四糖mag拮抗剂的合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种化学酶法合成双唾液酸化的四糖拮抗剂的合成方法。本发明还提供了两种用于合成制备四糖MAG拮抗剂的中间体，分别为通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的区域选择性和高效性结合到一起，解决了目前化学合成双唾液酸化四糖拮抗剂的所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低，以及酶法中唾液酸转移酶获得困难和只对糖肽的识别等不足，具有底物反应活性高、收率高的优点。因而，本发明为在分子水平上研究唾液酸类拮抗剂与髓磷脂相关糖蛋白之间相互作用具有重要意义。
【专利说明】四糖MAG拮抗剂的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及与髓磷脂相关糖蛋白(MAG)特异性结合的四糖拮抗剂的化学酶法合成方法，属于糖类药物领域。
【背景技术】
[0002]髓憐脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein, MAG)分布于中枢神经系统(CNS)中与轴突接触髓鞘上，对发育中的神经元有促进作用，而对成熟神经元有抑制作用。MAG是一种唾液酸结合蛋白，可与唾液酸糖蛋白和唾液酸糖脂(神经节苷脂)结合，其结合位点为第I个免疫球蛋白样结构域上的精氨酸118(Argll8)。研究发现，用神经氨酸酶去除神经元表面的唾液酸可阻断MAG对神经元突起生长的抑制作用，并证明带有唾液酸的神经节苷酯⑶Ia和GTlb作为神经元的受体介导了 MAG的抑制作用(R.H.Quarles, J.Neurochem., 2007, 100, 1431 - 1448 ;N.R.Mehta, T.Nguyen, J.ff.Bullen, Jr., J.ff.Griffin, andR.L.Schnaar, ACS Chem.Neurosc1., 2010, I, 215 - 222)。大量研究表明，与MAG结合的最小结构单元为GQlb a的结构中处于最外层的双唾液酸化四糖，即 Neu5Ac a (2-3)Gal^ (1-3)[Neu5Aca (2-6)]GalNAc(Neu5Ac=N-acetylneuraminic acid;Gal=galactose;GalNAc=N-acetylgalatosamine) (L.J.S.Yang;C.B.Zeller;N.L.Shaper ; M.Kiso ; A.Hasegawa ; R.E.Shapiro ; R.L.Schnaar, Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A.1996，93，814 - 818)(图1)。而且，MAG结构中由色氨酸59、酪氨酸60、酪氨酸69、酪氨酸116形成较大的疏水口袋，如果对a 2，3链接的唾液酸的C9位进行疏水基团的修饰，则可以明显提高其与MAG的亲和性，然而其内部二糖结构则对MAG的亲和性影响不大(0.Schwardt; H.Gathje; A.Vedani ; S.Mesch; G.Gao ;M.Spreafico; J.0relli ; S.Kelm, B.Ernst, J.Med.Chem.2009, 52, 989-1004)。
[0003]图1是神经节苷酯GQlb a的结构和已报道的双唾液酸化四糖拮抗剂。
[0004]鉴于上述情况，大量合成MAG天然受体拮抗剂及其衍生物对于在分子水平上研究唾液酸糖苷类拮抗剂与MAG受体之间的相互作用，进而发展以其为先导化合物可促进脑部受损神经修复的新型药物具有重大意义。目前，已有文献报道用化学法对相关拮抗剂的合成进行研究(Schwizer, D.; Ciiillijc.H.; Kelm, S.; Porro, M.; Schwardt, 0.; Ernst,B.Bioorg.Med.Chem.2006, 14, 4944-4957; 0., Schwardt; H.Gathje; A.Vedani ; S.Mesch; G.Gao; M.Spreafico; J.0relli ; S.Kelm, B.Ernst, J.Med.Chem.2009, 52, 989-1004)，但是化学法合成需要进行反复的保护与脱保护操作，并且收率较低、立体选择性不高。而且，九碳糖唾液酸由于其自身独特结构，不仅容易形成分子内氢键，且在Cl位的羧基、C3位的脱氧、C5位的氮杂原子取代均使得唾液酸糖苷键的生成成为糖合成领域的难点(J.B.Schwarz, S.D.Kuduk, X.Chen, D.Sames, P.ff.Glunz, andS.J.Danishefsky, J.Am.Chem.Soc.，1999，121，2662-2673)。目前文献报道的化学酶法合成四糖拮抗剂采用的为哺乳动物来源的唾液酸转移酶来催化的两个位置不同唾液酸的引入，但是以哺乳动物来源的唾液酸转移酶进行四糖的合成面临以下两方面的困难:一、哺乳动物来源的唾液酸转移酶均为跨膜蛋白，表达难度大，难以获得一定量的可溶性蛋白；二、该系列酶往往有较强的底物专一性，底物适用性窄，例如目前文献报道中所采用的哺乳动物来源唾液酸转移酶只对糖肽有较高的反应活性(0.Blixt, K.Allin, L.Pereira, A.Datta, andj.C.Paulson, J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5739-5746)。