专利名称：荧光图像检测装置以及荧光图像检测方法
技术领域：
本发明涉及一种使用荧光检测的生物光学成像(bioluminescence imaging)技术。
背景技术：
对生物体中、细胞中的分子种(molecular species)如何分布进行成像的方法是医学、生物学的重要研究方法。在细胞等级广泛应用着如下方法使用显微镜，利用附着有荧光色素的分子探针、使用基因发现分子探针来将分子种进行图像化。另外，要求如下一种装置针对比细胞等级更大的脏器、甚至动物个体，在仍存活的状态下观察所关注的分子种分布的样子。例如如下技术通过使荧光探针与小鼠等个体中的癌细胞相结合来将所关注的癌细胞增殖的样子进行图像化，观察每天或者每周的随时间变化。在以往的用于细胞等级的测量装置中，为了观察动物个体内部的癌细胞的增殖，通过杀死动物对规定的部分染色或者附着荧光体来进行观察，但是这样就无法对一个个体长时间地观察细胞的随时间增殖。 由于该原因，期望开发一种能够在个体仍存活的状态下观察小动物个体的内部信息的分子种的装置。
发明内容
发明要解决的问题
图10是表示典型的荧光图像检测装置的一例的图。该装置是如下装置将来自光源16的光中的由激励侧滤波器Il(Fex)选择的波长的光作为激励光照射到生物体试样，利用荧光侧滤波器12 (Fm)取出来自该生物体试样的散射光中的荧光成分，利用成像透镜32在作为二维检测器的CXD照相机38上成像，由此得到试样的荧光图像。在这样的装置中，在对试样照射激励光时，从所关注的荧光分子发射波长与激励光不同的、通常波长比激励光长的光，因此，如果安装完全遮断激励光的波长成分的滤波器作为从试样至二维检测器38之间的荧光侧滤波器12，则能够以高灵敏度地检测荧光波长成分。但是，实际上，照射到试样的激励光的光谱中往往包含较少波长与荧光成分相同的光(还称为杂散光)，该杂散光在试样上进行反射而与从试样发出的荧光重叠，从而使荧光的检测边界恶化。另外，相反如果照射到试样的激励光完全不包含杂散光，荧光侧滤波器的能力不足而也没有完全去除激励光的波长成分，则在试样上反射的激励光成分的一部分透过荧光侧滤波器而与来自试样的荧光成分重叠，从而使荧光的检测边界恶化。当荧光的检测边界较差时微弱的荧光被噪声掩盖，从而无法清楚地捕捉图像。在生物体试样的关注部分附着荧光色素而观察的情况下，当关注部分处于生物体试样的中心附近即从表面远离的位置时，相应地从生物体试样的表面捕捉到的荧光的强度变弱。当荧光的检测边界较差时，无法清楚地捕捉这样微弱的荧光成分。因此，本发明的目的在于提供一种荧光图像检测装置，提高荧光的检测边界而也能够高灵敏度地检测微弱的荧光。用于解决问题的方案图11是表示在图10的荧光图像检测装置中试样所包含的荧光色素的激励光谱 45和荧光光谱46以及与这些激励光谱45和荧光光谱46相对应地选择的激励侧滤波器 11 (Fex)的透过特性41和荧光侧滤波器12 (Feffl)的透过特性42的图。将激励侧滤波器11的透过波长频带选择为被包含于表示激励光谱45较强的强度的波长范围内。因为荧光光谱 46移位到波长比激励光谱45长的波长侧，所以与之相对应地选择荧光侧滤波器12的透过特性42以使其移位到波长比激励侧滤波器11长的波长侧。图12是表示激励侧滤波器Frai、荧光侧滤波器Fm的具体透过特性的一例的图表。 在该图表中，横轴表示波长(nm)，纵轴表示透过率(对数)。纵轴的透过率是指1(表示为 1.E+00)最大、即100%的透过。作为激励侧滤波器Fra、荧光侧滤波器Fail而使用的滤波器一般为多层膜干涉滤波器。多层膜干涉滤波器为如下滤波器通过在透明的支承体上交替层叠几十层折射率不同的两种电介质薄膜的多层膜结构，从而仅使期望波长的光通过而遮挡(反射)剩余波长的光。在图12中，激励侧滤波器Fex为在630nm 690nm中具有透过波长频带的带通滤波器(透过波长频带的宽度Δ λ )。如果针对该激励侧滤波器Frai观察透过波长频带的透过率，则能够达到90%左右而足够高，不存在问题；但是在要遮挡光的波长域中也存在 2X10_6(将X10_6表示为E-06)左右的透过率，即在透过波长频带以外的波长域中存在漏光。将该激励侧滤波器Fra的漏透过率设为“tra”。另一方面，荧光侧滤波器Fem为在730nm 780nm中具有透过波长频带的带通滤波器(透过波长频带的宽度Δ λΜ)。如果针对该荧光侧滤波观察透过波长频带的透过率，则能够达到90%左右而足够高，不存在问题；但是在要遮挡光的波长域中也存在 IX 10_5左右的透过率，即在透过波长频带以外的波长域中存在漏光。将该荧光侧滤波器Fm 的漏透过率设为“tem”。