专利名称：硫代羰基化合物的制备及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤相关的药物领域，更具体地是涉及一类含有硫代羰基取代基的异噁唑啉衍生物及其药学上可接受的盐、含有它们的药物组合物和作为抗肿瘤药物的用途。
背景技术：
长期以来，肿瘤都是威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率逐年上升且呈现年轻化趋势。传统细胞毒治疗药物非特异性阻断细胞分裂导致细胞死亡，因此毒副作用大，对正常细胞损害较大。随着对肿瘤细胞信号转导途径研究的不断深入，找到的新型抗肿瘤靶向药物具有多靶向、效率高、副作用小、不易耐药等特点而越来越受到关注。如已上市的甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)、索拉非尼(sorafenib)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、吉非替尼(gefitinib)等新药为临床治疗带来新的契机。
以往异噁唑啉类化合物作为抗菌用途药物的研究较多，与之相关的专利有WO9941244、US70815838等。目前，作为抗肿瘤用途的异噁唑啉化合物的临床研究尚未见报道，对于现有抗肿瘤药物而言，此类化合物结构新颖，初步研究表明某些靶向药效活性较好，具有开发潜力。与抗肿瘤相关的该类结构专利较少，其中WO2009/118748是关于抗生素类抗肿瘤药的研究、US6114367是抑制与多种炎症疾病相关的肿瘤坏死因子(TNF，tumornecrosis factor)的异噁唑啉类化合物研究、US2004204464是关于巨噬细胞迁移抑制因子(MIF，macrophage migration inhibitory factor)抑制剂的研究。相关文献还有Cancer Reseach.39，852-856(1979)；The Journalof Biological Chemistry.277，24976-24982(2002)；Mol CancerTher.7，510-520(2008)。
发明内容
本发明的一个目的是克服传统抗癌药物的缺点与不足，提供一种具有良好抗肿瘤活性、具有通式I的硫代羰基异噁唑啉类衍生物及其药学上可接受的盐。
本发明的另一个目的是提供含有通式I化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用组合物。
本发明的再一个目的是含有通式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用。
现结合本发明的目的对本发明内容进行具体描述。
本发明的通式I化合物具有下述结构式
其中R为
具体的通式I化合物及其代码 Ih(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(环己叉基)氨基硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
Ii(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
Ij(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(对氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
Ik(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(3，4-二氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
Il(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(1-甲基-4-哌啶叉基)氨基硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
Im(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(5-甲基-2-噻吩甲叉基)氨基硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
In(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(对氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺柠檬酸盐。
本发明所述的通式I化合物通过以下步骤合成
其中R的定义同上文所述。制备方法参考WO9941244，以卤代苯甲醛为起始原料制备相应的肟2及卤代肟3，肟基卤化物3与烯丙基乙酰胺4在缚酸剂存在下环合得到5，5与哌嗪反应制得哌嗪基取代的异噁唑啉化合物1，1再与甲硫基取代的化合物反应得到目标化合物I。
本发明所述式I化合物的药学上可接受的盐系指不同衍生物含有的胺基与无机酸、有机酸成盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐等，但不限于此。
本发明化合物的药物组合物制备如下使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份(本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断情况特定的加以应用，所用化合物的量或浓度在较宽的一个范围内调节，通常，活性化合物的量范围为组合物的0.5％～99％(重量)。
通过以下体外和体内生物活性测定实验说明本发明化合物的抗肿瘤作用。
