折叠问题形成若 干疾病(诸如老年性痴呆症和疯牛病)的基础。由于需要维持拉曼 旋光性的圓极化的缘故，周期性结构将很可能抑制拉曼信号。可以 想像，随机结构将不会干扰或显著降低来自这样的表面的圆极化拉 曼的测量值。
在又一个实施例中，预计在基于拉曼光谱学的生物材料研究中
由于利用本公开的增强结构SERS表面增强信号电平的可能性导致 减少激光功率、数据采集时间和/或提高灵敏度。在又一个实施例中， 预计在各种各样基于光谱学的生物材料研究中减少激光功率或数据 采集时间。
参照图8,本公开的实施例图解说明用于将淀积在增强结构SERS 表面810上的样品820成像的可变角度系统。所述样品和SERS表 面净支支撑在沿着平面805设置的基片上。利用单色光源沿着光路840 照射样品820。光路840处于相对于基片平面805非90°角的照射845 的第一角度。照射845的角度可以从相对于基片平面约0°变化到相 对于所述基片平面89° 。
在一个实施例中，本公开把图8中图解说明的系统用于在照射 的变化角度测量来自淀积在细微结构的SERS表面上的样品的空间 和光谱信息。参照图9,图中示出说明本^^开的方法的流程图。在步 骤910中，利用单色光沿着光路照射所述样品，产生拉曼散射光子， 其中所述光路处于照射的第 一角度，其中所迷照射的第 一角度是相 对于所述基片平面的非90°的角度。在步骤920，把拉曼散射光子 过滤成多个预定的波段。波段在步骤930，以空间精确方式检测已过滤的拉曼散射光子。在步骤940,产生所述样品的多个第一以空间精 确波长分辨的图像。在步骤950,利用单色光沿着光路照射所述样品， 产生拉曼散射光子，其中所述光路处于照射的第二角度，其中所述 照射的第二角度是相对于所述基片平面的非90°的角度。然后重复 步骤920、 930和940，以便产生多个第二以空间精确波长分辨的图 像。在步骤960，把多个第一以空间精确波长分辨的图像和多个第二 以空间精确波长分辨的拉曼图像相比。
可以以其它特定的形式来实施本公开而不脱离本公开的精神或 基本特性。因此，应当提到在本公开的范围内表示的后附的权利要 求书，而不是上述说明书。虽然上面的描述针对本公开的优选实施 例，但是，应该指出，其它变化和修改对于本专业的技术人员来说 是显而易见的并且可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下进行 这些变化和^f务改。
权利要求
1.一种方法，包括a)提供SERS表面，所述SERS表面具有分布在该表面上的多个增强结构，其中所述表面包括至少5×105nm2的二维区域；b)在所述SERS表面上淀积生物材料；c)借助于单色光源照射所述SERS表面上的所述生物材料，由此产生拉曼散射光子；d)将来自所述区域的所述拉曼散射光子过滤成多个预定波段；e)借助于二维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子；和f)将过滤和检测的结果组合以便产生所述生物材料的多个光谱分辨拉曼图像。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构均匀地分布在 所述表面上。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构的高度、宽度 和长度中至少一个维度的大小在从100nm至1000nm的范围内。
4. 一种方法，包括a) 提供SERS表面，所述SERS复面具有分布在该表面上的多 个增强结构，其中所述表面包括至少5 x 10SnmS的二维区域；b) 在所述SERS表面上淀积生物材料；c) 借助于单色光源照射所述SERS表面上的所述生物材料，由 此产生拉曼散射光子；d) 将所述拉曼散射光子过滤成多个预定波段；e) 借助于二维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射 光子并产生输出信号；f) 通过重复步骤a-e，在多个聚焦深度上收集淀积在所述SERS 表面上的所述生物材料的输出信号；和 g)组合所述收集的输出信号，以便构成淀积在所述SERS表面 上的所述生物材料的体积图像。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构均匀地分布在 所述表面上。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构的高度、宽度 和长度中至少一个维度的大小在从100nm至1000nm的范围内。
7. —种方法，包括a) 提供SERS表面，所述SERS表面具有分布在该表面上的多 个增强结构，其中所述表面包括至少105111112的二维区域；b) 在所述SERS表面上淀积生物材料；c) 借助于单色光源沿着第一光路照射所述SERS表面上的所述 生物材料，由此产生沿着第二光路的拉曼散射光子，其中所述第一 光路相对于所述第二光路成倾斜角度；d) 将所述拉曼散射光子过滤成多个预定波段；e) 借助于二维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子；和f) 将过滤和检测的结果组合以便产生所述生物材料的多个光谱 分辨拉曼图像。
8. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构均匀地分布在 所述表面上。
9. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构的高度、宽度 和长度中至少一个维度的大小在从100nm至1000nm的范围内。
10. —种方法，包括 ，a) 提供SERS表面，所述SERS表面具有以下各项之一分布 在所述表面上的多个纳米结构和分布在所述表面上的多个细微结 构；b) 在所述SERS表面上淀积生物材料；c) 在所述生物材料和所述SERS表面之间设置试剂；d) 借助于单色光源照射所述SERS表面上的所述生物材料，由 此产生拉曼^:射光子；e) 将所述拉曼散射光子过滤成多个预定波段；f) 借助于二维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子；和g) 将过滤和检测的结果组合以便产生所述生物材料的多个光谱 分辨拉曼图像。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述纳米结构的高度、宽 度和长度中至少一个维度的大小在从O.lnm至10nm范围内，而所 述细微结构的高度、宽度和长度中至少一个维度的大小在从100nm 至1000nm范围内。
12. —种方法，包括a) 提供SERS表面，所述SERS表面具有分布在该表面上的多 个增强结构，其中所述表面包括至少5 x 105111112的二维区域；b) 在所述SERS表面上淀积生物材料；c) 借助于单色光源照射所述SERS表面上的所述生物材料，由 此产生拉曼散射光子，所述照射光源位于透明基片的前面；d) 经由光学透镜收集所述拉曼散射光子，其中所述光学透镜位 于所述透明基片的后面；e) 将所述拉曼散射光子过滤成多个预定波段；f) 借助于二维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子；和g) 将过滤和检测的结果组合以便产生所述生物材料的多个光谱 分辨拉曼图像。
13. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构均匀地分布在 所述表面上。
14. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构的高度、宽 度和长度中至少一个维度的大小在从100nm至1000nm的范围内。
15. —种方法，包括a) 提供SERS表面，所述SERS表面具有分布在该表面上的多 个增强结构，其中所述表面包括至少5 x 105111112的二维区域；b) 在所述SERS表面上淀积材料，其中所述材料的长度或宽度 中至少一个维度至少为600nm;c) 借助于单色光源照射所述SERS表面上的所述材料，由此产 生拉曼散射光子；d) 将来自所述区域的所述拉曼散射光子过滤成多个预定波段；e) 借助于二维阵列检测器以空间精确方式检测过滤的拉曼散射 光子；和f) 将过滤和检测的结果组合以便产生所述材料的多个光语分辨 拉曼图像。
16. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构均匀地分布在 所述表面上。
17. 如权利要求1所述的方法，其中所述增强结构的高度、宽度 和长度中至少一维度的大小在从100nm至1000nm的范围内。
18. —种设备，包括 单色光源；多个光纤，其中所述光纤把基本上单色的光传送到样品并且接 收由所述样品产生的拉曼散射光子； 透明基片；SERS表面，所述SERS表面具有分布在该表面上的增强结构， 其中所述表面包括至少5 x 105111112的二维区域并且所述增强结构的高 度、宽度和长度中至少一个维度的大小在从100nm至1000nm的范围内；可调谐滤波器，用于将所述拉曼"R射光子过滤成多个预定波段； 二维检测器，用于以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子并 且响应多个预定波段中的所述拉曼散射光子而产生输出信号；处理器，所述处理器将所述二维检测器的所述输出信号组合以 便产生所述样品的多个光谱分辨拉曼图像。
全文摘要
用于将生物对象(100)成像的方法和设备。提供SERS表面(102)，所述表面具有均匀地分布在该表面上的增强结构。所述表面包括至少5×10⁵nm的二维区域。所述增强结构的高度、宽度和长度中至少一个维度的大小在从100nm到1000nm的范围内。在SERS表面(102)上淀积生物材料(100)。利用单色光源(110)照射SERS表面上的生物材料以便产生拉曼散射光子。利用可调谐滤波器(135)将拉曼散射光子过滤成多个预定的波段。二维阵列检测器(145)以空间精确方式检测过滤的拉曼散射光子。将过滤和检测步骤的结果组合以便产生生物材料的多个光谱分辨拉曼图像。
文档编号G01J3/44GK101198847SQ200680021059
公开日2008年6月11日 申请日期2006年4月14日 优先权日2005年4月14日
发明者D·塔谢尔, J·S·迈尔, J·德穆思, P·J·特里多 申请人:化学影像公司