蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径中的新功能的制作方法

专利名称：蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径中的新功能的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及经典Wnt信号转导途径中的相互作 用蛋白及其用途。
背景技术：
经典Wnt信号转导途径调节控制了许多生命过程，这些过程包括生物体的 生长、发育、疾病、衰老与死亡等等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、 免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等等。Wnt信号转导途径在不同物种之间具 有高度的保守性，通过对果蝇、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已经大体确立 了经典Wnt信号转导途径的分子框架。发育过程中，特定的时间和特定的环境 诱导下，某些组织或细胞群体分泌Wnt蛋白，结合受体巻曲蛋白(Frizzled)家 族成员，和共受体低密度脂蛋白LRP5/6,将信号传递至细胞内。在没有Wnt信 号刺激时，这条信号转导途径的关键分子(3-连环蛋白(P-catenin)参与由Axin， 结肠癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3(5(GSK3f3)，酪蛋白激酶1 (CK1)，以及 (3-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白质复合物，在GSK3(3和CK1作用下受到磷酸化标 记，进而在(3-TrCP蛋白介导的泛素化修饰后被蛋白酶体降解。在Wnt信号刺激 下，胞内的Dishevelled (Dvl)和Frat等Wnt途径的正向调节分子打散Axin、 APC和GSK3等形成的降解复合物，Axin被LRP带上膜进而降解。(3-连环蛋白 磷酸化水平降低，进而可以在细胞质中大量积累。部分p-连环蛋白进入细胞核， 与核内的含有HMG-Box的转录因子-淋巴细胞增强因子1/ T细胞转录因子 (LEF1/TCF)家族的蛋白(如TCF-4)相互作用，启动下游耙基因的开放(Gurabiner BM. 1998. van Noort M. & Clevers H. 2002. Wodarz A. & Nusse R. 1998.)。
Wnt信号转导途径不仅影响胚胎发育中的体轴诱导、胚层建立、体节分化、 组织或器官形成等一系列重要的早期事件，参与体细胞的分化和极化；而且在 成体中Wnt信号途径的异常活化已经证明与多种肿瘤的发生密切相关。研究发 现，大约90%的结肠癌都是由于Wnt信号转导途径的激活性突变而引起的，此外Wnt信号途径的异常活化还与一系列的肿瘤发生有关，比如小肠腺瘤、肝癌、 胃癌、食道腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌(Giles RH， van Es JH， Clevers H. 2003)中均发现了 Wnt信号异常或者是转导途径中信号分子的突变。因此对Wnt 信号转导途径的分子机制的研究和理解，对于探索肿瘤治疗药物、寻找新的药 物耙点和理论依据具有重要意义。
经典Wnt信号转导途径的生物学功能主要是通过下游靶基因的表达而得以 实现。而很多靶基因比如c-myc、 cyclinDl，在细胞增殖中起到重要作用。研 究表明，在很多癌症细胞里可以检测到P-连环蛋白在细胞核中的大量积累以 及c-myc、 cyclinDl的高表达，说明这些肿瘤细胞中Wnt信号转导途径下游的 转录复合物处于高转录活性状态。因为转录复合物的活性高低直接关系到Wnt 信号效应，那么对转录复合物的分子调控机制的硏究，也就具有十分重要的意 义。
综上，尽管目前本领域对于经典Wnt信号途径的分子机制有所了解，然而 对于该途径的异常活化的启动等环节仍然不清楚。因此，本领域需要进一步对 Wnt信号途径中一些关键影响因素加以研究，以期找到可调节Wnt信号转导途 径的物质，从而调控Wnt信号转导相关的细胞事件。

发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选调节蓬乱蛋白与e-连环蛋白相互作用的调 节剂的方法。
本发明的另一目的在于提供一种蓬乱蛋白的活性片段，其可用于制备调节 (特别是抑制)蓬乱蛋白和P -连环蛋白相互作用的调节剂(特别是抑制剂)，或用于 筛选调节蓬乱蛋白和P -连环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的第一方面，提供一种筛选调节蓬乱蛋白(Dishevelled, Dvl)与 3-连环蛋白(P-catenin， P -cat)相互作用的调节剂的方法，所述方法包括以 下步骤
(a) 将候选物质与蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用的体系接触；和
(b) 检测候选物质对蓬乱蛋白和e -连环蛋白之间相互作用的影响；
其中，若所述候选物质可抑制或促进蓬乱蛋白和P-连环蛋白之间的相互作 用，则表明该候选物质是调节蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用的调节剂。在本发明的另一优选例中，所述的相互作用是蓬乱蛋白和P-连环蛋白发生
^口 口 o
在本发明的另一优选例中，所述的蓬乱蛋白选自蓬乱蛋白1 (Dvl 1)、 蓬乱蛋白2 (Dvl 2)或蓬乱蛋白3 (Dvl 3)。
在本发明的另一优选例中，步骤(a)包括向蓬乱蛋白和P-连环蛋白相 互作用的体系中添加候选物质；和
步骤(b)包括检测蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用情况，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、蓬乱蛋白和P -连环蛋白相互作用的 体系；
若测试组中蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低 于，如低20%;更优选的低40%)对照组，就表明该候选物质是抑制蓬乱蛋白和 P-连环蛋白相互作用的调节剂；
若测试组中蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低 于，如高20%;更优选的高40%)对照组，就表明该候选物质是促进蓬乱蛋白和 e -连环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述体系选自溶液体系、细胞体系、或组织体系。
在本发明的另一优选例中，所述体系中还包含Wnt蛋白。 在本发明的另一优选例中，所述的Wnt蛋白包括但不限于Wntl蛋白、Wnt3a 蛋白或Wnt8蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述方法还包括对于筛选出的调节剂，进一步 测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt信号途径下游基 因的表达，则表明该调节剂是促进蓬乱蛋白和e-连环蛋白之间的相互作用的促 进剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是抑制蓬
乱蛋白和e-连环蛋白之间的相互作用的抑制剂。
在本发明的另一优选例中，Wnt信号途径下游基因例如(但不限于)哺乳 细胞中的c-myc基因、cyclinDl基因、Axin2基因、LEF1基因、PPARdelta基 因；或鱼类(如斑马鱼)细胞中的^;f基因、";^基因。
在本发明的另一优选例中，所述的Wnt信号途径下游基因异常活化(如上调)
导致肿瘤(如结肠癌)的发生。在本发明的第二方面，提供一种通过所述的方法获得的调节蓬乱蛋白与P -连 环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，通过抑制蓬乱蛋白与e
-连环蛋白的相互作用，从而抑制Wnt信号途径下游基因异常活化。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，所述的抑制剂为一种多
肽，含有SEQ ID NO: 5中496 695位氨基酸序列。
在本发明的另一优选例中，该多肽还含有核定位信号蛋白(NLS)的氨基酸序列。
在本发明的另一优选例中，所述的核定位信号蛋白的氨基酸序列位于所述多 肽的C末端。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是一种核酸分子或其转录本 (mRNA)，所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种蓬乱蛋白的用途，用于筛选调节蓬乱蛋白 与e -连环蛋白相互作用的调节剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。


图1显示了正常组织和结肠癌样本中Dvl3的分布情况。由图显示在结肠 癌样本的细胞核里有大量Dvl3积累，而在正常细胞中Dvl3在细胞质和细胞核 都有分布，且胞质中的量远高于核内。其中，右上角放大图中箭头所示位置为 细胞核。
图2A显示了p-cat本身不能通过与抗Flag抗体结合免疫沉淀得到，只有 在转染了Dvl3-NLS-Flag的情况下内源的p-cat才能在免疫沉淀样品中检测到。
图2B显示了在体外Pull Down实验中用抗myc抗体免疫沉淀 His-卩-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3。
图2C显示了只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的p-cat。
图3A显示了用抗myc抗体免疫沉淀His-P-cat-myc时能够共沉淀到 His-C一flag。图3B显示了在共转染了 C-NLS-Flag的情况下，用抗HA抗体免疫沉淀
Dvll-NLS-HA不能共沉淀到p-cat-myc。
图3C显示了 Dvl 1-C-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性。 图3D显示了在SW480细胞中，Dvl 1-C-NLS对Topflash活性的抑制是剂
量依赖的，其中，"+ "表示含lOOng Dvl-C-NLS， " + + "表示含200ng
Dvl-C-NLS。