参照图13研究在图10的例子中使用图12的滤波器Fex(透过特性41)、Fem(透过特性4 并使用碘钨灯那样的连续波长光源作为光源16的情况。如图13的(a)所示，将来自光源16的光强度假设为在整个波长上均勻的I (mW/ nm)。如果为了简化而将Frai的透过波长频带的透过率视作1 (100% )，则从激励侧滤波器Fra 的透过波长频带透过的激励光强度在图中相当于面积，因此该强度为I · Δ λ ex (mff)。当假设试样是完全不发出荧光而使激励光原样散射的白色散射体时，投向荧光侧滤波器Fm的散射光的强度为I · Δ λ ex · kk为投向荧光侧滤波器Fem的散射光的比例。如果将漏光相对于入射到荧光侧滤波器Fem的散射光的比例设为总漏率LF (LF =Leak Factor)，则到达二维检测器38的漏光的强度为I · Δ λ p . k · LF
由于假设试样不发出荧光，因此如果LF = 0则CXD照相机38拍摄全黑的图像。由于k是固定的，因此为了估计LF，等同于如下情况如图13的(b)所示，在来自光源16的光的行进方向上串行排列激励侧滤波器11和荧光侧滤波器12，评价被包含于荧光侧滤波器12的透过光中的漏光的比例。即，考虑设为k = 1即可。在图13的(b)的配置中，当测量来自荧光侧滤波器12的漏光的光谱时，检测出图 13的(c)的两个波长成分的山形Sex、Sem。图左侧的成分Sex是相当于激励光的波长的光由于荧光侧滤波器12的能力不足没有被完全遮挡而漏掉的成分，如果使用荧光侧滤波器12 的漏率tM则形成如下公式Sex = I · Δ λ · tem图右侧的成分Sem可以说是由于激励侧滤波器11(漏率=tex)的能力不足而有 I · tex的强度的光到达荧光侧滤波器12，而其中处于荧光侧滤波器12的透过波长频带 Δ Aem内的波长的光是原样透过(由于设定为透过波长频带的透过率=1)荧光侧滤波器 12的成分。因而，形成以下公式Sem = I · Δ λ em · tex入射到二维检测器38的最终漏光的强度为上述激励波长中的Sex与荧光检测波长中的Sem之和。因而，总漏率LF为漏光相对于入射到荧光侧滤波器Fem的散射光的比例，因此能够定义为如下公式LF= (Sem+Sex)/(I · Δ λεχ)= (tem· Δ Xex+tex· Δ λ )/Δ λεχ (1)如果激励侧滤波器11与荧光侧滤波器12的透过波长频带的宽度Δ λ 与Δ λ Μ 大致相同，则形成如下公式。LF = teffl+texS卩，如果两个滤波器11、12的漏率tex、tem都为1X10_5左右，则由于总漏率LF为两个滤波器11、12的漏率之和，因此不会降低到该总和以下。此外，一般作为激励侧滤波器、 荧光侧滤波器而使用的多层膜干涉滤波器的漏率通常为1X10_6左右，较佳的为1X10_7左
右O如上所述，在荧光图像检测装置中需要区分滤波器本身的漏率与包含光源的总漏率来进行讨论，但是目前没有根据这样的观点来区分两者的记载。本发明提出一种进行该区分而降低总漏率的方法。即本发明的主要目的在于提供一种荧光图像获取装置，其使用具有与当前得到的性能相同程度的性能的滤波器作为滤波器但与以往相比降低总漏率LF。本发明的荧光图像获取装置具备激励光源，其激励试样的荧光；二维检测器，其用于检测从试样发出的荧光；激励侧滤波器，其被配置于光源至试样之间；以及荧光侧滤波器部，其被配置于试样至二维检测器之间，取出从试样发出的荧光来引导到上述二维检测器。并且，激励侧滤波器具有透过波长频带，该透过波长频带阻止上述荧光侧滤波器部的透过波长域的光。荧光侧滤波器部包括多层膜干涉滤波器和吸收滤波器，将这些多层膜干涉滤波器和吸收滤波器串行排列在荧光的行进方向上。这些多层膜干涉滤波器和吸收滤波器组合成在荧光侧滤波器部的透过波长域中包含荧光波长的至少一部分波长并且不包含激励侧滤波器的透过波长频带。即，作为确保激励侧滤波器与荧光侧滤波器相互不共用透过波长域的方法，使多层膜干涉滤波器和吸收滤波器作为荧光侧滤波器而双重地发挥功能。在该荧光图像检测装置中，使用降低由荧光侧滤波器引起的漏光强度Sra的方法。 即，除了目前使用的多层膜干涉滤波器以外还使用串行配置吸收形滤波器(还简称为吸收滤波器)来作为荧光侧滤波器部而得到“吸收滤波器备用法”。当设为多层膜干涉滤波器的漏率例如为1XIO-5时，如果配置吸收滤波器而漏率降低三位，则能够实现1XIO-8总漏率 LF。吸收滤波器例如为市场上销售的廉价“着色玻璃滤波器(colored glass filter)”。该滤波器在透明的玻璃中溶解吸收光的物质而在该吸收部分遮挡光的透过。