在本发明中所采用的细菌来源的a 2，6唾液酸转移酶PdST对半乳糖或N-乙酰氨基半乳糖胺作为底物都可以识别，不具有严格的底物专一性。因此，需要寻找一种快速、高效合成双唾液酸化四糖拮抗剂的合成方法是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005]针对上述现状，为克服上述现有技术手段的不足，本发明发展了一种高效的化学酶法合成天然四糖拮抗剂及其类似物的方法，为系统研究四糖拮抗剂在神经修复药物方面的应用奠定基础。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]四糖MAG拮抗剂的合成方法，步骤如下:
[0008](I)利用化学法合成P -构型的N-乙酰氨基半乳糖苷GalNAc P 0 R1 (如图2的通式I所示);其中=R1为氢原子、a -或@ -构型丝氨酸残基、a -或e -构型苏氨酸残基、叠氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基、a _或0 _构型取代烷基；
[0009](2)利用“一锅双酶法”将通式I的化合物和半乳糖立体选择性偶联合成二糖GalP (1-3) GalNAcOR1 (如图3的通式II所示)，所述“一锅双酶法”中先后用到的酶分别为半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP);其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或3 -构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a -或3-构型取代烷基；
[0010](3)利用“一锅双酶法” 合成通式III的三糖(如图4所示)，所述“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)和a 2，3唾液酸转移酶(PmSTl);其中-R1为氢原子、a-或(6-构型丝氨酸残基、a-或(6-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、a-或(6-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氣基、羟基或置氣；
[0011](4)利用乙酰化和选择性脱乙酰基的方法，合成含唾液酸衍生物的内酯三糖(如图5的通式IV所示);其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或P -构型苏氨酸残基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或-构型取代烷基；R2为氣原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
[0012](5)利用酶法合成双唾液酸化的内酯四糖(如图6的通式V所示)，所述酶法唾液酸化中用到的酶指a 2，6唾液酸转移酶；其中A1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a-或(6-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a-或(6-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R4为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R5为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；[0013](6)碱性水溶液中水解上述双唾液酸化内酯四糖，得到双唾液酸化的四糖(如图7的通式VI所示)；其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或P -构型苏氨酸残基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或-构型取代烷基；R2为氣原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R4为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R5为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或置氣；
