c-Jun参与经典Wnt信号转导途径的新功能的制作方法

专利名称：c-Jun参与经典Wnt信号转导途径的新功能的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及经典Wnt信号转导途径中的相互作 用蛋白及其用途。
背景技术：
信号转导是生物学研究的前沿领域之一，近年来发现在不同种族个体间， 存在一个非常保守的信号通路，它的信号分子是一类糖蛋白超家族一一Wnt蛋 白，故称其为Wnt信号转导途径。Wnt信号分子家族在人种属中包括19个成员， 目前发现不同的Wnt分子引起的信号反应有所差异，分为经典的Wnt信号转导 途径(Wnt/P -连环蛋白(catenin))，例如Wnt3和Wnt8，及非经典Wnt信号转 导途径(Wnt/Ca"和Wnt/JNK途径)，例如Wnt 11和Wnt5a。其中对经典Wnt信号 途径研究较多。
经典Wnt信号转导途径控制了许多生命过程，这些过程包括生物体的生长、 发育、疾病、衰老与死亡等等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、 应激、细胞癌变与细胞凋亡等等。经典Wnt信号转导途径在不同物种之间具有 高度的保守性，通过对果蝇、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已经大体确立了 经典Wnt信号转导途径的分子框架。发育过程中，特定的时间和特定的环境诱 导下，某些组织或细胞群体分泌Wnt蛋白，结合受体巻曲蛋白(Frizzled)家族 成员，和共受体低密度脂蛋白LRP5/6,将信号传递至细胞内。在没有Wnt信号 刺激时，这条信号转导途径的关键分子P-连环蛋白((3-catenin)参与由Axin， 结肠癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3(5(GSK3(3)，酪蛋白激酶1 (CK1)，以及 (3-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白质复合物，在GSK3(3和CK1作用下受到磷酸化标 记，进而在p-TrCP蛋白介导的泛素化修饰后被蛋白酶体降解。在Wnt信号刺激 下，胞内的Dishevelled (Dvl)和Frat等Wnt途径的正向调节分子抑制了 Axin、 APC和GSK3(3等蛋白对(3-连环蛋白的降解，促使(J-连环蛋白在细胞质中大量积 聚。部分(5-连环蛋白进入细胞核，与核内的含有HMG-Box的转录因子-淋巴细胞增强因子1/ T细胞转录因子(LEF1/TCF)家族的相互作用，启动下游靶基因 的开放。
Wnt信号转导途径不仅影响胚胎发育中的体轴诱导、胚层建立、体节分化、 组织或器官形成等一系列重要的早期事件，参与体细胞的分化和极化；而且在 成体中Wnt信号途径的异常活化已经证明与多种肿瘤的发生密切相关。研究发 现，大约90呢的结肠癌都是由于Wnt信号转导途径的激活性突变而引起的，此 外Wnt信号途径的异常活化还与一系列的肿瘤发生有关，比如小肠腺瘤、肝癌、 胃癌、食道腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌中均发现了 Wnt信号异常或者是转导 途径中信号分子的突变。因此对Wnt信号转导途径的分子机制的研究和理解， 有助于在治疗肿瘤中寻找新的药物靶点和理论依据具有重要意义。
经典Wnt信号转导途径的生物学功能主要是通过下游耙基因的表达而得以 实现。而很多靶基因比如c-myc、 cyclinDl，在细胞增殖中起到重要作用。研
究表明，在很多癌症细胞里可以检测到e-连环蛋白在细胞核中的大量积累以
及c-myc、 cyclinDl的高表达，说明这些肿瘤细胞中Wnt信号转导途径下游的 转录复合物处于高转录活性状态。因为转录复合物的活性高低直接关系到Wnt 信号效应，因此对转录复合物的分子调控机制的研究具有十分重要的意义。
c-Jun蛋白最初是作为一种原癌蛋白在鸟恶性肉瘤病毒17中被发现的。在 细胞中广泛地参与基因的转录调控。大量的实验已经表明由c-Jun蛋白和Fos 蛋白异源二聚形成的AP-1转录因子对细胞癌化具有正向调控作用。例如，c-Jun 蛋白在皮肤瘤和肝肿瘤的增殖过程中有着重要的作用，在基底层角化细胞中用 c-Jun蛋白的一个显形负突变c-Jun(T屈67)来降低c-Jun/AP-1的活性或者在 肝细胞中选择性失活c-Jun蛋白分别对化学诱导的刺瘤和肝肿瘤的增殖有抑制 作用。
己有研究发现，经典Wnt信号途径中的(3-连环蛋白/TCF转录复合物与c-Jun 存在相互作用并且这一相互作用在肠癌形成过程中有着重要的作用。被JNK磷 酸化后的c-Jun和TCF-4发生相互作用从而使得c-Jun基因启动子区域的TCF和 c-Jun结合位点相互靠近，开启下游基因的转录。但是对c-Jun对依赖(3-连环 蛋白/TCF转录复合物的Wnt信号下游靶基因的转录尚不清楚。
综上，尽管目前对经典Wnt信号途径有所了解，同时有报道c-Jun可以和 P-catenin/TCF形成转录复合物，然而对于c-Jun参加经典Wnt途径及其影响作 用仍然有待于进一步的研究和论证。

发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白之间相互作用 的调节剂的方法。
本发明的另一目的在于提供一种蓬乱蛋白的活性片段，其可用于制备调节 (特别是抑制)c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂(特别是抑制剂)，或用 于筛选调节c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂。
在本发明的第一方面，提供一种筛选调节c-Jim蛋白与蓬乱蛋白 (Dishevelled, Dvl)相互作用的调节剂的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 将候选物质与c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的体系接触；和
(b) 检测候选物质对c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的影响； 其中，若所述候选物质可抑制或促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用，
则表明该候选物质是调节c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述的相互作用是c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间 发生结合。
在本发明的另一优选例中，所述的蓬乱蛋白选自蓬乱蛋白1 (Dvl 1)、 蓬乱蛋白2 (Dvl 2)或蓬乱蛋白3 (Dvl 3)。
在本发明的另一优选例中，步骤(a)包括向c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互 作用的体系中添加候选物质；和
步骤(b)包括检测c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用情况，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、c-Jim蛋白和蓬乱蛋白相互作用的体 系；
若测试组中c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低 于，如低20%;更优选的低40%)对照组，就表明该候选物质是抑制c-Jun蛋白 和蓬乱蛋白相互作用的调节剂；
若测试组中c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低 于，如高20%;更优选的高40%)对照组，就表明该候选物质是促进c-Jun蛋白 和蓬乱蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述体系选自溶液体系、细胞体系、或组织体系。
6在本发明的另一优选例中，所述体系中还包含Wnt蛋白。 在本发明的另一优选例中，所述的Wnt蛋白包括但不限于Wntl蛋白、Wnt3a 蛋白、Wnt8蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述方法还包括对于筛选出的调节剂，进一步 测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt信号途径下游基 因的表达，则表明该调节剂是促进c-Jim蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用的促进 剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是抑制c-Jun 蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用的抑制剂。