图犯显示了在Wnt3a刺激下，(3-cat和TCF-4能够结合到Wnt信号下游靶 基因c-myc启动子上，在转染Dvl 1-C-NLS片段的细胞中，P-cat结合到下游 耙基因c-myc启动子上的能力显著地降低，而TCF-4基本不受影响。
图4A显示了注射Dvl 1-C-NLS的mRNA的胚胎中km和"W的表达明显 地较对照组胚胎下降。
图4B显示了注射Dvl-C-NLS的mRNA后，t&6和Kox表达正常以及明显下 调的胚胎的统计情况。对99个胚胎统计后有51%的胚胎中";^的表达有明显 下调，对83个胚胎统计后有59%的胚胎对KOx的表达有明显下调(n二71， 83， 89， 99分别表示统计的胚胎数目)。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现在经典Wnt信号转导途径中， 蓬乱蛋白(Dvl)可与e-连环蛋白(e-cat)在Wnt激活的条件下可发生相互作 用，从而促进e-cat的积累及Wnt下游的信号转导途径的异常激活。由于Wnt 下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此依据该新发现的 Dvl禾叩-cat之间的相互作用机制，可提供通过抑制Wnt下游的信号转导从而 实现抑制肿瘤发生的新的药物靶点。在此基础上完成了本发明。
蓬乱蛋白及其活性片段
目前发现的蓬乱蛋白(Dvl)家族成员有三种，即Dvll、 Dvl2、 Dvl3，这三 种蛋白具有较高的同源性。在以往的研究中，Dvl蛋白最初被作为一个细胞质 蛋白参与经典Wnt信号的传递，它的主要功能是在细胞质中接受Wnt信号促使 (3-cat在细胞质中积累从而能够大量进入细胞核中启动下游靶基因的转录。近 来，本领域人员发现Dvl蛋白不仅在细胞质中转导Wnt信号，而且在细胞核中 也具有重要的作用，但对其作用机制尚不了解。然而，本发明人经过长期研究，对此作用机制有了进一步的揭示。
在本发明中，所用的Dvl蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离 自哺乳动物。优选的，所述天然存在的Dvl 1蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl 2蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID N0: 3所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl3蛋白的氨基酸序列可以与SEQIDN0: 4 所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的Dvl蛋白也可以是重组制备的， 比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的Dvl蛋白。优选的，本发明釆 用重组的Dvl蛋白。此外，任何不影响Dvl蛋白的生物活性的变化形式都可用 于本发明中，例如Dvl蛋白的活性片段、衍生物，只要其也具有与P-cat相互 作用的功能，且不会带来其它不良影响，如可以是含有Dvl蛋白第496 695位 氨基酸的蛋白片段。
本发明还提供了一种由Dvl 1蛋白第496 695位氨基酸组成的多肽，本发 明人将之命名为Dvl l-C多肽(片段)，该多肽具有SEQ ID N0: 5所示的氨基酸 序列。
所述的Dvl l-C多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成片 段。所述的Dvl l-C多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使 用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物 细胞)中产生。此外，任何不影响Dv11-C多肽的生物活性的变化形式都可用于 本发明中，例如Dvl 1-C多肽的活性片段、衍生物或经过一个或多个氨基酸(通 常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-IO个)缺失、插入和 /或取代形成的变异体，只要其也具有与P -cat相互作用的功能。
本发明还提供了Dvl l-C多肽的编码基因。所述的编码基因可以是单链的 或是双链的。
优选的，为了使得Dvl 1-C被定位到细胞核中，可将Dvl l-C与核定位 信号(入核信号)相连接；更优选的，可在Dvl 1-C的C末端添加核定位信号。 因此，本发明还提供了一种Dvl l-C-NLS蛋白，其能够与e -cat蛋白相互作用。 在细胞内，所述的Dvl 1-C-NLS被定位到细胞核中，通过与P-cat蛋白竞争结 合，抑制细胞核内Dvl与P-cat的相互作用。
所述的核定位信号是一种信号肽，其可帮助蛋白进入细胞核。本发明可采 用任何不影响Dvl l-C与P-cat蛋白相互作用的核定位信号。例如，所述的核定位信号具有氨基酸序列如下DPKKKRKV DPKKKRKV DPKKKRKV (SEQ ID NO: 7)。 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法或人工合成法来大批量地获得有 关序列。重组法通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增 殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
e-连环蛋白及其活性片段
e-连环蛋白(P-cat)是一种多功能胞内蛋白，不仅参与细胞与细胞间的 黏附，而且能介导Wnt信号的胞内转导。本发明人发现，Dvl蛋白可与P-cat 蛋白发生相互作用。
在本发明中，所用的P-cat蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分 离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的P -cat蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的e-cat蛋白也可以是重组 制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的P-cat蛋白。优选的， 本发明采用重组的P -cat蛋白。
此外，任何不影响e-cat蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中， 例如0-cat蛋白的生物活性片段、衍生物，只要其也具有与Dvl蛋白相互作用 的功能，并且不会带来其它不良影响。
应用及筛选方法
在研究过程中，本发明人通过体外结合实验、体内外、内源结合实验证实 了 Dvl禾叩-cat之间存在相互作用，并分别在真核细胞和模式生物斑马鱼中进 行各种功能分析实验，阐明了Dvl蛋白与e-cat蛋白之间存在相互作用，并且 所述的相互作用对于经典Wnt信号转导途径产生了影响，抑制所述的相互作用 可抑制经典Wnt信号转导途径下游的基因转录。
首先，本发明人利用免疫组化技术检测结肠癌组织以及正常组织中Dvl3的 分布情况。结果发现，在很多结肠癌样本中Dvl3在细胞核里有大量的积累， 而在正常的组织细胞中Dvl在细胞质和细胞核都有分布，而胞质中的量远高于 核内。因此，可见，在肿瘤组织中Dvl蛋白可在细胞核中大量积累。
接着，本发明人利用免疫沉淀技术，分析了 Dvl和p-cat蛋白在细胞核中 的相互作用情况。结果发现，|3-cat本身不能通过与Flag抗体结合免疫沉淀得 到，只有在转染了 Dvl3-NLS-Flag的情况下内源的(5-cat才能在免疫沉淀样品中检测到，这提示Dvl在细胞内可以和p-cat发生蛋白质相互作用。进一步的 体外Pull Down实验证明，用myc抗体免疫沉淀His-(3-cat-myc可以共沉淀到 His-Dvl3，这说明Dvl禾叩-cat之间蛋白质相互作用是直接的。并且，Dvl和 p-catenin在体内存在蛋白质相互作用受到Wnt信号的调节。
进一步地，本发明人通过构建Dvl缺失突变体，深入研究了 Dvl和p-cat 之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径中的功能。通过体外结合发现 His-C-flag和His-(3-cat-myc之间存在直接相互作用。进一步在HEK293T中共 转染含有入核信号的C-NLS-Flag、 Dvll-NLS-HA和(3-catenin-myc质粒，竞争 结合实验发现C-NLS-Flag能够阻断Dvl和p-catenin之间的相互作用。
本发明人还将带有入核信号(NLS)的C片段分别转染入HEK293T细胞中， 通过Topflash报告基因的活性来检测它们对转录复合物的转录活性的影响。 结果证实，Dvl-C-NLS片段是在核里p-cat的下游发挥作用的，通过阻断Dvl 和P-catenin的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。
本发明人还利用核染色质免疫沉淀的方法(Chip)来研究Dvl与p-cat之间 的相互作用对Wnt3a激活前后转录复合物形成的影响。结果表明，Dvl与 卩-catenin之间的相互作用对于Wnt3a诱导的转录复合物的形成是必需的。
本发明人还利用模式生物斑马鱼来检测Dvl和(3-catenin之间的相互作用 在生物体中的功能。在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射Dv1-C-NLS的mRNA， 分别在胚胎发育的二个时期动物极细胞包被40%和胚盾时期收获胚胎，利用 原位杂交的技术来检测Wnt信号途径下游基因Ko;f和t&6的表达。结果发现， 注射Dvl-C-NLS的raRNA的胚胎中Ko义和";^的表达明显地较对照组胚胎下降。 这一结果表明，Dvl和(3-cat之间的相互作用在斑马鱼的发育过程中的功能。
基于本发明人的新发现，对Dvl蛋白或其活性片段与P -cat蛋白或其活性 片段相互作用的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)筛选抑 制Dvl蛋白或其活性片段与P -cat蛋白或其活性片段相互作用的物质，从而抑 制经典Wnt信号转导途径的异常激活，以防治由于经典Wnt信号转导途径的异 常激活导致的疾病，如肿瘤。
因此，本发明提供了一种筛选调节Dvl蛋白与P-cat蛋白相互作用的调节 剂方法，通过向Dvl蛋白与P -cat蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并观察Dvl蛋白与P-cat蛋白的相互作用情况来进行筛选。所述方法包