1、体外抗肿瘤活性实验 细胞株骨肉瘤U2OS细胞、结肠癌HT-29细胞、白血病HEL细胞、乳腺癌MCF-7细胞及口腔癌KB细胞均购自中国科学院上海细胞研究所。
细胞培养肿瘤细胞接种在含10％小牛血清，100IU/ml青霉素G钠盐及100ug/ml硫酸链霉素的DMEM培养液中，置37℃、100％相对湿度、含5％CO2的培养箱中，传代3次后备用。
MTT法测定取对数生长期的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后(悬浮细胞无须消化)，悬浮于含10％小牛血清的DMEM培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液，显微镜下用血细胞记数板记数活细胞。96孔培养板每孔接种细胞悬液90μl(细胞浓度调整为8～10×104个/ml)，在37℃、100％相对湿度、含5％CO2、95％空气的培养箱培养24h后，每孔加10μl药液(终浓度设为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml五个浓度)。另外，每个浓度设阴性对照(等浓度DMSO)及空白本底(不加细胞)，各组均设6个复孔。再连续培养24h，然后每孔加入10μl 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h后，仔细吸去上清液(悬浮细胞，需要先离心，再吸去上清)。每孔加入100μl DMSO，置微量振荡器震荡以使结晶完全溶解，酶标仪492nm单波长比色，测定OD值。以下述方法计算细胞生长抑制率作为评价指标。
抑制率(％)＝[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)/(对照组OD均值-空白组OD均值)]×100％。根据细胞生长抑制率，以直线回归方法计算IC50值。
2、体内抗肿瘤活性实验 细胞株黑色素瘤B16细胞，肝癌H22细胞购自中科院上海细胞研究所。
阳性对照药环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司。
仪器PB303-N型千分之一电子天平，梅特勒-托利多公司生产。
动物昆明小鼠，SPF级，雄性，体重18-22g，购于中国医学科学院放射医学研究所。
实验方法取接种瘤株7天，肿瘤生长良好的荷瘤小鼠，无菌条件操作，剔除包膜和坏死部分，选取完好的瘤块，置于玻璃匀浆器内，加入适量生理盐水，配成瘤细胞混悬液，细胞数为(1-2)*107/ml，接种于小鼠右前肢腋部皮下(0.2ml/鼠)，所有操作在30min内完成。次日将接种瘤液小鼠随机分组，即荷瘤对照组，环磷酰胺组(25mg/kg)，Ij组(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)，每组10只。各给药组均腹腔注射给药，每日一次，对照组给予同体积生理盐水。小鼠连续给药10天，末次给药24h后，脱颈椎处死，剥离肿瘤，称取瘤重与动物体重，计算各组小鼠瘤重平均值及抑制率。
抑制率＝[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]*100％ 说明书附图
图1为硫代羰基异噁唑啉衍生物(I)结构式。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅用来解释本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围，文中涉及的专业与科学用语的含义是本领域技术熟练人员所熟知的。发明的化合物经高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)，熔点(m.p.)进行检测，采用核磁共振(1H-NMR)确证其结构。
参考实施例1(中间体1的制备)
3、4二氟苯甲醛为起始原料与盐酸羟胺在碱性、室温条件下反应生成3、4二氟苯肟(中间体2)，再与N-氯代丁二酰亚胺反应生成3、4二氟苯肟氯化物(中间体3)，3与烯丙基乙酰胺低温条件下进行环合反应得到中间体5(±)-N-5-(乙酰胺甲基)-3-(3、4二氟苯基)异噁唑啉，5与无水哌嗪加热反应生成中间体1(±)-N-[[3-[3-氟-4-(1-哌嗪基)苯基]-4、5二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。m.p.160.5-161.3℃，1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ1.81(s，3H，CH3)，3.04-3.62(m，8H，Piperazinyl-H)，4.68-4.72(m，1H，CH)，7.06-7.42(m，3H，Ar-H)，8.09(t，1H，NH)。
实施例1 Ij(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(对氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺。
将1g的中间体1及0.71g的对氟苯甲醛腙基二硫代甲酸甲酯溶于40ml无水乙醇中，通入氮气保护，冷凝器上端接导气管，导气管末端接有一个倒置悬在装有乙醇的烧杯中的玻璃漏斗，在30～50℃反应5-6小时后升温，回流反应5-24小时，TLC检测反应完成后，趁热过滤，滤饼用少量乙酸乙酯淋洗，干燥，得黄色固体1.08g，收率69.9％。m.p.208.8-209.8℃，HPLC99.1％，1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ1.80(s，3H，CH3)，3.19-3.25(m，2H，Isoxazole-CH2)，3.31-4.07(m，8H，Piperazinyl-H)，4.67-4.74(m，1H，CH)，7.10-7.72(m，7H，Ar-H)，8.10(t，1H，NHC＝O)，8.16(s，1H，HC＝N)，11.26(Br，1H，NHC＝S)。