在本发明的另一优选例中，Wnt信号途径下游基因例如(但不限于)哺乳 细胞中的c-myc基因、cyclinDl基因、Axin2基因、LEF1基因、PPARdelta基 因；或鱼类(如斑马鱼)细胞中的km基因、"义6基因。
在本发明的另一优选例中，所述的Wnt信号途径下游基因异常活化(如上调) 导致肿瘤(如结肠癌)的发生。
在本发明的第二方面，提供一种通过所述的方法获得的调节c-Jim蛋白与蓬 乱蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，通过抑制c-Jun蛋白与 蓬乱蛋白的相互作用，从而抑制Wnt信号途径下游基因异常活化。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，所述的抑制剂为一种多 肽，含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
在本发明的另一优选例中，所述的多肽还含有核定位信号蛋白(NLS)的氨 基酸序列。
在本发明的另一优选例中，所述的核定位信号蛋白的氨基酸序列位于所述多 肽的C末端。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是一种核酸分子或其转录本 (mRNA),所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的序列。
在本发明的第三方面，提供一种蓬乱蛋白的用途，用于筛选调节c-Jun蛋 白与蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1A显示了 c-Jun与Dvl的免疫共沉淀实验，证实c-Jun在细胞内可以 和三种Dvl(Dvll、 Dvl2、 Dvl3)发生蛋白质相互作用。
图1B显示了在体外Pull Down实验中，用抗Dvl3抗体(anti-Dvl3)免疫 沉淀His-Dvl3可以共沉淀到GST-c-Jun。
图lC显示了只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的c-Jun。
图2A显示了在HEK293T细胞中，当内源的c-Jun蛋白质水平下降后，能够显 著地降低Wnt3a激活的Topflash报告基因活性，但并不影响(3-连环蛋白在核内 的积累。
图2B显示了在SW480细胞中，当内源的c-Jun蛋白质水平下降后，能够显著 地降低Wnt3a激活的Topflash报告基因活性。
图2C (左边)显示了注射c-Jun-M0的胚胎中rax和"x6的表达明显地较对照 组(Ctr-MO)胚胎下降。
图2C(右边)显示了";^和m逮达正常以及明显下调的胚胎的统计情况。
图3A显示了Pu11 Down实验的结果，利用抗GST-M抗体免疫沉淀GST-M能够 共沉淀得到His-c-Jun，而GST不能。图3B显示了竞争结合实验的结果，在共转染了M-NLS-HA的情况下，利用抗 Flag抗体免疫沉淀Dv13-NLS-Flag不能共沉淀到c-Jun-HA。
图3C显示了在HEK293细胞中，M-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash 活性，而单独的M片段则不能。
图3D显示了在SW480细胞中M-NLS对Topflash活性的抑制是剂量依赖的。
图犯显示了核染色质免疫沉淀的结果，在Wnt3a刺激下，Dvl3能够结合到 Wnt信号下游耙基因c-myc的启动子区域，但在转染M-NLS片段后，Dvl3结合到 c-myc启动子区域的数量显著地下降。
图3F(左边)显示了注射Dvl-M-NLS的mRNA的胚胎中to;t和"义6的表达明显
地较对照组胚胎下降。
图3F(右边)显示了 fh6和yox表达正常以及明显下调的胚胎的统计情况。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现在经典Wnt信号转导途径中， c-Jun蛋白可与蓬乱蛋白(Dvl)在Wnt激活的条件下发生相互作用，从而帮助 Dvl结合到Wnt信号下游耙基因c-myc的启动子区域，调节Wnt下游的信号转 导途径。由于Wnt下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因 此依据该新发现的c-Jun蛋白和Dvl蛋白之间的相互作用机制，可提供通过抑 制Wnt下游的信号转导从而实现抑制肿瘤发生的新的药物靶点。在此基础上完 成了本发明。
c-Jun蛋白及其活性片段
本发明人发现，c-Jun蛋白可与Dvl蛋白发生相互作用。在本发明中，所 用的c-Jun蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选 的，所述天然存在的c-Jun蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 1所示的氨 基酸序列基本上相同。此外，所述的c-Jun蛋白也可以是重组制备的，比如可 以根据常规的基因重组技术来生产重组的c-Jun蛋白。优选的，本发明采用重 组的c-Jun蛋白。此外，任何不影响c-Jun蛋白的生物活性的变化形式都可用 于本发明中，例如c-Jim蛋白的生物活性片段、衍生物，只要其也具有与Dvl 蛋白相互作用的功能，并且不会带来其它不良影响。
蓬乱蛋白及其活性片段
目前发现的蓬乱蛋白(Dvl)家族成员有三种，即Dvll、 Dvl2、 Dvl3，这三 种蛋白具有较高的同源性。在以往的研究中，Dvl蛋白最初被作为一个细胞质 蛋白参与经典Wnt信号的传递，它的主要功能是在细胞质中接受Wnt信号促使
卩-连环蛋白在细胞质中积累从而能够大量进入细胞核中启动下游靶基因的转 录。近来，本领域人员发现Dvl蛋白不仅在细胞质中转导Wnt信号，而且在细
胞核中也具有重要的作用，但对其作用机制尚不了解。
在本发明中，所用的Dvl蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离 自哺乳动物。优选的，所述天然存在的Dvl l蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl 2蛋白的氨基酸序列可以与SEQIDN0: 3所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl 3蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的Dvl蛋白也可以是重组制备的， 比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的Dvl蛋白。优选的，本发明采 用重组的Dvl蛋白。此外，任何不影响Dvl蛋白的生物活性的变化形式都可用 于本发明中，例如Dvl蛋白的活性片段、衍生物，只要其也具有与c-Jun相互 作用的功能，且不会带来其它不良影响，如可以是含有Dvl 1蛋白第165-258 位氨基酸的蛋白片段。
本发明还提供了一种由Dvl 1蛋白的第165 258位氨基酸组成的多肽， 本发明人将之命名为Dvl l-M多肽(片段)，其具有SEQ ID N0: 5所示的氨基酸 序列。
所述的Dvl 1-M多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成片 段。所述的Dvl 1-M多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使 用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物 细胞)中产生。此外，任何不影响Dvl l-M多肽的生物活性的变化形式都可用于 本发明中，例如Dvl l-M多肽的活性片段、衍生物或经过一个或多个氨基酸(通 常为l-20个，较佳地1-10个，更佳地l-5个)缺失、插入和/或取代形成的变 异体，只要其也具有与c-Jim相互作用的功能。
本发明还提供了Dvl 1-M多肽的编码基因。所述的编码基因可以是单链的 或是双链的。例如，所述Dvl 1-M多肽的编码基因可具有如SEQ ID N0: 6所示 的核苷酸序列。