括以下步骤
(a) 将候选物质与Dvl蛋白与P-cat蛋白相互作用的体系接触；和
(b) 检测候选物质对Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的影响；
其中，若所述候选物质可抑制或促进Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用，则 表明该候选物质是调节Dvl蛋白与P -cat蛋白相互作用的调节剂。
更优选的，步骤(a)包括在Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的体系中添 加候选物质；和步骤(b)包括检测Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用情况，并 与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、Dvl蛋白与P-cat 蛋白相互作用的体系。
作为筛选的条件，若测试组中Dvl蛋白与e -cat蛋白相互作用在统计学上 低于(优选显著低于，如低20%;更优选的低40%)对照组，就表明该候选物质 是抑制Dvl蛋白与e -cat蛋白相互作用的调节剂；若测试组中Dvl蛋白与P -cat 蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低于，如高20%;更优选的高40%)对照 组，就表明该候选物质是促进Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的调节剂。
如本文所用，所述的"蓬乱蛋白和(或"与")连环蛋白相互作用的体系" 指一种体系，其中含有蓬乱蛋白和P-连环蛋白，并且蓬乱蛋白和P-连环蛋白可发生相互作用(如相互结合)。
在本发明中，所述的体系选自(但不限于)溶液体系、细胞体系、亚细胞
体系、组织体系、器官体系、或动物体系。
作为本发明的优选方式，所述体系中还包含Wnt家族蛋白。例如，所述的 Wnt家族蛋白包括(但不限于)Wntl、 Wnt3a、 Wnt8。
调节蓬乱蛋白与0-连环蛋白相互作用的物质及其组合物
通过上述方法初步筛选出的调节剂可构成一个筛选库，以便于人们最终可 以从中筛选出能够对于调节Wnt信号途径有用的药物。
本发明还提供了一种通过所述的方法筛选获得的调节Dvl蛋白与P -cat蛋白 相互作用的物质。例如，所述物质是抑制Dvl蛋白与P -cat蛋白相互作用的物质， 如抑制剂、拮抗剂、阻滞剂；或者，所述物质是促进Dvl蛋白与P-cat蛋白相 互作用的物质，如促进剂、激动剂。通常，抑制Dvl蛋白与P-cat蛋白相互作 用的物质可抑制Wnt信号途径的异常激活，从而可防治Wnt信号途径的异常激活导致的疾病，因此，Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的抑制剂、拮抗剂、阻 滞剂是尤其有用的。
此外，针对本发明发现的Dvl蛋白与P-cat蛋白之间的相互作用特性，还 可设计一些通过竞争结合或抑制其中一种蛋白而阻止Dvl蛋白与P-cat蛋白结 合的物质。除了作为本发明的一种优选方式，提供了一种基于Dvl l设计的可 通过竞争性结合e-cat蛋白来阻止胞内Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的物 质，即Dvl 1-C多肽。更优选的，将Dvl l-C多肽与核定位信号(NLS)相连接， 从而其在被导入细胞后，可直接被定位到细胞核中，在细胞核中阻止Dvl蛋白 与P-cat蛋白的相互作用。
所述的Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的调节剂，可以施用于个体，用于 调节细胞内Wnt信号途径的活性。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的 和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8， 尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药 物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、 或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a) Dvl 蛋白与e-cat蛋白相互作用的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。 所述的Dvl蛋白与e-cat蛋白相互作用的调节剂优选一种抑制剂，如Dvl 1-C 多肽。
目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载 体)和细胞中是本领域中的常规技术， 一般人员只要根据本发明的提示，都可 以方便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领 域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增 强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为 原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需 要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多 种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双 杂交系统或免疫共沉淀技术。
在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的 特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是在保持蛋白-蛋白相互作 用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白， 然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用 抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已 经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀 的蛋白。
本发明的主要优点在于
(1) 首次揭示在经典Wnt信号转导途径中，Dvl蛋白可与0 -cat蛋白在Wnt 激活的条件下可发生相互作用，从而促进P -cat的积累及Wnt下游的信号转导 途径的异常激活。
(2) 由于已知Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切 相关，因此，依据本发明的新发现，可提供抑制Wnt下游的信号转导从而实现 抑制肿瘤发生的新的药物靶点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1
Dvl蛋白质在结肠癌组织中定位到细胞核中
本发明人利用常规的免疫组化技术检测结肠癌组织芯片，组织芯片经过二 甲苯脱腊、复水、抗原热修复、染色，然后进行显微成像检测(所采用的芯片 来源于上海芯超生物科技有限公司，检测方法参照其所附的使用说明书)。
结果如图l所示，对比正常的组织细胞，在93例结肠癌样本中有30%左右 的样本中发现Dvl3在细胞核里有大量的积累；而在正常细胞中Dvl3在细胞质 和细胞核都有分布，且胞质中的量远高于核内。
实施例2
Dvl和p-cat相互作用
1. Dvl以及e-cat基因的获得
Dvll基因的获得
设计引物如下正向5'-CTAGTCTAGAGGCGGAGACCAAAATCA-3， (SEQ ID N0: 9)，反向5，-CTAGCTCGAGCATGATGTCCACAAAGAA-3， (SEQ ID NO: 10)。以常规方法制备的鼠cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvll 的序列。
Dvl3基因的获得
设计引物如下正向5，-CTAGTCTAGAGGGCGAGACCAAGAT-3， (SEQ ID NO: 11)，反向5，-CTAGCTCGAGCATCACATCCACAAAGA-3， (SEQ ID NO: 12)。以常规方法制备的人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvl3 的序列。
(3-cat基因的获得
利用常规方法分别针对P-cat蛋白(序列见SEQ ID NO: l)编码基因的5' 和3，末端设计正向和反向引物(在引物中添加Xbal/Xhol酶切位点)，利用所 述引物、以常规方法制备的人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长 p-cat的序列。2. Dvl在细胞内可以和p-cat发生蛋白质相互作用
为了验证Dvl在细胞核中的功能，本发明人采用常规的方法在Dvl基因的 后面引入了一个核定位信号，通过瞬时转染导入细胞，进行功能分析。 ' 为了证实这一相互作用，本发明人首先构建了携带Dvl3-NLS-Flag的载体 pCMV/Dv13-NLS-Flag,方法如下利用引物退火后二端带有的Xbal/Notl酶切 位点的粘端，将NLS的基因序列(序列为5， -CTAGACTAGACCTAGCTCGAGGATC
AG-3， (SEQ ID NO: 8))引入pCMV/Flag(购自Bioscience,自带Flag标签)中， 形成pCMV/NLS-Flag;然后再利用Xbal/Xhol酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经 同样酶切的pCMV/NLS-Flag中，获得重组载体pCMV/Dvl3-NLS-Flag。
接着，在人的胚胎肾细胞HEK293T细胞(ATCC)中瞬时转染该外源的 pCMV/Dvl3-NLS-Flag重组载体，转染后加Wnt3a(Wnt3a通过收获wnt3a/NIH3T3 细胞的培养上清获得，wnt3a/NIH3T3细胞及其培养方法参见尹宗生，张辉等， 《第四军医大学学报》，Vol.26， No.24， p2212-2215， 2006)刺激细胞，收获 细胞，用IX裂解缓冲液(NP40 1%，甘油10%, NaClO. 135M, Tris-CI PH8. 0， PMSF0. 5M, PPi lmM， NaF 10mM, Na3V04 2mM)裂解细胞，离心(14， OOOrpm/lOmin) 后取上清，加入抗Flag抗体(anti-Flag,购自Sigma)和protein A/G Plus agarose珠子，低温旋转3小时，离心(5000rpm/lmin)收集珠子，通过Western 印迹检测珠子上所带的蛋白(上述过程即Pull Down实验)。结果见图2A。