[0014]本发明中，我们利用的细菌来源的a 2，3唾液酸转移酶(PmSTl)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，实现了步骤(3)中三糖的大量合成；对于这两种酶的底物适应性的考察(含 R1 > R2 和 R3 所列基团)可见相关报道(H.Yu, H.Yu, R.KarpelandX.Chen.Bioorg.Med.Chem.12, 2004, 6427; K.Lau, H.Yu, V.Thon, Z.Khedri, M.E.Leon, B.K.TranandX.Chen, Org.Biomol.Chem., 2011, 9，2784)。步骤(4)至步骤(6)中的合成方法和化合物均是全新发明，而且此方法能高效、快速的实现了双唾液酸四糖拮抗剂的大量积累，解决了目前合成双唾液酸化四糖拮抗剂步骤繁琐、效率低、产量低的问题。
[0015]所述步骤(1)中的(6-构型的N-乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成:将半乳糖氨盐酸盐与醋酐进行反应后，将其全部羟基用乙酰基保护；然后在微波条件下进行(6-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得可作为下步酶反应受体的N-乙酰氨基半乳糖苷(图8)。
[0016]所述步骤(2)中的二糖Gaie (1-S)GalNAcOR1合成方法是:将化合物1、半乳糖(1.5-3.0 当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) (1.5-5.0 当量)、MgCl2 (5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol，pH5.0-10.0)配制水溶液，将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)和己 糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，待反应完成后，纯化即可直接获得二糖化合物II。
[0017]所述当量是指物质相互作用时的物质的量的比值，如:半乳糖(1.5-3.0当量)的含义即为:半乳糖与化合物I的物质的量的比为1.5-3.0。下同。
[0018]所述步骤(3)中的a 2，3唾液酸化三糖的合成方法:将化合物I1、9_叠氮-N-乙酰神经氨酸(1.5-5.0当量)、胞苷三磷酸(CTP) (0.5-10.0当量)、MgCl2 (5.0-1OOmmol)和Tris-HCl缓冲液(10-500mmol，pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和a 2，3唾液酸转移酶，实现“一锅双酶法”唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物III。
[0019]所述反应完成采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，展开剂为EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 来检测。
[0020]所述步骤(4)中内酯三糖合成方法是:在冰浴的条件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反应5-24小时后旋蒸蒸干，拌入硅胶，柱分离纯化，得到全乙酰化的化合物IV。之后将全乙酰化的中间体溶于甲醇，加入甲醇钠粉末，使反应体系的PH值保持7-9大约5-10小时，然后柱分离纯化即得化合物IV。
[0021]所述反应完成采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，展开剂为EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 来检测。
[0022]所述步骤(5)中四糖的合成方法是:将化合物IV、CMP-唾液酸衍生物(1.5-5.0当量)、MgCl2(5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 缓冲液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入a 2，6唾液酸转移酶，实现酶法唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物V。
[0023]所述步骤(6)中将化合物V溶于氢氧化钠水溶液(0.1-1mol)中，反应2_12小时，纯化即可直接获得化合物VI。
[0024]通式VI中的叠氮基团，可以进一步通过“点击化学”反应来链接疏水性功能基团。
[0025]当然，可以制备本发明化合物碱加成的盐，这些盐包括在发明之中。
[0026]本发明化合物的碱加成盐优选为药学上可以接受的，与适当的碱(例如碳酸氢钠，碳酸氢钾，氨水)形成无毒的盐，除了药学上可以接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明之中。
[0027]所述步骤(2)中“一锅双酶法”中先后用到的酶分别是E.coliK_12galactokinase (GalK)和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-旦 1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase (BiGalHexNAcP),反应时间为 3-72 小时。