优选的，为了使得Dvl 1-M被定位到细胞核中，可将Dvl 1-M与核定位 信号(入核信号)相连接；更优选的，可在Dvl -M的C末端添加核定位信号。 因此，本发明还提供了一种Dvl l-M-NLS蛋白，其能够与c-Jun蛋白相互作用。 在细胞内，所述的Dvl 1-M-NLS被定位到细胞核中，通过与c-Jun蛋白竞争结 合，抑制细胞核内c-Jun蛋白与Dvl蛋白的相互作用。
所述的核定位信号是一种信号肽，其可帮助蛋白进入细胞核。本发明可采 用任何不影响Dvl l-M与c-Jun相互作用的核定位信号。例如，所述的核定位 信号具有氨基酸序列如下DPKKKRKV DPKKKRKV DPKKKRKV (SEQ ID NO: 7)。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法或人工合成法来大批量地获得有 关序列。重组法通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增 殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。应用及筛选方法
在研究过程中，为了证实c-Jun与Dvl之间的相互作用，本发明人在人的胚 胎肾细胞HEK293T细胞中瞬时转染外源的带有H A小肽标记的c-Jun和Flag标记 的三种Dvl，利用免疫共沉淀(IP)技术来检测两者之间的相互作用情况。结果发 现，只有共转染Dvl和c-Jun时c-Jun可以被检测到，说明c-Jun通过和Dvl相互作 用， 一起被Flag抗体吸附到珠子上而得以免疫沉淀。单独转染c-Jun无法在免疫 沉淀样品中检测到c-Jun。可见c-Jun在细胞内和三种Dvl均可以发生蛋白质相互 作用。
为了确定c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人进 行了体外PullDown实验。结果发现，用Dvl3抗体免疫沉淀His-Dvl3可以共沉淀 到GST-c-Jun，这说明c-Jun和Dvl之间蛋白质相互作用是直接的。并且，c-Jun 和Dvl之间的蛋白质相互作用还受到Wnt3a信号的调节。
接着，本发明人利用Topflash报告基因活性系统来检测c-Jun在经典Wnt信号 转导途径的功能。结果表明，c-Jun是经典Wnt信号转导途径中的一个新成员， 对下游的P-连环蛋白-LEF-1/Tc銜录复合物的转录激活具有正向调节功能。进 一步地，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun在Wnt信号途径中的功能。 结果也表明，c-Jun是经典Wnt信号转导途径所必需的，是Wnt信号转导途径一 个新成员。
本发明人还通过对Dvl缺失突变找到了Dvl上与c-Jun相互作用的片段M (165 258位氨基酸)。通过竞争结合实验发现，M-NLS-HA能够阻断Dvl和c-Jun 之间的相互作用。在共转染了M-NLS-HA的情况下，Dvl3-NLS-Flag不能共沉淀 到c-Jun-HA。以上实验说明，Dvl上的片段M是负责和c-Jun相互作用的片段。
为了进一步研究这个相互作用在Wnt/p-连环蛋白信号途径中的作用，本发 明人将单独的M片段和带有入核信号的M片段分别转染入HEK293T细胞中，通 过Topflash报告基因的活性来检测它们对转录复合物的转录活性的影响。结果 发现，M-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的T叩flash活性，而单独的M片段则不 能。并且，在SW480细胞中，M-NLS对T叩flash活性的抑制是剂量依赖的。以 此可见，Dvl-M-NLS片段是在核里P-连环蛋白的下游发挥作用的，通过阻断Dvl 和c-Jun的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。
本发明人还利用核染色质免疫沉淀的方法(Chip)来研究M-NLS片段对Wnt3a激活前后转录复合物的影响。结果表明，在经典Wnt信号途径中c-Jim帮 助Dvl结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，并且c-Jun和Dvl之间的相 互作用对于P-连环蛋白-LEF-l/TCF转录复合物的形成是必需的。
最后，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun和Dvl之间的相互作用在 生物体中的功能。结果表明，c-Jun和Dvl之间的相互作用在斑马鱼的发育过程 中具有重要的功能，它是经典Wnt信号途径所必需的。
基于本发明人的上述新发现，对c-Jun蛋白或其活性片段与Dvl蛋白或其 活性片段相互作用的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)筛 选抑制c-Jun蛋白或其活性片段与Dvl蛋白或其活性片段相互作用的物质，从 而抑制经典Wnt信号转导途径的异常激活，以防治由于经典Wnt信号转导途径 的异常激活导致的疾病，如肿瘤。
因此，本发明提供了一种筛选调节c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂 的方法，通过向c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候 选物，并观察c-Jun蛋白与Dvl蛋白的相互作用情况来进行筛选。所述方法包 括以下步骤
(a) 将候选物质与c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的体系接触；和
(b) 检测候选物质对c-Jim蛋白与Dvl蛋白相互作用的影响；
其中，若所述候选物质可抑制或促进c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用，则 表明该候选物质是调节c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂。
更优选的，步骤(a)包括在c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的体系中添加 候选物质；和步骤(b)包括检测c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用情况，并与对 照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、c-Jun蛋白与Dvl蛋白 相互作用的体系。
作为筛选的条件，若测试组中c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用在统计学上 低于(优选显著低于，如低20%;更优选的低40%)对照组，就表明该候选物质 是抑制c-Jim蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂；若测试组中c-Jun蛋白与Dvl 蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低于，如高20%;更优选的高40%)对照 组，就表明该候选物质是促进c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂。
如本文所用，所述的"c-Jun蛋白和(或"与")Dvl蛋白相互作用的体系"指一种体系，其中含有c-Jun蛋白和Dvl蛋白，并且c-Jun蛋白和Dvl蛋白可发 生相互作用(如相互结合)。
在本发明中，所述的体系选自(但不限于)溶液体系、细胞体系、亚细胞 体系、组织体系、器官体系、或动物体系。
作为本发明的优选方式，所述体系中还包含wm家族蛋白。例如，所述的
Wnt家族蛋白包括(但不限于)Wntl、 Wnt3a、 Wnt8。 调节c-Jun与Dvl相互作用的物质及其组合物
通过上述方法初步筛选出的调节剂可构成一个筛选库，以便于人们最终可 以从中筛选出能够对于调节Wnt信号途径有用的药物。
本发明还提供了一种通过所述的方法筛选获得的调节c-Jun蛋白与Dvl蛋白 相互作用的物质。例如，所述物质是抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质， 如抑制剂、拮抗剂、阻滞剂；或者，所述物质是促进c-Jun蛋白与Dvl蛋白相 互作用的物质，如促进剂、激动剂。通常，抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作 用的物质可抑制Wnt信号途径的异常激活，从而可防治Wnt信号途径的异常激 活导致的疾病，因此，c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的抑制剂、拮抗剂、阻 滞剂是尤其有用的。