由图2A所示，cat本身不能通过与抗Flag抗体(anti-flag)结合免疫 沉淀得到，只有在转染了 Dvl3-NLS-Flag的情况下内源的(5-cat才能在免疫沉 淀样品中检测到。上述结果提示，Dvl在细胞内可以和(5-cat发生蛋白质相互 作用。
3. Dvl和p-连环蛋白之间蛋白质相互作用是直接的
为了确定Dvl禾叩-cat之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人 首先构建了含有His-Dvl3和His-(5-cat-myc的重组载体。含有His-Dvl3的重 组载体构建如下以SalI/Notl酶切Dv13，将酶切产物克隆入经过同样酶切的 pET28c/His (购自Novagen，自带His标签)中，获得重组载体pET28c/His-Dvl3。 含有His-(5-cat-myc的重组载体构建如下在(3-cat基因的C端连接常规使用 的rayc标签，形成P-cat-myc，然后通过常规的引物设计和PCR技术在(5-cat-myc的末端设置SalI/Notl酶切位点，克隆入经同样酶切的pET28c/His载体(购自 Novagen，自带His标签)中，获得重组载体pET28c/His-p-cat-myc。
接着，利用大肠杆菌表达得到了His-Dvl3和His-p-cat-myc(P-cat-myc)。 重组表达质粒pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-(3-cat-myc分别转化大肠杆菌 BL21，接种单克隆菌落于LB培养液，37。C培养过夜；取上述过夜菌1:100接 种于新鲜的LB培养基中，22'C培养至A600为0.6 0.8，分别加入异丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)达终浓度luM， 22'C培养16 h。离心收集菌体，将菌体溶于 含有0.5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNaseI至 终浓度为25 mg/ml以及MgS04至终浓度20 mM，冰上消化至不粘，高速离心(16000 rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物，进行体外Pull Down实验(实验方法同 前述)。
由图2B所示，在体外Pull Down实验中用抗myc抗体(购自Sigma)免疫沉 淀His-p-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3，这说明Dvl和(3-cat之间蛋白质相 互作用是直接的。
4. Dvl和P-连环蛋白之间相互作用需要Wnt3a的刺激
为了进一步证实(i-cat和Dvl在内源是否存在相互作用，本发明人分别收 获Wnt3a刺激或不刺激的HEK293T细胞(非转染)，分离细胞核得到核组分上 清，分别用IgG和抗Dvl3抗体(anti-Dvl3，购自Santz Cruz)免疫沉淀内源 的Dvl3。
由图2C所示，只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的p-cat。
综上，这些实验一致证明，Dvl和p-cat在体内存在蛋白质相互作用并且这 种相互作用受到Wnt3a信号的调节。
实施例3
Dvl和p-连环蛋白之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径的功能
本发明人通过常规的缺失突变技术对Dvl l进行缺失突变，并验证各突变 体与|3-cat的相互作用情况。结果发现，Dvl l上第496 695位氨基酸是与卩-cat 相互作用的片段(Dvl l-C，简称C)。为了便于后续的克隆，通过常规的引物设 计和PCR技术在Dvl 1-C基因片段的末端设置SalI/Notl(或Xbal/XhoI)酶切位点的序列；另一种情况下，在Dvl 1-C基因片段的C端连接常规使用的Flag(或 myc)标签，形成Dvll-C-flag(或Dvll-C-myc)，然后在Dvl 1-C-flag(或myc) 的末端设置Sall/NotI (或Xbal/Xhol)酶切位点。
首先，构建含有His-C-flag和His-p-cat-myc的重组载体。含有 His-C-flag的重组载体构建如下将C端带有Flag标签的Dvl 1-C-flag用 Sall/NotI酶切，克隆入经同样酶切的pET28c/His载体中，获得重组载体 pET28c/His-C-flag 。
含His-p-cat-myc的重组载体构建同上(即 pET28c/His-(3-cat-myc)。
接着，将前述构建的重组载体分别转化入大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21 中分别表达得到His-C-flag蛋白和His-(3-cat-myc(His-P -cat-myc)蛋白，通 过体外结合发现His-C-flag和His-p-cat-rayc之间存在直接相互作用，如图 3A所示，用抗myc抗体(anti-myc)免疫沉淀His-p-cat-myc时能够共沉淀到 His-C-flag。
进一步地，本发明人在HEK293T中共转染含有C-NLS-Flag、 Dvll-NLS-HA 和(3-cat-myc的质粒pCMV/C-NLS-Flag、pCMV/Dvll-NLS-HA和pCMV/p-cat-myc。 其中，pCMV/C-NLS-Flag重组质粒的构建方法同前pCMV/Dv13-NLS-Flag构建方 法，以Dvl 1-C取代Dvl3。 pCMV/Dvll-NLS-HA重组质粒的构建方法同前 pCMV/Dvl3-NLS-Flag构建方法类似，采用pCMV/HA(购自购自Bioscience,自 带HA标签)取代pCMV/Flag，且以Dvll取代Dvl3。 pCMV/(3-cat-myc重组质粒 的构建方法如下将(3-cat基因用Xbal/Xhol酶切，克隆入经同样酶切的 pCMV/myc载体(购自Bioscience,自带rayc标签)中，获得重组载体 pCMV/(3-cat-myc 。将前述制备的重组载体转染入HEK293T中，分别表达 C-NLS-Flag、 Dvll-NLS-HA和(5-cat-myc。通过竞争结合实验发现，C-NLS-Flag 能够阻断Dvl和(3-cat之间的相互作用。
如图3B所示，在共转染了 C-NLS-Flag的情况下，用抗HA抗体(anti-HA， 购自Sigma)免疫沉淀Dvll-NLS-HA不能共沉淀到(3-cat-rayc。以上实验结果说 明，Dvl l上的片段C是负责和p-cat相互作用的片段。
为了进一步研究所述的相互作用在Wnt/(5-cat信号途径中的作用，本发明 人构建了带有入核信号(NLS)和Dvl 1-C片段的重组载体pCMV/C-NLS (将C-NLS用Xbal/Xhol酶切，克隆入经同样酶切的pCMV载体(购自Bioscience)中)，将 该重组载体转染入HEK293T细胞中，通过Topflash报告基因的活性来检测它 们对转录复合物的转录活性的影响。以常规的LacZ作为空白质粒对照，并且， Wnt3a为在服K293T细胞的培养基中加入Wnt3a的情况，Ctr为不利用Wnt3a
进行刺激、其它条件相同的情况。
由图3C所示，Dvl 1-C-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性。
此外，本发明人还将上述重组载体转染SW180细胞(购自ATCC,是APC蛋 白功能缺失的结肠癌细胞株)，通过T叩flash报告基因的活性来检测它们对转 录复合物的转录活性的影响。Topflash报告基因来源于Upstate公司；报告基 因的活性检测采用Luciferase Reporter Gene Assay, High Sensitivity, 来源于Roche公司，检测方法参见同时提供的使用说明书。
结果如图3D所示，在SW480细胞中，Dvl 1-C-NLS对T叩flash活性的抑 制是剂量依赖的(其中，"+ "表示含100ngDvl-C-NLS， " +屮"表示含300ng Dvl-C-NLS)。该结果进一步证实了 Dvl 1-C-NLS片段是在核里(3-cat的下游发 挥作用的，通过阻断Dvl和(3-cat的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。
从以上的实验本发明人证明了 Dvl和(3-cat之间的相互作用对于Wnt3a激 活的转录活性是必需的。进一步本发明人利用核染色质免疫沉淀的方法(ChIP) 来研究Dvl与p-cat之间的相互作用对Wnt3a激活前后转录复合物形成的影响。 HEK293T细胞加入Wnt3a刺激3小时，然后通过甲醛固定细胞，超声裂解细胞， 预结合等步骤得到可用于免疫沉淀的上清，分别加入IgG抗体(购自sigma)、 P-cat抗体(购自BD. Biotech)或TCF-4抗体(购自Upstate)和protein A/G Plus agarose珠子进行免疫沉淀，然后进行洗涤和洗脱得到可用于PCR扩增的 样品，最后通过Agarose电泳检测。
结果如图3E所示，在Wnt3a刺激下，(3-cat和TCF-4能够结合到Wnt信号 下游靶基因c-rayc启动子上，在转染Dvl 1-C-NLS片段的细胞中，p-cat结合 到下游靶基因c-myc启动子上的能力显著地降低，而TCF-4基本不受影响。这 表明Dvl与(3-cat之间的相互作用对于Wnt3a诱导的转录复合物的形成是必需 的。最后本发明人利用模式生物斑马鱼来检测Dvl和(5-cat之间的相互作用在 生物体中的功能。
本发明人在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射Dvl 1-C-NLS的mRNA。然后， 分别在胚胎发育的二个时期动物极细胞包被40%和胚盾时期(shield phage) 收获胚胎，利用常规的原位杂交技术来检测Wnt信号途径下游基因ro;r和 的表达。并且，以向斑马鱼胚胎细胞内注射绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA来作 为对照。