[0028]所述步骤(3)中“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶是NeisseriameningitidisCMP-sialic acid synthetase (NmCSS)和 Pasteurella multocidasialyl transferase I (PmSTl)，反应时间为 5 分钟-30 小时。
[0029]所述步骤(2)和步骤(3)中“一锅双酶法”合成中反应温度为0_37°C，转速为0-240r/min ;所述酶反应的停止方法是向反应中加入与反应液等体积的4°C无水乙醇并在4°C下孵育0-30分钟。
[0030]本发明还提供了两种用于合成制备四糖MAG拮抗剂的中间体，分别为通式IV、V所示的化合物。
[0031 ] 本发明提供了一种高效简捷的化学酶法合成双唾液酸化的四糖拮抗剂的合成方法。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的区域选择性和高效性结合到一起，解决了目前化学合成双唾液酸化四糖拮抗剂的所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低，以及酶法中唾液酸转移酶获得困难和只对糖肽的识别等不足，具有底物反应活性高、收率高的优点。因而，本发明为在分子水平上研究唾液酸类拮抗剂与髓磷脂相关糖蛋白之间相互作用具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1:神经节苷酯GQlb a的结构和已报道的双唾液酸化四糖拮抗剂的结构式。
[0033]图2:通式I所示化合物。
[0034]图3:通式II所示化合物。
[0035]图4:通式III所示化合物。
[0036]图5:通式IV所示化合物。
[0037]图6:通式V所示化合物。
[0038]图7:通式VI所示化合物。
[0039]图8:化学法合成P -构型的单糖化合物I的反应方程式。
[0040]图9 一锅双酶法”合成二糖化合物通式II的反应方程式(现有技术)。
[0041]图:10 一锅双酶法”合成二糖化合物2的反应方程式。
[0042]图11 一锅双酶法”合成三糖化合物通式III的反应方程式(现有技术)。
[0043]图12 一锅双酶法”合成三糖化合物3的反应方程式。[0044]图13:化学法合成内酯三糖4的反应方程式。
[0045]图14:酶法法合成内酯四糖5的反应方程式。
[0046]图15:化学法合成双唾液酸四糖6的反应方程式。
【具体实施方式】
[0047]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应该说明的是，实施例仅是示范性的，并不对本发明构成任何限制。
[0048]本发明中所提及的化合物1、2、3、4、5、6分别对应于R1为叠氮取代烷基、R2为氮乙酰氨基、R3为叠氮、R4为羟基、R5为氮乙酰氨基的通式1、I1、II1、IV、V、VI的化合物。
[0049]下述实施例中所涉及的反应原料、溶剂等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规产品，所涉及的合成方法、工艺，若无特别说明，均为所属领域的常规技术手段。
[0050]实施例1化学酶法合成四糖MAG受体拮抗剂
[0051]步骤如下:
[0052]( I)化学法合成0 -构型的单糖化合物I
[0053]化合物I (GalNAc ^ ProN3)的合成
[0054]反应方程式如图 8所示；
[0055]向500mL圆底烧瓶中加入半乳糖氨盐酸盐(8.0g, 37.1mmol)、醋酐(38mL)、批啶(160mL)、二甲氨基吡啶(DMAP，0.3g，2.46mmol)，室温搅拌12小时。薄层色谱检测(EA:MeOH=IO:1)反应完全后,旋蒸浓缩,之后向反应液中加入甲苯20mL,旋蒸浓缩，反复进行3次。所得固体复溶于300mL甲醇，在4°C条件下静置12小时重结晶。过滤，弃除滤液，收集所得固体，干燥，获得白色固体化合物7(11.7g, 84%)。
[0056]向容积为IOmL的微波专用反应管中加入化合物7 (1.00g，2.57mmol)、1,2-二氯乙焼(5mL)、1-氯-3-丙醇(0.34mL, 5.14mmol),、硫酸-硅胶(17mg)，磁子搅拌，微波条件110°C反应15分钟。按照相同的反应条件，平行开5组相同的反应。之后收集反应液，过滤，二氯甲烷冲洗，滤液用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，半饱和食盐水萃取一次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，蒸干，获得白色固体化合物8(5.45g, 92%)。
[0057]向250mL圆底烧瓶中加入化合物8(4.82g，11.4mmol)、N，N-二甲基甲酰胺(70mL)、叠氮钠(3.7g, 56.9mmol)，110°C搅拌回流12小时。薄层色谱检测(PE:EtOAc=1:8)反应完全后，使用硅藻土过滤，二氯甲烷冲洗，半饱和食盐水40mL萃取，反复三次，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得棕色糖浆状化合物9 (4.4g, 90%)。