此外，针对本发明发现的c-Jun蛋白与Dvl蛋白之间的相互作用特性，还 可设计一些通过竞争结合或抑制其中一种蛋白而阻止c-Jun蛋白与Dvl蛋白结 合的物质。除了作为本发明的一种优选方式，提供了一种基于Dvl l设计的可 通过竞争性结合c-Jun蛋白来阻止胞内c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质， 即Dvll-M多肽。更优选的，将Dvl 1-M多肽与核定位信号(NLS)相连接，从而 其在被导入细胞后，可直接被定位到细胞核中，在细胞核中阻止c-Jun蛋白与 Dvl蛋白的相互作用。
作为本发明的另一种优选方式，所述的抑制剂也可以是一种c-Jun的小干 扰分子，如siRNA，其可通过在转录水平上的基因沉默来下调基因的表达。本 领域人员熟知制备这类小干扰分子的方法。
所述的c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂，可以施用于个体，用于 调节细胞内Wnt信号途径的活性。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8， 尽管PH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药 物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、 或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a) c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形 齐U。所述的c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂优选一种抑制剂，如Dvl 1-M 多肽。
目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载 体)和细胞中是本领域中的常规技术， 一般人员只要根据本发明的提示，都可 以方便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领 域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增 强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为 原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCh。如果需 要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转 染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多 种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双 杂交系统或免疫共沉淀技术。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系 统来筛选与Dvl相互作用的蛋白。更具体的，在酵母细胞中， 一种与DNA-结构 域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用，所述猎物蛋白可 以是己知的，也可以是从cDNA文库中选出来的。相互作用的成对分子结合于 专一的序列模式，从而活化两个独立的报道基因的转录。
在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的 特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是在保持蛋白-蛋白相互作 用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白， 然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已 经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀 的蛋白。
本发明的主要优点在于
(1) 首次揭示在经典Wnt信号转导途径中，Dvl蛋白与c-Jun蛋白在Wnt 激活的条件下可发生相互作用，从而帮助Dvl结合到Wnt信号下游靶基因c-myc 的启动子区域，调节Wnt下游的信号转导途径。
(2) 由于已知Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切 相关，因此，依据本发明的新发现，可提供抑制Wnt下游的信号转导从而实现 抑制肿瘤发生的新的药物靶点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 c-Jun的获得
本发明人以由Dvll蛋白(序列参见SEQ ID NO: 2)的第1-375位氨基酸(称 为Dvll-N7)构成的蛋白作为"诱饵"，通过酵母双杂交筛选小鼠10.5天胚胎 库(Invitrogen)。采用的双杂交系统为ProQuest Two-Hybrid System(购自 Invitrogen)，具体的实验方法见该双杂交系统所提供的使用说明书。结果得 到缺失N端73个氨基酸的c-Jun克隆。
实施例2 c-Jun和Dvl蛋白质相互作用
1. c-Jun在细胞内可以和三种Dvl发生蛋白质相互作用
为了进行进一步的研究，本发明人设计了人c-Jim基因两端的引物并分别在N端和C端引入Xhol和Notl酶切位点，所述的引物为
正向CTAGCTCGAGGACTGCAAAGATGGAAAC (SEQ ID NO: 8) 反向ATAAGAATGCGGCCGCTCAAAATGTTTGCAACT (SEQ ID NO: 9) 以常规方法制备的人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长c-Jim 的序列，然后用XhoI/Notl进行双酶切，将酶切产物分别克隆入pCMV载体(购 自Bioscience)的XhoI/NotI酶切位点中以及pET28c的Sall/NotI酶切位点中， 构建出可分别在真核细胞和原核细胞中表达的质粒pCMV/c-Jun和 pET28c/c-Jim。
Dvl家族含有三个成员，分别为Dvll、 Dvl2和Dv13。 Dvll基因的获得
设计引物如下正向5，-CTAGTCTAGAGGCGGAGACCAAAATCA-3， (SEQ ID NO: 12)，反向5'-CTAGCTCGAGCATGATGTCCACAAAGAA-3， (SEQ ID NO: 13)。以常规方法制备的鼠cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长 Dvll的序列。
Dvl2基因的获得
设计引物如下正向5，-CTAGTCTAGAGGCGGGTAGCAGCACT-3， (SEQ ID NO: 14)，反向5，-CTAGCTCGAGCATAACATCCACAAAGA-3， (SEQ ID NO: 15)。以人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dv12的序列。
Dvl3基因的获得
设计引物如下正向5，-CTAGTCTAGAGGGCGAGACCAAGAT-3， (SEQ ID NO: 16)，反向5，-CTAGCTCGAGCATCACATCCACAAAGA-3， (SEQ ID NO: 17)。以人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dv13的序列。
为了证实c-Jun与Dvl之间的相互作用，本发明人构建了带有HA标记的 c-Jun和Flag标记的三种Dvl的表达载体pCMV/c-Jun-HA， pCMV/Dvl 1-Flag, pC匿/Dvl2-Flag， pCMV/Dvl3-Flag。其中，pCMV/c-Jun-HA如下构建以Xhol 和Notl酶切c-Jun，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/HA(购自 Bioscience,自带HA标签)中。pCMV/Dvl卜Flag如下构建以Xbal/Xhol酶切 Dvll，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/Flag(购自Bioscience,自带 Flag标签)中。pCMV/Dvl2-Flag如下构建:以Xbal/Xhol酶切Dvl2，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/Flag中。pCMV/Dv13-Flag如下构建以 Xbal/Xhol酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/Flag(购自 Bioscience)中。