结果如图4所示，注射Dvl 1-C-NLS的mRNA的胚胎中rax和t&6的表达 明显地较对照组胚胎下降(图4A)，对99个胚胎统计后有51%的胚胎中"义6的 表达有明显下调，对83个胚胎统计后有59%的胚胎对yoy的表达有明显下调(图 4B)。这一结果表明了 Dvl和p-cat之间的相互作用在斑马鱼的发育过程中的功 能，它对于Wnt靶基因的启动子上(5-cat/TCF-4的转录复合物的形成是必需的。
本发明人的上述研究揭示了细胞核内Dvl调节经典Wnt信号途径的分子机 制，揭示了 Dvl与P-cat之间的相互作用的重要性。并且发现，片段Dvl 1-C-NLS 可抑制转录复合物的形成，从而抑制肿瘤发生，该发现为肿瘤药物的筛选提供 了很好的筛选模型方案，为设计分子药物提供了作用的靶位点。
实施例4筛选抑制Dvl与p-cat之间相互作用的物质
如实施例2中"2"所述相同的方法，构建带有pET28c/His-Dvl3和 pET28c/His-(3-cat-myc的重组载体。
测试组添加候选物且转染有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-p-cat-myc 的大肠杆菌BL21细胞体系。
对照组未添加候选物且转染有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-P-cat-myc 的大肠杆菌BL21细胞体系。
采用如实施例2的Pu11 Down实验，检测测试组以及对照组中Dvl 3蛋白与 (5-cat蛋白相互作用情况。
如果与不添加候选物质的对照组相比较，添加候选物质后Dvl 3蛋白与 P - c at蛋白的相互作用明显被抑制(如利用抗my c抗体免疫沉淀共转染 His-卩-cat-myc与His-Dvl3的体系无法共沉淀到His-Dvl3),则说明该候选物质 是抑制Dvl蛋白与(5-cat蛋白之间相互作用的物质，因而是一种预期可影响Wnt信号转导途径的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120〉蓬乱蛋白和e-连环蛋白之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径中的新功能 <130〉 071528 <160> 12
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1 <211〉 781 <212> PRT
<213〉 智人(Homo sapiens) <400> 1
Met Ala Thr Gin Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro
15 10 15
Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gin Gin Gin Ser Tyr Leu Asp
20 25 30
Ser Gly lie His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly
35 40 45
Lys Gly Asn Pro Glu Glu Glu Asp Val Asp Thr Ser Gin Val Leu Tyr
50 55 60
Glu Trp Glu Gin Gly Phe Ser Gin Ser Phe Thr Gin Glu Gin Val Ala 65 70 75 80
Asp lie Asp Gly Gin Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gin Arg Val Arg Ala
85 90 95
Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gin lie Pro Ser Thr
100 105 110
Gin Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn Val Gin Arg Leu Ala Glu Pro
115 120 125
Ser Gin Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu lie Asn Tyr Gin Asp
130 135 140
Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala lie Pro Glu Uu Thr Lys Leu Uu 145 150 155 160
Asn Asp Glu Asp Gin Val Val Val Asn Lys Ala AI3 Val Met V3I His
165 170 175
Gin Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg His Ala lie Met Arg Ser Pro
180 185 190
Gin Met Val Ser Ala lie Val Arg Thr Met Gin Asn Thr Asn Asp Val
195 200 205
Glu Thr Ala Arg Cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His His
210 215 220
Arg Glu Gly Leu Leu Ala lie Phe Lys Ser Gly Gly lie Pro Ala Leu 225 230 235 240
Val Lys Met Leu Gly Ser Pro Val Asp Ser Val Uu Phe Tyr Ala lie
245 250 255
Thr Thr Uu His Asn Leu Uu Leu His Gin Glu Gly Ala Lys Met Ala
260 265 270
Val Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gin Lys Met Val Ala Leu Leu Asn Lys 275 280 285Thr Asn Val Lys Phe Leu Ala lie Thr Thr Asp Cys Leu Gin lie Leu
2卯 295 300
Ala Tyr Gly Asn Gin Glu Ser Lys Leu lie lie Leu Ala Ser Gly Gly 305 310 315 320
Pro Gin Ala Leu Val Asn lie Met Arg Thr Tyr Thr Tyr Glu Lys Leu
325 330 335
Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys Val Leu Ser Val Cys Ser Ser
340 345 350
Asn Lys Pro Ala lie Val Glu Ala Gly Gly Met Gin Ala Leu Gly Leu
355 360 365
His Leu Thr Asp Pro Ser Gin Arg Leu Val Gin Asn Cys Leu Trp Thr
370 375 380
Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gin Glu Gly Met Glu Gly 385 390 395 400
Leu Leu Gly Thr Leu Val Gin Leu Leu Gly Ser Asp Asp lie Asn Val
405 410 415
Val Thr Cys Ala Ala Gly lie Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Asn Lys Met Met Val Cys Gin Val Gly Gly lie Glu Ala Leu Val
435 440 445
Arg Thr Val Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp lie Thr Glu Pro Ala
450 455 460
lie Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gin Glu Ala Glu Met 465 470 475 480
Ala Gin Asn Ala Val Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro Val Val Val Lys
485 490 495
Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu lie Lys Ala Thr Val Gly
500 505 510
Leu lie Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Arg
515 520 525
Glu Gin Gly Ala lie Pro Arg Leu Val Gin Uu Leu Val Arg Ala His
530 535 540
Gin Asp Thr Gin Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr Gin Gin Gin Phe 545 550 555 560
Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu lie Val Glu Gly Cys Thr Gly Ala
565 570 575
Leu His lie Leu Ala Arg Asp Val His Asn Arg lie Val lie Arg Gly
580 585 590
Leu Asn Thr lie Pro Leu Phe Val Gin Leu Leu Tyr Ser Pro lie Glu
595 600 605
Asn lie Gin Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu Leu Ala Gin Asp
610 615 620
Lys Glu Ala Ala Glu Ala lie Glu Ala Glu Gly Ala Thr Ala Pro Leu 625 630 635 640
Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ala
645 650 655
Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gin Asp Tyr Lys Lys
660 665 670