也可以不使用玻璃而使用透明的树脂或者根据波长在石英中溶解期望的吸收物质并使之凝固来得到该滤波器。以后说明理由，将相同种类的多层膜干涉滤波器作为备用滤波器而使用，也无法使漏率降低，与此相对，通过将多层膜干涉滤波器与性质不同的吸收滤波器组合，有效利用两者的特征则能够大幅降低由两者漏率的乘法运算而得到的漏率。本发明的特征在于，找出上述特性，实现总漏率LF的大幅降低，提高荧光图像检测装置的荧光检测精度。在此，优选激励侧滤波器的透过波长频带中的吸收滤波器的透过率为10%以下。 这是指吸收滤波器的漏率为0. 1 (IX 10—1)以下，如果吸收滤波器的漏率为0. 1以下，则通过与多层膜干涉滤波器进行组合能够降低总漏率一位以上。根据以后的说明可知，即使将漏率为1 X 10_5左右的多层膜干涉滤波器作为备用滤波器而使用，总漏率仅被降低一位左右。 与此相对，与使用多层膜干涉滤波器作为备用滤波器的情况相比，通过使用漏率0. 1以下的吸收滤波器能够大幅降低总漏率。在本发明中，优选还使用与激励侧滤波器的透过波长频带相比发射波长频带更窄的光的单波长光源作为光源。由此，根据以下理由能够实现降低由激励侧滤波器引起的漏光强度s 。在这种情况下，当处于与激励光的主波长(是指单波长光源的放射能量所集中的波长域)不同的波长域的荧光侧滤波器的透过波长域的光源放射光强度，在将连续光源的放射强度设定为1时例如为IX 10_4左右时，即使激励侧滤波器的漏率为IX 10_5左右，来自激励侧滤波器的漏率的强度也为1X10_9左右。即，如果代替连续光源而使用单波长激励光源，则在从光源发射的光中几乎不包含荧光侧滤波器的透过波长频带的光，因此从激励侧滤波器漏光的荧光侧滤波器的透过波长频带的光大幅降低，从而实质上漏率降低。根据图13 图16进一步详细说明能够实现上述情况的理由。在图13的(c)中，tem相当大，因此Sex显出明显大。追加吸收滤波器13的方法 (参照图14的(b))对降低这些具有效果。在吸收滤波器13的透过特性43(参照图14的 (a))中在激励侧滤波器11的透过波长频带Δ λ M中透过率较小。将该透过率设为ta，例如设为ta = 0.001 (IX 10_3)。于是，通过图14的(c)示出的吸收滤波器13之后的由荧光侧滤波器12、13引起的漏光强度Sra形成如下公式，Sex = I · tem · ta · Δ λ ex = L · tem · ta (2)与图13的(c)的漏光强度Sex相比仅减小系数、的量。在此，设为I · Δ λ ex (光源强度)=L0根据图14的(c)可知，通过追加吸收滤波器13，Sex已降低但是Sem几乎没有降低。 这是因激励侧滤波器11中存在荧光侧滤波器的透过波长域Δ 内的漏光引起的。在降低Sem时，利用钨丝灯那样的连续光源16代替图15示出的主波长频带较窄的光源(单波长光源)15效果较好。典型的单波长光源可举出发光二极管(LED)、半导体激光器(LD)。以单波长光源15的放射光谱51中的主波长带51a(将波长宽度记述为Δ Als)进入到激励侧滤波器11的透过波长频带△ λ 中的方式选择单波长光源15与激励侧滤波器11的组合。但是，虽说是单波长光源，但是正确地说不仅在中心部的较强放射部分(主波长带)51a中而且在其拖尾部分中也伴随着微弱发光。该拖尾部分与来自激励侧滤波器11的漏光Srai有关。当将单波长光源的主波长带的放射强度即激励光强度设为L(= IX Δ λ LS), 将系数f乘以I而以[I · f]表示拖尾部分的放射强度时，由激励侧滤波器11引起的漏光强度Sm形成如下公式。
权利要求
1.一种荧光图像检测装置，具备 激励光源，其激励试样的荧光；二维检测器，其用于检测从上述试样发出的荧光； 激励侧滤波器，其被配置在上述光源与试样之间；以及荧光侧滤波器部，其被配置在上述试样与二维检测器之间，用于取出从试样发出的荧光而引导到上述二维检测器，上述激励侧滤波器具有阻止上述荧光侧滤波器部的透过波长域的光的透过波长频带， 上述荧光侧滤波器部包括干涉滤波器和吸收滤波器，上述干涉滤波器和吸收滤波器被串行配置在上述荧光的行进方向上，上述干涉滤波器和吸收滤波器被组合成在它们组合得到的透过波长域中包含荧光波长的至少一部分波长并且不包含上述激励侧滤波器的透过波长频带。
2.根据权利要求1所述的荧光图像检测装置，其特征在于，上述吸收滤波器在上述激励侧滤波器的透过波长频带中的透过率为10%以下。
3.一种荧光图像检测装置， 上述激励光源为单色激励光源，上述激励侧滤波器的透过波长频带使上述单色激励光源的主波长的光透过， 构成上述荧光侧滤波器部的吸收滤波器在上述单色激励光源的主波长的波长域中具有10%以下的低透过率。