首先在人的胚胎肾细胞HEK293T细胞(ATCC)中瞬时转染(分别转染或同时 转染)外源的带有HA小肽标记的c-Jun和Flag标记的三种Dvl的表达载体 pCMV/c-Jun-HA， pCMV/Dvll-Flag, pCMV/Dvl2-Flag， pCMV/Dv13-Flag。转染 24小时后，收细胞，用1X裂解缓冲液(NP40 1%，甘油10%， NaCl 0. 135M， Tis-CI PH8. 0， PMSF 0. 5M， PPi lmM， NaF lOmM， Na3V04 2mM)裂解细胞，离心 (14，000rpm/10min)后取上清，加入抗Flag抗体(anti-Flag,购自Sigma)和 protein A/G Plus agarose珠子，低温旋转3小时，离心(5000rpm/lmin)收集 珠子，通过Western印迹检测珠子上所带的蛋白(上述过程即Pull Down实验)。 IgG在加入Flag抗体的时候加入到对照管中，作为抗体的负对照。
结果由图1A所示，只有共转染Dvl和c-Jun时，c-Jun可以被抗Flag抗 体检测到，说明c-Jun通过和Dvl相互作用， 一起被Flag抗体吸附到珠子上 而得以免疫沉淀。单独转染c-Jun无法在免疫沉淀样品中检测到c-Jun。这提 示c-Jim在细胞内可以和三种Dvl发生蛋白质相互作用。
2. c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用是直接作用
为了确定c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人 分别从大肠杆菌中表达得到了 GST-c-Jun和His-Dvl3。首先构建了包含 GST-c-Jun和His-Dvl3的重组质粒pGEX-4T-2-c-Jun和pET28c/ His-Dvl3。 pGEX-4T-2-c-Jun构建如下以XhoI/NotI酶切c-Jun，将酶切产物克隆入经 过同样酶切的pGEX-4T-2(购自Novagen，自带GST)中。pET28c/ His-Dvl3构 建如下以Sall/NotI酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经过同样酶切的 pET28c/His (购自Novagen，自带His标签)中。
重组表达质粒pGEX-4T-2-c-Jun和pET28c/ His-Dvl3分别转化大肠杆菌 BL21，接种单克隆菌落于LB培养液，37'C培养过夜；取上述过夜菌1:100接 种于新鲜的LB培养基中，22t培养至A600为0. 6 0. 8，分别加入异丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)，表达GST-c-Jun的菌液达终浓度100 u M，表达His-Dvl3的 菌液达终浓度1 U M， 22。C培养16 h。离心收集菌体，将菌体溶于含有0. 5 mg/rnl溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNase I至终浓度为25 mg/ml以及MgS04至终浓度20 mM，冰上消化至不粘，高速离心(16000 rpra/20min) 后取上清得到破菌抽提物，进行体外Pull Down实验(方法同前述"1")。结 果由图1B所示，在体外Pull Down实验中用抗Dvl3抗体(anti-Dvl3，购自Santz Cruz)免疫沉淀His-Dvl3可以共沉淀到GST-c-Jun，这说明c-Jun和Dvl之间 蛋白质相互作用是直接的。
3. c-Jun和Dvl之间相互作用需要Wnt3a的刺激
为了进一步证实c-Jun和Dvl在内源是否存在相互作用，本发明人分别收 获Wnt3a (Wnt3a通过收获wnt3a/NIH3T3细胞的培养上清获得，wnt3a/NIH3T3 细胞及其培养方法参见尹宗生，张辉等，《第四军医大学学报》，Vol.26， No.24， p2212-2215， 2006)刺激或不刺激的HEK293T细胞，其中重组质粒的构建以及 转染入细胞等步骤同前。分离细胞核得到核组分上清，分别用IgG和抗Dvl3 抗体(anti-Dvl3)免疫沉淀内源的Dvl3。
结果如图1C所示，只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的 c-Jun0
综上，这些实验一致证明，c-Jun和Dvl在体内存在蛋白质相互作用并且 这种相互作用受到Wnt3a信号的调节。
实施例3 c-Jun在经典Wnt信号转导途径的功能
主要利用T叩flash报告基因活性系统来检测。
T叩flash报告基因来源于Upstate公司；报告基因的活性检测采用 Luciferase Reporter Gene Assay, High Sensitivity, 来源于Roche 公司， 检测方法参见同时提供的使用说明书。根据c-Jun的序列，设计针对c-Jun的 siRNA序列如下5，-GUCAUGAACCACGUUAACAdTdT-3， (SEQ ID NO: 10)，
该序列直接转染即可。
在人的胚胎肾细胞293T细胞和结肠癌细胞SW480细胞(购自ATCC，是APC 蛋白功能缺失的结肠癌细胞株)中转染上述含荧光素酶启动子区带有Tcf结合 位点的报告基因，绿色荧光蛋白，c-Jun的小分子干扰RNA(siJun)。转染约48
18小时，换液用含有Wnt3a(其用量为可以激活报告基因10 15倍的量)的培养基 进行刺激约6小时。收细胞，24孔盘中每孔加200ul 1X裂解缓冲液(Roche) 裂解细胞5分钟，在测活的96孔板中每点加40ul细胞裂解液，在加入20ul 荧光酶底物(Roche)，在酶标仪中计荧光量。以荧光值反映转录复合物的转录 活性。siCtr为5， -UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3， (SEQ ID NO: 11)，直接 用于转染。Ctr为不利用Wnt3a进行刺激，其它条件相同。
结果如图2A所示，在HEK293T细胞中利用RNA干扰技术沉默c-Jun的基 因表达，当细胞中内源的c-Jun蛋白质水平下降后，能够显著地降低Wnt3a激 活的Topflash报告基因活性，但并不影响(3-连环蛋白在核内的积累。
同样，在SW480细胞中，当内源的c-Jun蛋白质水平下降后，也能显著地 抑制Topflash报告基因活性，如图2B所示。
上述数据一致表明，c-Jun是经典Wnt信号转导途径中的一个新成员，通 过在Wnt3a刺激下直接和l5-连环蛋白-LEF-1/Tcf形成转录复合物，对下游基 因的转录激活具有正向调节功能。
进一步地，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun在Wnt信号途径中 的功能。在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射含c-Jun和/或c-JunmRNA(用量 10mM)的吗啉代反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotide (M0))(即c-Jun-M0和/或c-JunraRNA)，分别在胚胎发育的二个时期.-动物极 细胞包被40%和胚盾(shield)时期收获胚胎，利用常规的原位杂交的技术来检 测Wnt信号途径下游基因和";^的表达(参见《Zebrafish》，由 Christiane Nusslein-Volhard 禾口 Ralf Dahm 主编，Oxford University Press, 2002)。对照为同样条件下注射M0的斑马鱼胚胎(Ctr-M0)。
结果如图2C所示，注射c-Jun-M0的胚胎中vwf和A;^的表达明显地较 对照组胚胎下降(图2C左边)，对83个胚胎统计后有68. 7%的胚胎对WW的表 达有明显下调，对119个胚胎统计后有57.2%的胚胎对yox的表达有明显下调 (图2C右边)，并且这一现象在同时注射c-Jun mRNA的时候能够被解除。这一 结果表明了 c-Jun是经典Wnt信号途径所必需的，是Wnt信号途径的一个新成 员。
19实施例4 c-Jim与Dvl的相互作用对于经典Wnt信号转导途径是必需的