Arg Leu Ser Val Glu Uu Thr Ser Ser Uu Phe Arg Thr Glu Pro Met
675 680 685
Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Uu Asp lie Gly Ala Gin Gly
690 695 700
Glu Ala Leu Gly Tyr Arg Gin Asp Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Phe His 705 710 715 720
Ser Gly Gly Tyr Gly Gin Asp Ala Leu Gly Met Asp Pro Met Met GluHis Glu Met
Leu Pro Asp 755
Gly Asp Ser 770
725
Gly Gly His His Pro 740
Leu Gly His Ala
Asn Gin Leu Ala 775
Gin 760 Trp
Gly 745 Asp
Phe
730 Ala
Leu
Asp
Asp Met Thr
Tyr
Asp
Asp 780
Pro
Gly 765 Leu
Val 750 Leu
735 Asp
Pro
Gly Pro
<210〉 2
<211> 690
<212〉 PRT
<213〉 鼠(Mus musculus)
<400〉 2
Met 1
Tyr
Phe
Phe
Asp
65
Leu
Asp
Gly
Asn
Arg 145 Gly
Val
Glu
Ser
Arg 225 Met
Phe
Gly
Gly
Phe
Ala
Leu
Lys
Lys
50
Asp
Val
Ser
Asp
Glu 130 Arg
Asp
Leu
Asp
Arg 210 Gin
Ser
Leu
lie
Arg 290 Glu
Glu
Val
Asn
35
Ser
Asn
Leu
His
Ser 115 Thr
Arg
Arg
Ser
Asn 195 Leu
Thr
Leu
Gly
Tyr 275 lie
Asn
Thr
Lys
20
Val
Met
Ala
Ala
Thr 100 Arg
Gly
Asn
Arg
Ser 180 Thr
Val
Asp
Asn
lie 260 lie
Glu
Met
Lys 5
Leu
Leu
Asp
Lys
Glu
85
Asp
Pro
Thr
Arg
Arg 165 Glu
Ser
Arg
Arg
lie 245 Ser
Gly
Pro
Ser
lie
Pro
Ser
Gin
leu
70
Gly
Leu
Pro
Glu
Asp 150 Asp
Leu
Arg
Lys
lie
Val
Asn
Asp
55
Pro
Ala
Pro
Ser
Ser 135 Glu
Leu
Glu
teu
His 215 Ala Ser 230
lie Thr
lie Val
Ser lie
Gly Asp 295 Asn Asp
Tyr
Ala
Arg
40
Phe
Cys
His
Pro
Phe 120 Met
Ala
Gly
Ser
Ser 200 Lys
Ser
Val
Gly
Met 280 Met
Asp
His
Pro
25
Pro
Gly
Phe
Ser
Pro 105 Gin
Val
Ala
Leu
Ser 185 Ser
Cys
Phe
Thr
Gin 265 Lys
Met
10
Glu
Val
Val
Asn
Asp
90
Leu
Ser
Ser
Arg
Pro 170 Ser
Ser
Arg
Ser
Leu 250 Ser
Gly Leu Leu Ala Val
Asp Glu Glu Glu Thr Pro 15
Arg Val Thr Leu Ala Asp 30
His Ala Tyr Lys Phe Phe 45
Val Lys Glu Glu lie Phe 60
Gly Arg Val Val Ser Trp 75 80 Ala Gly Ser Gin Gly Thr 95
Glu Arg Thr Gly Gly lie 110
Ser Arg Asp Gly Met Asp 125
His Arg Arg Glu Arg Ala 140
Thr Asn Gly His Pro Arg 155 160 Pro Asp Ser Ala Ser Thr 175
Phe lie Asp Ser Asp Glu 190
Thr Glu Gin Ser Asn Ser 205
Arg Arg Lys Gin Arg Leu 220
Ser lie Thr Asp Ser Thr 235 240 Asn Met Glu Arg His His 255
Asn Asp Arg Gly Asp Gly 270
Gly Ala Val Ala Ala Asp 285
Gin Val Asn Asp Vsl Asn 300
Arg Val Leu Arg Glu lieVal Ser Gin Thr Gly Pro lie Ser Leu Thr Val Ala Lys Cys Trp Asp
325 330 335
Pro Thr Pro Arg Ser Tyr Phe Thr lie Pro Arg Ala Asp Pro Val Arg
340 345 350
Pro lie Asp Pro Ala Ala Trp Leu Ser His Thr Ala Ala Leu Thr Gly
355 360 365
Ala Leu Pro Arg Tyr Gly Thr Ser Pro Cys Ser Ser Ala lie Thr Arg
370 375 380
Thr Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Ser Val Pro Gly Ala Pro Gin Leu 385 390 395 400
Glu Glu Ala Pro Leu Thr Val Lys Ser Asp Met Ser Ala lie Val Arg
405 410 415
Val Met Gin Leu Pro Asp Ser Gly Leu Glu lie Arg Asp Arg Met Trp
420 425 430
Leu Lys lie Thr lie Ala Asn Ala Val lie Gly Ala Asp Val Val Asp
435 440 445
Trp Leu Tyr Thr His Val Glu Gly Phe Lys Glu Arg Arg Glu Ala Arg
450 455 460
Lys Tyr Ala Ser Ser Met Leu Lys His Gly Phe Leu Arg His Thr Val 465 470 475 480
Asn Lys lie Thr Phe Ser Glu Gin Cys Tyr Tyr Val Phe Gly Asp Leu
485 490 495
Cys Ser Asn Leu Ala Ser Leu Asn Leu Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ala
500 505 510
Ser Asp Gin Asp Thr Leu Ala Pro Leu Pro His Pro Ser Val Pro Trp
515 520 525
Pro Leu Gly Gin Gly Tyr Pro Tyr Gin Tyr Pro Gly Pro Pro Pro Cys
530 535 540
Phe Pro Pro Ala Tyr Gin Asp Pro Gly Phe Ser Cys Gly Ser Gly Ser 545 550 555 560
Ala Gly Ser Gin Gin Ser Glu Gly Ser Lys Ser Ser Gly Ser Thr Arg
565 570 575
Ser Ser His Arg Thr Pro Gly Arg Glu Glu Arg Arg Ala Thr Gly Ala
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ser Asp His Thr Val Pro Ser Gly Ser Gly
595 600 605
Ser Thr Gly Trp Trp Glu Arg Pro Val Ser Gin Leu Ser Arg Gly Ser
610 615 620
Ser Pro Arg Ser Gin Ala Ser Ala Val Ala Pro Gly Leu Pro Pro Uu 625 630 635 640
His Pro Leu Thr Lys Ala Tyr Ala Val Val Gly Gly Pro Pro Gly Gly
645 650 655
Pro Pro Val Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Pro Glu Leu Thr Gly Ser
660 665 670
Arg Gin Ser Phe Gin Lys Ala Met Gly Asn Pro Cys Glu Phe Phe Val 675 680 685
Asp lie 690
说明书第22/28页
<210〉 3
<211> 736
<212〉 PRT
<213〉 智人(Homo sapiens)<400> 3
Gly
Met Ala 1
lie Tyr
Val Pro
Arg Pro 50
Gly Val 65
Phe Asn
Pro Glu
Pro Ala
Gly Asp 130 Glu Asn 145
Arg Glu
His Arg
Glu Ser
Gly Asp 210 Glu Gin 225
Lys Gin
Thr Asp
Glu Lys
Arg Gly 290 Vsl Ala 305
Asn Asp
Leu Arg
Lys Cys
Glu Pro 370 Als Leu 385
Thr lie
His
Ala
35
Ala
Val
Gly
Met
Pro 115
Ser
Leu
Arg
Thr
Ser 195 Ser
Ser
Arg
Ser
Tyr 275 Asp
Ala
Met
Asp
Trp 355 lie
Thr
Thr
Ser
Leu
20
Glu
Gly
Lys
Arg
Ala 100 Pro
Arg
Glu
Pro
Gly 180 Ser
Asp
Ser
Pro
Thr 260 Asn
Gly
Asp
Asn
lie 340 Asp
Gin
Gly
Ser
Ser 5
Asp
Arg
Ala
Glu
Val
85
Pro
Leu
Pro
Pro
Arg 165 Gly
Thr
Glu
Ala
Pro 245 Met
Phe
Gly
Gly
Phe 325 Val