4.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，上述光源为发射以785nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的 50%透过波长在800nm 860nm的范围内。
5.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，上述光源为发射以690nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的 50%透过波长在720nm 780nm的范围内。
6.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，上述光源为发射以658nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的 50%透过波长在690nm 740nm的范围内。
7.根据权利要求3所述的荧光图像检测装置，其特征在于，上述光源为发射以808nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的 50%透过波长在820nm 870nm的范围内。
8.一种荧光图像检测方法，利用荧光图像检测装置来检测荧光图像，该荧光图像检测装置具备如下部分激励光源，其激励试样的荧光；二维检测器，其用于检测从上述试样发出的荧光；激励侧滤波器，其被配置在上述光源与试样之间；以及荧光侧滤波器部，其被配置在上述试样与二维检测器之间，用于取出从试样发出的荧光而引导到上述二维检测器，该方法使用具有如下透过波长频带的滤波器作为上述激励侧滤波器，该透过波长频带阻止上述荧光侧滤波器部的透过波长域的光，将干涉滤波器和吸收滤波器串行配置在上述荧光的行进方向上作为上述荧光侧滤波器部，使用如下组合得到的上述干涉滤波器和上述吸收滤波器在它们组合得到的透过波长域中包含荧光波长的至少一部分波长并且不包含上述激励侧滤波器的透过波长频带。
9.根据权利要求8所述的荧光图像检测方法，其特征在于，使用单色激励光源作为上述激励光源，使用具有如下透过波长频带的滤波器作为上述激励侧滤波器，该透过波长频带使上述单色激励光源的主波长的光透过，使用在上述单色激励光源的主波长的波长域中的透过率为10%以下的滤波器作为上述荧光侧滤波器部的上述吸收滤波器。
10.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，上述激励光源为发射以785nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50%透过波长在800nm 860nm的范围内。
11.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，上述激励光源为发射以690nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50%透过波长在720nm 780nm的范围内。
12.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，上述激励光源为发射以658nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50%透过波长在690nm 740nm的范围内。
13.根据权利要求9所述的荧光图像检测方法，其特征在于，上述激励光源为发射以808nm士 IOnm为峰值波长的光的半导体激光器，上述吸收滤波器的50%透过波长在820nm 870nm的范围内。
14.根据权利要求9、10或者13所述的荧光图像检测方法，其特征在于，上述试样包含吲哚花青绿作为荧光色素。
全文摘要
本发明提供一种荧光图像检测装置以及荧光图像检测方法，为了降低与荧光图像检测装置的检测能力有关的漏光，将荧光侧滤波器部的干涉滤波器和吸收滤波器串行配置在荧光的行进方向上。在此所使用的干涉滤波器和吸收滤波器使相当于荧光的波长频带的光充分透过并且遮蔽相当于照射到试样的激励光的波长频带的光。
文档编号G01N21/64GK102159936SQ20088013118
公开日2011年8月17日 申请日期2008年9月18日 优先权日2008年9月18日
发明者小田一郎, 樋爪健太郎, 矢岛敦, 纲泽义夫 申请人:株式会社岛津制作所