本发明人通过常规的缺失突变技术对Dvll进行缺失突变，并验证各突变 体与c-Jun蛋白的相互作用情况。结果发现，Dvll上第165 258位氨基酸是 与c-Jun发生相互作用的片段(Dvll-M，简称M)。为了便于后续的克隆，在 Dvll-M基因片段的末端分别设置SalI/Notl酶切位点的序列。
首先，构建了含有His-c-Jun和GST-M的重组质粒pET28c/His-c-Jun和 pGEX-4T-2-M。 pET28c/His-c-Jun构建方法如下利用XhoI/NotI酶切c-Jun， 将酶切产物克隆入经同样酶切的pET28c/His(购自Novagen，自带His标签)中。 pGEX-4T-2-M的构建方法如下利用Sall/NotI酶切M，将酶切产物克隆入经 同样酶切的pGEX-4T-2中。将上述构建的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21，在 大肠杆菌BL21中分别表达得到His-c-Jun和GST-M蛋白。通过Pull Down实 验(过程与前述类似)发现，His-c-Jun和GST-M之间存在直接相互作用，如图 3A所示，利用GSH-Sepharose 4B的树脂免疫沉淀GST-M能够共沉淀得到 His-c-Jun，而GST不能。
进一步地，本发明人构建了含有入核信号(NLS)的pCMV/M-NLS-HA 、 pCMV/Dvl3-NLS-Flag质粒。pCMV/M-NLS-HA的构建如下利用引物退火后二端 带有的Xbal/Notl酶切位点的粘端，将NLS的基因序列(序列为 5 ， -CTAGACTAGACCTAGCTCGAGGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAA AAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG-3， (SEQ ID NO: 18))弓|入 pCMV/HA中，形成pCMV/NLS-HA;然后再利用Sall/NotI酶切M，将酶切产物克 隆入经同样酶切的pCMV/NLS-HA中，获得pCMV/M-NLS-HA。 pCMV/Dvl3-NLS-Flag 的构建方法与前述类似。
在HEK293T中共转染上述含有入核信号的pCMV/M-NLS-HA 、 pCMV/Dvl3-NLS-Flag以及pCMV/c-Jun-HA质粒，使细胞中表达M-NLS-HA、 Dvl3-NLS-Flag、 c-Jun-HA。通过竞争结合实验发现，M-NLS-HA能够阻断Dvl3 和c-Jun之间的相互作用。
结果如图3B所示，在共转染了 M-NLS-HA的情况下，利用抗Flag抗体 (anti-Flag,购自Sigma)免疫沉淀Dvl3-NLS-Flag不能共沉淀到c-Jun-HA。 以上实验说明，Dvl上的片段M是负责和c-Jun相互作用的片段。为了进一步研究Dvl与c-Jun之间的相互作用在Wnt/(3-连环蛋白信号途径 中的作用，本发明人将含有单独M片段的pCMV/HA-M (M在HA的N端，构建方 法在M片段的两端设置酶切位点Xbal/Xho1，将之克隆入pCMV/HA的相应位 点中)和带有入核信号的M片段pCMV/NLS-HA-M分别转染入HEK293T细胞中， 通过Topflash报告基因的活性来检测它们对(5-连环蛋白-LEF-1/Tcf转录复合 物的转录活性的影响(Topflash报告基因来源Upstate公司，报告基因的活性 检测采用Lucif erase Reporter Gene Assay, High Sensitivity,来源于Roche 公司)。以常规的LacZ作为空白质粒对照，并且，Wnt3a为在HEK293T细胞的 培养基中加入Wnt3a的情况，Ctr为不利用Wnt3a进行刺激、其它条件相同的 情况。
结果如图3C所示，M-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性， 而单独的M片段则不能。由图3D所示，在SW480细胞中M-NLS对T叩flash活 性的抑制是剂量依赖的，其中，"一"表示没有M-NLS表达，"+ "表示含有 100ng量的M-NLS， " + + "表示含有300ng量的M-NLS。
上述结果进一步证实，Dvll-M-NLS片段是在核里(3-连环蛋白的下游发挥作 用的(SW480细胞是APC蛋白功能缺失的结肠癌细胞株)，通过阻断Dvl和c-Jun 之间的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。
同时，本发明人利用核染色质免疫沉淀的方法(ChlP)来研究M-NLS片段对 Wnt3a激活前后转录复合物的影响。在HEK293T细胞中瞬时转染含有M-NLS片 段的质粒pCMV/M-NLS-HA。转染24小时后，通过甲醛固定细胞，超声裂解细胞， 预结合步骤得到可用于免疫沉淀的上清，分别加入IgG、抗Dv13抗体和protein A/G Plus agarose珠子进行免疫沉淀，然后进行洗涤和洗脱得到可用于PCR扩 增的样品，最后通过Agarose电泳检测。以GAPDH作为PCR阴性对照。
结果如图3E所示，在Wnt3a刺激下，Dvl3能够结合到Wnt信号下游靶基 因c-myc的启动子区域，但在转染M-NLS片段后，Dvl3结合到c-rayc启动子区 域的数量显著地下降。
上述结果说明，在经典Wnt信号途径中，c-Jun帮助Dvl结合到Wnt信号 下游靶基因c-myc的启动子区域，并且c-Jim和Dvl之间的相互作用对于(5-连环蛋白-LEF-1/TCF转录复合物的形成是必需的。
最后，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun和Dvl之间的相互作用 在生物体中的功能。在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射Dvll-M-NLS的mRNA， 分别在胚胎发育的二个时期动物极细胞包被40%和胚盾(shield)时期收获胚 胎，利用常规的原位杂交的技术来检测Wnt信号途径下游基因^x和";r6的 表达。以在斑马鱼一细胞期的胚胎中注射绿色荧光蛋白(GFP)的raRNA为对照。
结果如图3F所示，注射Dvl-M-NLS的mRNA的胚胎中tox和";^的表达 明显地较对照组胚胎下降(图3F左边)，对64个胚胎统计后有73. 4%的胚胎对 "x6的表达有明显下调，对69个胚胎统计后有52.2%的胚胎对Kor的表达有 明显下调(图3F右边)。这一结果表明了 c-Jun和Dvl之间的相互作用在斑马 鱼的发育过程中的功能，它是经典Wnt信号途径所必需的。
综上，本发明人的研究揭示了 c-Jun参与经典Wnt信号途径的分子机制， 揭示了 c-Jun与Dvl之间的相互作用的重要性。从研究中发现的片段Dvl 1-M-NLS抑制c-Jun参与经典Wnt信号调控来抑制肿瘤发生这个角度来看，提 供了很好的筛选模型方案和为设计分子药物提供了作用的靶位点。
实施例5筛选抑制c-Jun与Dvl之间相互作用的物质
如实施例2中"l"所述相同的方法，分别构建带有HA小肽标记的c-Jun和 Flag标记的Dvl l的表达载体pCMV/c-Jun-HA、 pCMV/Dv11-Flag。
测试组添加候选物且共转染有pCMV/c-Jun-HA和pCMV/Dvl 1-Flag的 HEK293细胞体系。
对照组未添加候选物且共转染有pCMV/c-Jun-HA和pCMV/Dvl 1-Flag的 HEK293细胞体系。
采用如实施例2的Pu11 Down实验方法，检测测试组以及对照组中c-Jun蛋 白与Dvl l蛋白相互作用情况。
如果与不添加候选物质的对照组相比较，添加候选物质后c-Jun蛋白与 Dvl l蛋白的相互作用明显被抑制(如利用抗Flag抗体免疫沉淀共转染Dvll-Flag 和c-Jun-HA的体系无法沉淀到c-Jun-HA)，则说明该候选物质是抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质，因而是一种预期可影响Wnt信号转导途径的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。<formula>formula see original document page 24</formula><400〉 2
MetAlaGluThrLyslielieTyrHisMetAspGluGluGluThrPro
151015
TyrLeuValLysLeuProValAlaProGluArgValThrLeuAlaAsp