Pro
Pro
Thr
Gly 405
Thr
Glu
lie
Lys
Glu
70
Val
Pro
Pro
Pro
Glu 150 Arg
Pro
Leu
Glu
Ser 230 Arg
Ser
Leu
lie
Arg 310 Glu
His
Ser
lie
Phe 390 Ser
Gly
Glu
Thr
Tyr
55
lie
Ser
Val
Pro
Ser 135 Thr
Arg
Ser
Met
Asp 215 Arg
Leu
Leu
Gly
Tyr 295 lie
Asn
Lys
Pro
Asp 375 Pro
Ser
Gly
Glu
Leu
40
Phe
Ser
Trp
His
Leu 120 Phe
Glu
Asp
Arg
Thr 200 Thr
Leu
Glu
Asn
lie 280 lie
Glu
Met
Pro
Gin 360 Pro
Ala
Leu
Gly
Thr
25
Gly
Phe
Asp
Leu
Glu 105 Pro
His
Thr
Ser
I>eu 185 Ser
Met
Leu
Arg
lie 265 Ser
Gly
Pro
Ser
Gly 345 Ala
Ala
Tyr
Pro
Gly
10
Pro
Asp
Lys
Asp
Val
90
Pro
Pro
Pro
Glu
Ser 170 Glu
Glu
Ser
Lys
Thr 250 lie
lie
Ser
Gly
Asn 330 Pro
Tyr
Ala
Pro
Asp 楊
Val
Tyr
Phe
Ser
Asn
75
Ser
Arg
Glu
Asn
Ser 155 Glu
Arg
Leu
Arg
Arg 235 Ser
Thr
Val
lie
Asp 315 Asp
lie
Phe
Trp
Gly 395 Gly
Gly
Leu
Lys
Met
60
Ala
Ser
Ala
Arg
Val
Val
His
His
Glu
Phe 220 His
Ser
Val
Gly
Met 300 Met
Asp
Val
Thr
Val 380 Ser
Cys
Glu
Val
Ser
45
Asp
Arg
Asp
Glu
Thr 125 Ser
Val
Gly
Leu
Ser 205 Ser
Arg
Phe
Thr
Gin 285 Lys
Leu
Ala
Leu
Leu 365 Ser
Ser
Glu
Thr
Lys
30
Val
Gin
Leu
Asn
Leu 110 Ser
Ser
Ser
Ala
Ala 190 Thr
Ser
Arg
Ser
Leu 270 Ser
Gly
Leu
Val
Thr 350 Pro
His
Ser
Gly
Lys Val 15
lie Pro
Leu Gin
Asp Phe
Pro Cys
80 Pro Gin 95
Ala Pro
Gly lie
Ser His
Leu Arg 160 Gly Gly 175
Gly Tyr
Ser Leu
Ser Thr
Arg Arg 240 Ser Val 255
Asn Met
Asn Glu
Gly Ala
Gin Val 320 Arg Val 335
Val Ala
Arg Asn
Ser Ala
Met Ser 400 Arg Gly 415Leu
Pro
lie
His 465 Gly
Phe
Glu
Gly
Trp 545 Tyr
Gly
Gly
Glu
Ser 625 Ser
Asn
Met
Pro
Arg 705 Phe
Ser
Glu
Pro 顿 Val
Leu
Ser
Ser
Ala 530 Pro
Ser
Gly
Ser
Arg 610 Ser
Asp
Leu
Ala
Pro 690 Asp
His
Val His 420 Ser Gly 435
Asn Ala
Glu Gly
Leu Lys
Glu Gin 500 Tyr Leu 515
Ser Asp
Leu Leu
Pro Gin
Gly Ser 580 Thr Arg 595
Ala Pro
Arg Gly
Gly Gly
Arg Als 660 Leu Pro 675
Pro Val Leu Gly Met Ala
Thr
Leu
Phe
Phe
Ala 485 Cys
Val
Gin
Pro
Pro 565 Ala
Ser
Glu
Gly
Pro 645 His
Tyr
Pro
Ser
Met 725
Asp
Glu
Leu
Pro 470 Gly
Tyr
Asn
Asp
Thr 550 Pro
Ser
Asp
Ser
Ser 630 Pro
Pro
Asn
Pro
Val 710 Gly
Met
Val
Gly 455 Glu
Leu
Tyr
Leu
Thr 535 Phe
Pro
Ser
Gly
Lys 615 Leu
Pro
Gly
Pro
Ala 695 Pro
Asn
Ala Ser 425 Arg Asp 440
Ser Asp
Arg Arg
lie Arg
Val Phe 505 Ser Leu 520
Leu Ala
Ser Tyr
Tyr His
Gin His 585 Gly Ala 600
Ser Gly
Arg Arg
Ser Arg
Leu His 665 Met Met 680
Val Gin Pro Glu Pro Ser
Val
Arg
Val
Glu
His 490 Gly
Asn
Pro
Gin
Glu 570 Ser
Gly
Ser
Gly
Gly 650 Pro
Val
Pro
Leu
Glu 730
Thr
Met
Val
Ala 475 Thr
Asp
Asp
Leu
Tyr 555 Leu
Glu
Arg
Gly
Gly 635 Ser
Tyr
Val
Pro
Thr 715 Phe
Lys
Trp
Asp 柳 Arg
Val
Leu
Asn
Pro 540 Pro
Ser
Gly
Thr
Ser 620 Glu
Thr
Gly
Met
Gly 700 Ala
Phe
Ala
Leu 445 Trp
I>ys
Asn
Ser
Asp 525 Gly
Ala
Ser
Ser
Gly 605 Glu
Ala
Gly
Pro
Met 685 Ala
Ser
Val
Met 430 乙ys
Leu
Tyr
Lys
Gly 510 Gly
Ala
Pro
Tyr
Arg 590 Arg
Ser
Ser
Gly
Pro 670 Pro
Pro
Arg
Asp
Ala Al3
lie Thr
Tyr His
Ala Ser 480 lie Thr 495
Gly Cys
Ser Ser
Thr Pro
His Pro 560 Thr Tyr 575
Ser Ser
Pro Glu
Glu Pro
Gly Thr 640 Ala Pro 655
Pro Gly
Pro Pro
Pro Val
Gin Ser 720 Val Met 735
<210〉 4 <211> 716 <212〉 PRT
<213> 智人(Homo sapiens) <400> 4
Met Gly Glu Thr Lys lie lie Tyr His Leu Asp Gly Gin Glu Thr Pro
15 10 15
Tyr Leu Val Lys Leu Pro Leu Pro Ala Glu Arg Val Thr Leu Ala Asp
20 25 30
Phe Lys Gly Val Leu Gin Arg Pro Ser Tyr Lys Phe Phe Phe Lys Ser 35 40 45Met Asp Asp Asp Phe Gly Val Val Lys Glu Glu lie Ser Asp Asp Asn
50 55 60
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Asn Gly Arg Val Val Tyr Trp Uu Val Ser 65 70 75 80
Ala Glu Gly Ser His Pro Asp Pro Ala Pro Phe Cys Ala Asp Asn Pro
85 90 95
Ser Glu Leu Pro Pro Pro Met Glu Arg Thr Gly Gly lie Gly Asp Ser
100 105 110
Arg Pro Pro Ser Phe His Pro His Ala Gly Gly Gly Ser Gin Glu Asn
115 120 125
Leu Asp Asn Asp Thr Glu Thr Asp Ser Leu Val Ser Ala Gin Arg Glu
130 135 140
Arg Pro Arg Arg Arg Asp Gly Pro Glu His Ala Thr Arg Leu Asn Gly 145 150 155 160
Thr Ala Lys Gly Glu Arg Arg Arg Glu Pro Gly Gly Tyr Asp Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Met Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Ser Phe Phe Asp Ser
180 185 190
Asp Glu Asp Asp Ser Thr Ser Arg Phe Ser Ser Ser Thr Glu Gin Ser
195 200 205
Ser Ala Ser Arg Leu Met Arg Arg His Lys Arg Arg Arg Arg Lys Gin
210 215 220
Lys Val Ser Arg lie Glu Arg Ser Ser Ser Phe Ser Ser lie Thr Asp 225 230 235 240
Ser Thr Met Ser Leu Asn lie lie Thr Val Thr Leu Asn Met Glu Lys
245 250 255
Tyr Asn Phe Leu Gly lie Ser lie Val Gly Gin Ser Asn Glu Arg Gly
260 265 270
Asp Gly Gly lie Tyr lie Gly Ser lie Met Lys Gly Gly Ala Val Ala
275 280 285
Ala Asp Gly Arg lie Glu Pro Gly Asp Met Leu Leu Gin Val Asn Glu
290 295 300
lie Asn Phe Glu Asn Met Ser Asn Asp Asp Ala Val Arg Val Leu Arg 305 310 315 320
Glu lie Val His Lys Pro Gly Pro lie Thr Leu Thr Val Ala Lys Cys
325 330 335