[0058]向250mL圆底烧瓶中加入化合物9、甲醇(60mL)、甲醇钠，直至溶液体系pH值到9.5左右，室温搅拌4小时，薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.2)反应完全后，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化，得到白色固体化合物I (3.96g, 90.8%)。参数如下=1HNMR(600MHz，D2O) 8
4.40 (d, J=8.4Hz, 1H)，3.94 (dt, J=I0.8，5.6Hz, 1H)，3.89 (d, J=3.1Hz, 1H)，3.83 (dd, J=19.6，10
?9Hz, 1H), 3.80 - 3.70 (m, 2H)，3.68 (dd, J=I0.8，3.2Hz, 1H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.43 - 3.27 (m，2H), 2.04 (s, 3H), 1.80 (m, 2H).[0059](2) “一锅双酶法”合成二糖化合物 2 [Gal ^ (1-3)GalNAc ^ ProN3]
[0060]“一锅双酶法”的一般操作方法如图9所示(现有技术中的方法)；
[0061]本发明的化合物2 [Gal ^ (1-3) GalNAc ^ ProN3]的合成[0062]反应方程式如图10所示；
[0063]将受体化合物I (200mg)、半乳糖(176mg)、ATP (540mg)、Tris-HCl 缓冲液(lOOmmol, pH7.5)和氯化镁(20mmol) (Tris和氯化镁的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于 50mL 离心管中，加入 GalK (7.2-8.0mg)和 BiGalHexNAcP (8.5 - 11.0mg)，加双蒸水至总体积30mL后，将反应体系置于摇床中，37°C、140r/min孵育48小时。薄层色谱(EtOAc:MeOHiH2O:EtOH=4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇40C、140r/min孵育30min以终止反应。然后将反应体系4°C、12000r/min离心10分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物2(1.03g，83%)。参数如下:1HNMR (600MHz, D2O) 8 4.45 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.40 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.14 (s, 1H)，3.95 (t, J=9
?3Hz, 2H)，3.86 (s, 1H)，3.82 (d, J=I0.8Hz, 1H), 3.79 - 3.68 (m, 4H)，3.65 (d, J=3.5Hz, 2H)，3
?62 (s, 1H)，3.57 (d, J=I0.0Hz, 1H)，3.48 (t, J=8.4Hz, 1H)，3.34 (s, 2H)，1.99 (s, 3H)，1.80 (s，2H).[0064](3 ) “一锅双酶法”合成三糖化合物 3 [9N3Neu5Ac a (2-3) Gal ^ (1-3) GalNAc ^ ProN3]
[0065]“一锅双酶法”唾液酸化的一般操作方法如图11所示(现有技术中的方法);
[0066]本发明的化合物3 [9N3Neu5Ac a (2-3) Gal ^ (1-3) GalNAc ^ ProN3]的合成
[0067]反应方程式如图12所示；
[0068]向50mL离心管中加入 由“一锅双酶法”合成得到的二糖受体2(47mg，0.1mmoI)、9-叠氮-N-乙酰神经氨酸(9N3Neu5Ac，50mg)、胞苷三磷酸(CTP，95mg)、Tris-HCl缓冲液(lOOmmol, pH8.5)和氯化镁(20mmol) (Tris和氯化镁的用量由最终反应液的体积来计算确定)，加双蒸水调节总体积为8mL,振动搅匀后加入酶NmCSS (l_5mg)和PmSTl (0.2-0.6mg),在 37 °C、140r/min 条件下孵育 Ih。薄层色谱跟踪(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，4°C、140r/min孵育0.5h中止反应。之后将反应体系4°C、12000r/min离心10分钟，收集上清液。旋蒸浓缩，通过快速柱分离，获得白色化合物 3 (74.5mg, 95%)。参数如下=1HNMR (600MHz, D2O) 8 4.46 (d, J=8
?4Hz, 2H)，4.13 (s, 1H), 4.01 (d, J=9.6Hz, 1H)，3.94 (m, 3H)，3.86 (s, 1H), 3.85 - 3.42 (m，17H)，3.33 (dd, J=16.1, 9.7Hz, 2H)，2.70 (dd, J=12.0，8.4Hz, 1H)，2.02 (m, 6H)，1.85 -
1.77 (m, 2H)，1.73 (t, J=12.0Hz, 1H) ?