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PheLysAsnValLeuSerAsnArgProValHisAlaTyrLysPhePhe
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PheLysSerMetAspGinAspPheGlyValValLysGluGluliePhe
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AspAspAsnAlaLysLeuProCysPheAsnGlyArgValValSerTrp
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LeuValLeuAlaGluGlyAlaHisSerAspAlaGlySerGinGlyThr
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AspSerHisThrAspLeuProProProLeuGluArgThrGlyGlylie
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GlyAspSerArgProProSerPheGinSerSerArgAspGlyMetAsp
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<210> 3
〈211〉 736
〈212〉 PRT
〈213> 智人(Homo S即iens)
〈400〉 3
MetAlaGlySerSerThrGlyGly
lieTyrHisLeu3 AspGluGluGlu
20
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3540
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100
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GlyGlyValGlyGluThrLysVal
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ThrlieThrSer GlySerSer LeuPro AspGlyCysGluGlyArgGly
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<213> 智人(Homo Sapiens)<400> 4
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210215220
LysValSerArglieGluArgSerSerSerPheSerSerlieThrAsp
225230235240
SerThrMetSerLeuAsnlielieThrValThrLeuAsnMetGluLys
245250255
TyrAsnPheLeuGlylieSerlieValGlyGinSerAsnGluArgGly
260265270
AspGlyGlylieTyrlieGlySerlieMetLysGlyGlyAlaValAla
275280285
AlaAspGlyArglieGluProGlyAspMetLeuLeuGinValAsnGlu
290295300
lieAsnPheGluAsnMetSerAsnAspAspAlaValArgValLeuArg
305310315320
GlulieValHisLysProGlyProlieThrLeuThrValAlaLysCys
325330335
TrpAspProSerProArgGlyCysPheThrLeuProArgSerGluPro
340345350
lieArgProlieAspProAlaAlaTrpValSerHisThrAlaAlaMet
355360365
ThrGlyThrPheProAlaTyrGlyMetSerProSerLeuSerThrlie
370375380
ThrSerThrSerSerSerlieThrSerSerlieProAspThrGluArg
385390395400
LeuAspAspPheHisLeuSerlieHisSerAspMetAlaAlalieVal
405410415
LysAlaMetAlaSerProGluSerGlyLeuGluValArgAspArgMet
420425430
TrpLeuLyslieThrlieProAsnAlaPhelieGlySerAspValVal
435440445
AspTrpLeuTyrHisAsnValGluGlyPheThrAspArgArgGluAla
450455460
ArgLysTyrAlaSerAsnLeuLeuLysAlaGlyPhelieArgHisThr
465470475480
ValAsnLyslieThrPheSerGluGinCysTyrTyrliePheGlyAsp
485490495
LeuCysGlyAsnMetAlaAsnLeuSerLeuHisAspHisAspGlySer
28500505510
SerGlyAlaSer Asp GinAsp ThrLeu AIs ProLeuProHisProGly
515520525
AlaAlaProTrp Pro MetAla PhePro Tyr GinTyrProProProPro
530535540
HisProTyrAsn Pro HisPro GlyPhe Pro GluLeuGlyTyrSerTyr
545550555560
GlyGlyGlySer Ala SerSer GinHis Ser GluGlySerArgSerSer
565570575
GlySerAsnArg Ser GlySer AspArg Arg LysGluLysAspProLys
580585590
AlaGlyAspSer Lys SerGly GlySer Gly SerGluSerAspHisThr
595600605
ThrArgSerSer Leu ArgGly ProArg Glu ArgAlaProSerGluArg
610615620
SerGlyProAla Ala SerGlu HisSer His ArgSerHisHisSerLeu
625630635640
AlaSerSerLeu Arg SerHis HisThr His ProSerTyrGlyProPro
645650655
GlyValProPro Leu TyrGly ProPro Met LeuMetMetProProPro
660665670
ProAlaAlaMet Gly ProPro GlyAls Pro ProGlyArgAspLeuAla
675680685
SerValProPro Glu LeuThr AlaSer Arg GinSerPheArgMetAla
690695700
MetGlyAsnPro Ser GluPhe PheVal Asp ValMet
705710715
<210〉 5
<211> 94
<212> PRT
<213〉 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
ArgAspLeuGly Leu Pro Pro AspSer Ala SerThrValLeuSerSer
151015
GluLeuGluSer Ser Ser Phe lieAsp Ser AspGluGluAspAsnThr
202530
SerArgLeuSer Ser Ser Thr GluGin Ser AsnSerSerArgLeuVal
354045
ArgLysHisLys Cys Arg Arg ArgLys Gin ArgLeuArgGinThrAsp
505560
ArgAlaSerSer Phe Ser Ser lieThr Asp SerThrMetSerLeuAsn
65707580
lielieThrVal Thr Leu Asn MetGlu Arg HisHisPheLeu
85 90
〈210〉 6
<211〉 282
<212〉 腿
<213〉 小鼠(Mus musculus)
〈400〉 6
cgggacctgg
8gcagcttta
cagagc犯ct
aggcagacgig
atcatcaccg