Trp Asp Pro Ser Pro Arg Gly Cys Phe Thr Leu Pro Arg Ser Glu Pro
340 345 350
lie Arg Pro lie Asp Pro Ala Ala Trp Val Ser His Thr Ala Ala Met
355 360 365
Thr Gly Thr Phe Pro Ala Tyr Gly Met Ser Pro Ser Leu Ser Thr lie
370 375 380
Thr Ser Thr Ser Ser Ser lie Thr Ser Ser lie Pro Asp Thr Glu Arg 385 390 395 400
Leu Asp Asp Phe His Leu Ser lie His Ser Asp Met Ala Ala lie Val
405 410 415
Lys Ala Met Ala Ser Pro Glu Ser Gly Leu Glu Val Arg Asp Arg Met
420 425 430
Trp Leu Lys lie Thr lie Pro Asn Ala Phe lie Gly Ser Asp Val Val
435 440 445
Asp Trp Leu Tyr His Asn Val Glu Gly Phe Thr Asp Arg Arg Glu Ala
450 455 460
Arg Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Leu Lys Ala Gly Phe lie Arg His Thr 465 470 475 480
Val Asn Lys lie Thr Phe Ser Glu Gin Cys Tyr Tyr lie Phe Gly Asp<formula>formula see original document page 29</formula>130 Leu His Pro 145
Gly Pro Pro
Ser Arg Gin
Val Asp lie 195
135
Leu Thr Lys Ala Tyr Ala Val Val 150 155 Val Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro
165 170 Ser Phe Gin Lys Ala Met Gly Asn 180 185
140
Gly Gly Pro Pro Gly 160
Pro Glu Leu Thr Gly 175
Pro Cys Glu Phe Phe 190
<210〉 6
<211〉 588
<212> DNA
<213〉 鼠(Mus musculus)
<400〉 6
ctgtgcagtaacctcgcatccctgaacctc朋cagtggctccagtggagcctcagatcag60
gacacactggccccactgccCC￡lCCC3tCElgtaccctggcccttgggtca aggctacccc120
taccagtacccaggacccccgccctgcttcccacctgcttaccaggaccctggcttcagc180
tgcggcagcggcagtgctgggagccagcagagtg卿ggagcaagagcagtgggtccaca240
cggagcagccatcggaccccaggccg卿ggagcgccgggcaactggagctgggggtagt300
ggC3gtg犯tC3g3CC3C3Cgggtctggt3gcaccggctg gtgggagcgg360
cctgtcagccagcttagccgtggcagtagccctcgaagtcaggcttcagctgttgcccca420
gggctccccccactgcacccccttacaaaggcctatgcagtagtgggtgggccacctgga480
gggccacctgtccgggagctggctgctgtccctccagaacttacaggtagccgccagtcc540
ttcc犯犯ggccatgggaaacccctgtgagttctttgtggacatcatg588
〈210〉 7
<211> 24
<212> PRT <213〉人工序列
<220〉
<221> MISC—FEATURE <223>核定T立信号
<400> 7
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 15 10 15
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20
<210〉 8
<211〉 94
<212〉 DNA <213〉人工序列
〈220〉
<221> misc_feature
30<223>核定位信号
<400> 8
Ct3g3Ctag3 CCt3gCtCg3 gg3tCC3333 33g33g3g33 3ggt3g3tCC 333333gaag
ag貼aggtag atccaaaaaa g犯gagaaag gtag
60 94
<210> 9
<211〉 27
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc一feature
<223> 引物
<400〉 9
ctagtctaga ggcggagacc aaaatca 27
<210〉 10
<211〉 28
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
<223> 引物
<210> 11
<211> 25
<212〉 DNA
<213>人工序列 4 <220〉
<221> misc一feature
<223〉 引物
<400> 11
ctagtctaga gggcgagacc aagat 25
<210〉 12
〈211> 27
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature
<223〉 引物
<■> 10
ctagctcgag catgatgtcc acaaagaa
<400〉 12
ctagctcgag catcacatcc acaaaga
权利要求
1.一种筛选调节蓬乱蛋白与β-连环蛋白相互作用的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(a)将候选物质与蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的体系接触；和(b)检测候选物质对蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间相互作用的影响；其中，若所述候选物质可抑制或促进蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用，则表明该候选物质是调节蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的调节剂。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括向蓬乱蛋白 和e-连环蛋白相互作用的体系中添加候选物质；和步骤(b)包括检测蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用情况，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用的 体系；若测试组中蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用在统计学上低于对照组，就表明该候选物质是抑制蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用的调节剂；若测试组中蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用在统计学上高于对照组，就表 明该候选物质是促进蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用的调节剂。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述体系选自溶液体系、细胞 体系、或组织体系。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述体系中还包含Wnt蛋白。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对于筛选出的调节剂，进一步测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt 信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是促进蓬乱蛋白和P-连环蛋白之间 的相互作用的促进剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是抑制蓬乱蛋白和e-连环蛋白之间的相互作用的抑制剂。
6. —种通过权利要求1所述的方法获得的调节蓬乱蛋白与P-连环蛋白相互 作用的调节剂。
7. 如权利要求6所述的调节剂，其特征在于，它是抑制剂，所述的抑制剂为 一种多肽，含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
8. 如权利要求7所述的多肽，其特征在于，该多肽还含有核定位信号蛋白的 氨基酸序列。
9. 如权利要求6所述的调节剂，其特征在于，所述的调节剂是一种核酸分子或其转录本，所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
10. —种蓬乱蛋白的用途，其特征在于，用于筛选调节蓬乱蛋白与e-连环蛋白相互作用的调节剂。
全文摘要
本发明公开了一种筛选调节蓬乱蛋白与β-连环蛋白之间相互作用的调节剂的方法。本发明还公开了一种可抑制蓬乱蛋白与β-连环蛋白相互作用的物质，即Dvl 1-C多肽。本发明首次揭示在Wnt信号转导途径中，蓬乱蛋白可与β-连环蛋白发生相互作用，从而影响Wnt下游的信号转导。由于Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此本发明为筛选抑制肿瘤发生发展的药物提供了新靶点。
文档编号G01N33/00GK101308142SQ200710040600
公开日2008年11月19日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者莹 席, 林 李, 伟 王, 王计勇, 甘肖箐 申请人:中国科学院上海生命科学研究院