[0069]( 4 )化学法合成内酯三糖4
[0070]化合物3-叠氮丙基-[9-叠氮-5-乙酰氨基-3，5- 二脱氧_D_甘油-a -吡喃九碳酮糖酸-(I ” 一 4’)-内酯]-(2 — 3) -0- P -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) - P -D-2-乙酰氨基-2-脱氧-P -D-吡喃半乳糖苷4的合成
[0071]反应方程式如图13所示；
[0072]向50mL圆底烧瓶中加入化合物3(168mg)、醋酐(4.5mL)、吡啶(9mL)，冰浴条件下搅拌12h。薄层色谱跟踪检测(EA:Me0H=10:1)反应完全后，旋蒸浓缩，之后向反应液中加入2mL甲苯，旋蒸浓缩，反复进行3次。之后，通过快速柱分离，获得白色化合物10 (200mg, 88%)。
[0073]向50mL圆底烧瓶中加入化合物10(107mg)、甲醇(5mL),室温下搅拌溶解，再加入甲醇钠，薄层色谱跟踪(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)检测反应完成后，旋蒸浓缩，通过快速柱分离，获得白色化合物4 (28.3mg, 37%)。参数如下:1HNMR (600MHz，D2O)8 5.23 (t, J=22.2Hz, 1H)，4.52 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.46 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.32-4.21 (m, 2H)，4.09 (d, J=2.8Hz, 1H), 4.00 - 3.48 (m, 20H), 3.43 - 3.37 (m, 1H)，3.33 (m, 2H)，2.55 (dd_，J=13.8，8.4Hz, 1H), 2.11-1.94 (m, 7H)，1.84 - 1.73 (m, 3H).[0074]( 5 )酶法法合成内酯四糖5
[0075]化合物3-叠氮丙基-[9-叠氮-5-乙酰氨基-3，5_ 二脱氧_D_甘油-a -2-吡喃九碳酮糖酸_(1”一 4’)-内酯]_(2 — 3)-0-0-D-吡喃半乳糖基-a — 3)-[(5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-P-D-吡喃九碳酮糖酸)_(2 — 6)]-^-D-2-乙酰氨基_2_脱氧-0 -D-吡喃半乳糖苷5的合成
[0076]反应方程式如图14所示；
[0077]向50mL离心管中加入由内酯三糖受体4(20mg，0.026mmol)、胞苷二磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac, 0.079mmol)、双蒸水3mL,调节溶液pH值至中性，加入酶PdST (0.2Img)，加双蒸水调节总体积为4mL，在37 V、140r/min条件下孵育2h。薄层色谱跟踪(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)检测反应完成后，旋蒸浓缩，通过快速柱分离，获得白色化合物 5 (24.6mg, 89%)。参数如下=1HNMR (600MHz, D2O) 8 5.22 (d, J=4.0Hz, IH),4.51 (m, J=8.4Hz, 1H)，4.44 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.32 - 4.20 (m, 1H)，4.13 (m, 1H)，4.00 -
3.46 (m, 21H) , 3.4 3 - 3.26 (m, 3H) , 2.68 (dd, J=12.0，4.2Hz, 1H) , 2.55 (dd, J=13.8，5.4Hz, 1H)，1.99 (m, 6H)，1.84 - 1.71 (m, 3H)，1.64 (t, J=12.0Hz, 1H) ?
[0078]5.化学法合成双 唾液酸四糖6
[0079]化合物3-叠氮丙基-[(9-叠氮-5-乙酰氨基-3，5_ 二脱氧_D_甘油-a -吡喃九碳酮糖酸)_(2 — 3)]-P-D-吡喃半乳糖基-(I — 3) [(5-乙酰氨基_3，5-二脱氧-D-甘油-a -吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 6) ] - P -D-2-乙酰氨基-2-脱氧-P -D-吡喃半乳糖苷6的合成
[0080]反应方程式如图15所示；
[0081]向50mL 圆底烧瓶中加入化合物 5 (24.6mg, 0.023mmol)、ImolNaOH 溶液(ImL),搅拌4小时，薄层色谱(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)跟踪检测反应完成后，加入Imol盐酸中和反应液，之后溶液过0.22 y m的微孔滤膜，通过Bio-gelP2凝胶分子排阻色谱进行组合纯化，获得纯品化合物6(24.09mg, 96%)。参数如下=1HNMR(600MHz, D2O) 8 4.44(d, J=8.2Hz, 2H)，4.14 (d, J=2.8Hz, 1H), 4.06 - 3.98 (m, 1H), 3.98 - 3.42 (m, 26H)，3.37 -3.30 (m, 2H)，2.68 (ddd, J=17.2，12.6，4.6Hz, 2H), 2.07 - 1.92 (m, 7H)，1.85 - 1.72 (-m, 3H), 1.66 (t, J=12.2Hz, 1H) ?