gactacctcc agacagtgca tctactgtac ttgactcaga tgaggaggac aatacgagcc cctctcggct agttcggaag cacaaatgcc accgggcatc ctccttcagc agcatcacag tcactctcaa csLtggeLgagg caccacttcc
tgagceigtga gcttg^tct 60
ggctgagcag ctccacagag 120
gtcgtcggaa gcagcgcttg 180
actccaccat gtccctgaac 240
tg 282
〈210〉 7
<211〉 24
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉
29<221> MISC FEATURE <223>核定位信号
<400> 7
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 15 10 15
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20
<210〉 8 〈211〉 28 <212〉 腿 <213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature <223> 引物—
<400〉 8
ctagctcgag gactgcaaag atgg肌ac 28
〈210〉 9
<211> 33
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<221> misc—feature
〈223〉 引物—
<400> 9
ataagaatgc ggccgctcaa aatgtttgca act
<210> 10
<211〉 19
<212〉 腿 〈213〉人工序列
33
<220>
<221> misc feature <223〉小干扰分子
〈400〉 10
gucaugaacc acguuaaca 19
<210> 11
〈211〉 19
<212> RNA <213>人工序列
<220〉
〈221> misc feature 〈223〉小干犹分子
〈400〉 11
uucuccgaac gugucacgu 19
〈210〉 13
<211> 28
<212> 醒 <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
〈223〉 引物—
<400> 13
ctagctcgag catgatgtcc acaaagaa 28
<210> 14<211> 26
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature
<223〉 引物_
<400> 14
ctagtctaga ggcgggtagc agcact 26
<210> 15
<211> 27
<212〉 醒 〈213〉人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
<223〉 引物
<400〉 15
ctagctcgag cataacatcc aca犯ga 27
<210〉 16
<211〉 25
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400> 16
ctagtctaga gggcgagacc aagat 25
<210〉 17
<211> 27
〈212〉 隱 <213>人工序列
<220〉
<221> misc—feature
〈223> 引物
<400〉 17
ctagctcgag catcacatcc acaaaga 27
〈210〉 18
<211> 93
<212> 廳
<213> 人工序列
<220>
<221〉 misc feature <223>核定位信号
<400> 18
ctagactaga cctagctcga ggatccaaaa aaga卿g肌鄉tagatcc aa犯aagaag 60, agaaaggtag atccaaaaaa gaagag肪ag gtag 9:
权利要求
1.一种筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(a)将候选物质与c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的体系接触；和(b)检测候选物质对c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的影响；其中，若所述候选物质可抑制或促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用，则表明该候选物质是调节c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括向c-Jun蛋 白和蓬乱蛋白相互作用的体系中添加候选物质；和步骤(b)包括检测c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用情况，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的体 系；若测试组中c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用在统计学上低于对照组，就表 明该候选物质是抑制c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂；若测试组中c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用在统计学上高于对照组，就表 明该候选物质是促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述体系选自溶液体系、细胞 体系、或组织体系。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述体系中还包含Wnt蛋白。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对于筛选出的 调节剂，进一步测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt 信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的 相互作用的促进剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调 节剂是抑制c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用的抑制剂。
6. —种通过权利要求1所述的方法获得的调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作 用的调节剂。
7. 如权利要求6所述的调节剂，其特征在于，它是抑制剂，所述的抑制剂为 一种多肽，含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
8. 如权利要求7所述的多肽，其特征在于，该多肽还含有核定位信号蛋白的氨基酸序列。
9. 如权利要求6所述的调节剂，其特征在于，所述的调节剂是一种核酸分子 或其转录本，所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的序列。
10. —种蓬乱蛋白的用途，其特征在于，用于筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱 蛋白之间相互作用的调节剂。
全文摘要
本发明公开了一种筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的调节剂的方法。本发明还公开了一种可抑制c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的物质，即Dvl 1-M多肽。本发明首次揭示在Wnt信号转导途径中，c-Jun蛋白可与Dvl蛋白发生相互作用，从而影响Wnt下游的信号转导。由于Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此本发明为筛选抑制肿瘤发生发展的药物提供了新靶点。
文档编号G01N33/68GK101308143SQ20071004060
公开日2008年11月19日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者莹 席, 林 李, 王计勇, 甘肖箐 申请人:中国科学院上海生命科学研究院