实施例2-4 参照实施例1的操作，区别在于选用了含不同取代基的二硫代甲酸甲酯化合物替代实施例1中的对氟苯甲醛腙基二硫代甲酸甲酯，与中间体1反应制备以下式I化合物。
实施例5 制备化合物Ij的柠檬酸盐将0.001mol(约0.5g)的Ij溶于20ml无水乙醇中，加热回流，再加入等摩尔的柠檬酸反应0.5-1h，降温，室温放置12h，析出白色固体，滤出、干燥，得其柠檬酸盐(Il)，m.p.＞220℃。
实施例6 片剂的制备(100片)噻吩 哌啶基 Ij 5.0g 微晶纤维素 3.5g 预胶化淀粉 4.0g 乳糖12.0g 羧甲基淀粉钠1.2g 羟丙甲纤维素0.8g 硬脂酸镁QS 二氧化硅QS 制备工艺将活性成分和辅料预先粉碎过筛100目，称取处方量的主药加辅料(乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素和一半的羧甲淀粉钠)充分混合，过60目筛三次，加入羟丙甲纤维素水溶液混合，制软材，过20目筛，制湿颗粒，于50-60℃干燥后，将剩余羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和二氧化硅预先过筛，然后加入到上述的颗粒中充分混合后，整粒、测定中间体含量，压片。
实施例7 通式I化合物体外抗肿瘤活性实验结果 表1.对体外培养的肿瘤细胞的IC50(μg/ml)
从体外实验结果看，具有I通式的Ih-Im化合物对U2OS细胞、HT-29、HEL、KCF-7细胞及KB细胞均有较强的抑制作用，其中化合物Ij、Ik、Il、Im对5种细胞的IC50值均小于20μg/ml，Ij、Im对3种以上细胞的IC50值均小于10μg/ml 实施例8 具有通式I的化合物体内抗肿瘤活性实验结果 表2.对B16荷瘤小鼠瘤重及抑制率的影响(x±SD)
表3.对H22荷瘤小鼠瘤重及抑制率的影响(x±SD)
从表2可以看出化合物Ij对B16荷瘤小鼠的肿瘤细胞生长有抑制作用，呈剂量依赖关系，腹腔注射给药剂量在25mg/kg时抑制率接近阳性对照药，且＞50％。
从表3可见化合物Ij对H22荷瘤小鼠的肿瘤细胞生长有较显著的抑制作用，腹腔注射给药剂量在25mg/kg时，抑制率(63.31％)超过阳性对照药抑制率(53.24％)。
权利要求
1.具有通式I结构的化合物或其药学上可接受的盐
其中
R为
2.权利要求1所述的通式I化合物或其药学上可接受的盐，代表以下化合物
Ih(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(环己叉基)氨基硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺；
Ii(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺；
Ij(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(对氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺；
Ik(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(3，4-二氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺；
Il(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(1-甲基-4-哌啶叉基)氨基硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺；
Im(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(5-甲基-2-噻吩甲叉基)氨基硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺；
In(±)-N-[[3-[3-氟-4-[4-[(对氟苯甲醛腙基)硫代羰基]-1-哌嗪基]苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑基]甲基]乙酰胺柠檬酸盐。
3.权利要求1所述的通式I化合物的药学上可接受的盐，是指通式I化合物与无机酸或有机酸成盐。
4.一种用于肿瘤治疗的药物组合物，它含有权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，其活性成分含量以重量比例计算在0.5％-99％，优选的范围为1％-50％。
5.权利要求1所述的通式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的用途。
6.权利要求5所述的通式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的用途特别是指治疗骨肉瘤、结肠癌、白血病、乳腺癌、口腔癌及肝癌。
全文摘要
本发明属于抗肿瘤相关的药物领域，提供具有通式I结构的硫代羰基异噁唑啉衍生物及其药学上可接受的盐式中R＝本发明还提供了此类化合物或其药学上可接受的盐作为药物，特别是作为抗肿瘤药物的用途。
文档编号A61P35/00GK101759692SQ20101010105
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者刘冰妮, 刘默, 刘登科, 刘颖, 刘巍, 张智强, 徐为人 申请人:天津药物研究院