【权利要求】
1.四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤如下: (1)利用化学法合成构型的N-乙酰半乳糖胺，结构如通式I所示，其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或P -构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或Ct -或-构型取代烷基； (2)利用“一锅双酶法”将通式I和半乳糖立体选择性偶联合成二糖GalP(1-3)GalNAcOR1，结构如通式II所示，所述“一锅双酶法”中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中=R1为氢原子、a -或0 -构型丝氨酸残基、a -或P -构型苏氨酸残基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或Ct -或-构型取代烷基； (3)利用“一锅双酶法”合成三糖，结构如通式III所示，所述“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶和a 2，3唾液酸转移酶；其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或3 -构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a -或P -构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮； (4)利用乙酰化和选择性脱乙酰基的方法，合成含唾液酸衍生物的内酯三糖，结构如通式IV所示；其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或P -构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a-或3-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮； (5)利用酶法合成内酯四糖，所述酶法唾液酸化中用到的酶指a2，6唾液酸转移酶，结构如通式V所示；其中=R1为氢原子、a-或P -构型丝氨酸残基、a-或P -构型苏氨酸残基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或-构型取代烷基；R2为氣原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R4为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R5为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或置氣；` (6)碱性水溶液中水解上述双唾液酸化四糖的内酯，得到四糖MAG拮抗剂，结构如通式VI所示；其中=R1为氢原子、a -或P -构型丝氨酸残基、a -或0 -构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a-或3-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R4为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R5为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮。
2.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(1)中的构型的N-乙酰半乳糖胺采用以下方法合成:将半乳糖氨盐酸盐与醋酐进行反应后，将其全部羟基用乙酰基保护；然后在微波条件下进行3 -构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得。
3.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(2)中的二糖Gal P (1-3) GalNAc O R1合成方法是:将化合物1、半乳糖(1.5-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(1.5-5.0 当量)、MgCl2 (5-100mmol)、Tris-HCl 缓冲液(10-500mmol, pH5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的PH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反应完成后，纯化即可直接获得二糖化合物II。
4.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(3)中的a 2，3唾液酸化二糖的合成方法:将化合物I1、唾液酸衍生物(1.5-5.0当量)、胞苷三磷酸(0.5-10.0 当量)、MgCl2 (5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 缓冲液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和a 2，3唾液酸转移酶，实现“一锅双酶法”唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物III。
5.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(4)中内酯三糖合成方法是:在冰浴的条件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反应5-24小时后旋蒸蒸干，拌入硅胶，柱分离纯化，得到全乙酰化的化合物IV ;之后将全乙酰化的中间体溶于甲醇，加入甲醇钠粉末，使反应体系的PH值保持在7-9，反应5-10小时，然后柱分离纯化即得化合物IV。
6.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(5)中四糖的合成方法是:将 化合物IV、CMP-唾液酸衍生物(1.5-5.0当量)、MgCl2(5.0-1OOmmol)和Tris-HCl缓冲液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入a 2，6唾液酸转移酶，实现酶法唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物V。
7.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(6)中将化合物V溶于氢氧化钠水溶液(0.1-1mol)中，反应2-12小时，纯化即可直接获得化合物VI。
8.根据权利要求1所述的四糖MAG拮抗剂的合成方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(3)中“一锅双酶法”合成中反应温度为0-37°C，转速为0-240rpm ;所述酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4°C无水乙醇并在4°C下培育0-30分钟。
9.一种用于制备四糖MAG拮抗剂的中间体，其特征在于:结构如通式IV所示，其中=R1为氢原子、a-或(6-构型丝氨酸残基、a-或(6-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a-或(6-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氣基、羟基或置氣。
10.一种用于制备四糖MAG拮抗剂的中间体，其特征在于:结构如通式V所示，其中=R1为氢原子、a-或(6-构型丝氨酸残基、a-或(6-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或a-或(6-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮；R4为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R5为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮。
【文档编号】C12P19/26GK103525888SQ201310508204
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】曹鸿志, 王凤山, 孟欣 申请人:山东大学