专利名称：表皮生长因子受体变异体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人表皮生长因 IlWEGFRvA (Epiderma 1 growth factor receptor variant A,EGFRvA)
酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术：
表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erb B的170千道尔顿(Kilodalton)膜 糖蛋白产物⑴。EGFR基因是最初在鸟类红细胞增多症病毒中识别的erb B致癌基因的细 胞同系物(1’2)。已在各种人类肿瘤中观察到这种致癌基因通过基因放大的活化(3_6)。已有文献表明，EGFR在多种类型的人类实体瘤中过表达(7)。这些肿瘤包括肺癌、 结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和前列腺癌(7)。v-erbB致 癌基因和正常EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌基因是正常受体截断氨基的变 型；它们缺少大部分细胞质外结构域，但保留了跨膜和酪氨酸激酶结构域(8-11)。这导致了它 不能结合表皮生长因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它蛋白质(14_1S。各种基因变化都可以发生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端中发 生氨基酸的取代和缺失。其中氨基端缺失对于致癌作用尤为关键。氨基端缺失是大多v-erb B致癌基因的一个特征，包括由启动子的插入或逆转录病毒转导引起的那些氨基端缺失(13’ ⑹。相反，羧基末端缺失似乎只与逆转录病毒转导引起的肿瘤有关，而且似乎决定于宿主范 围和肿瘤类型的特异性(11’15)。以氨基端缺失的鸟类c-erb B基因或人EGF受体的转染实 验表明该缺失可以使细胞转化(16_17)。EGFR基因的放大发生于40%的恶性人类神经胶质瘤中(3’7)，受体基因的重排在许 多具有基因放大的肿瘤中较为明显。重排似乎更多地影响基因的氨基末端(6’_。迄今已发现至少有八种EGFR变体1) EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域。 2)EGFRvII由EGFR的细胞外结构域中的83aa框内缺失组成。3)EGFRvIII由EGFR的细胞 外结构域中的267aa框内缺失组成。4)EGFRvIV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。5) EGFRvV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。6)EGFR. TDM/2-7含有EGFR的细胞外结构域 中的外显子2-7的重复。7)EGFR. TDM/18-26含有EGFR的细胞外结构域中的外显子1846 的重复。8)另外，存在第二种更为罕见的具有在外显子11和14之间的连接点引入新颖组 氨酸残基的缺失的EGFRvIII突变体(EGFRvIII/Δ 12-13)(24)。EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子(EGF)受体最常见发生的变体(24)。在 基因放大的过程中，在胞外区发生267个氨基酸缺失，产生新的连接点(甘氨酸)。已知 EGFRvIII未表达于任何正常组织(19’2°)。然而，EGFRvIII在许多肿瘤细胞中有表达，例如， 27-76%乳腺癌活检组织检查表达EGFRVIII(21)，50-70%神经胶质瘤表达EGFRvIII(19’22)， 16%非小细胞肺癌表达EGFRVIII(23)，75(%卵巢癌表达EGFRVIII(22)。此外，本发明者所在实 验室在最近也发现了肝癌中有EGFRvIII的存在(25)。然而，迄今为止，人们对于癌症侵袭和转移的原因和机理的了解还不够深入，因此本领域迫切需要开发与癌症侵袭和转移相关的蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的、与癌症侵袭和转移密切相关的表皮生长因子受体 变异体EGFRvA多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的EGFRvA多肽，它包括具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1_10个)氨基酸残基 的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭和/或促进肿瘤细胞迁移功能的 由(a)衍生的多肽；(c)与SEQ ID NO 2氨基酸序列有彡95%同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭或促 进肿瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该EGFRvA突变体缺失了表皮生长因子的胞内区末端的120个氨基酸，并且在末端 又增加了如SEQ ID NO 2中第1091-1136位所示的46个氨基酸构成的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一 核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80% (较佳地至少90%， 更佳地至少95%)相同性(a)编码上述人EGFRvA多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a) 互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更 佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO :1中44-34M位的序列； (b)具有SEQ ID NO :1中1-3763位的序列。在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转 导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。在本发明的第四方面，提供了制备具有人EGFRvA蛋白活性的多肽的方法，该方法 包含(a)在适合表达人EGFRvA蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从 培养物中分离出具有人EGFRvA蛋白活性的多肽。在本发明的第五方面，提供了与上述的人EGFRvA多肽特异性结合的抗体。在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人EGFRvA多肽活性的化合物，以及 抑制人EGFRvA多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳 地，该化合物是人EGFRvA多肽的编码序列或其片段的反义序列。在本发明的第七方面，提供了检测(尤其是非诊断地体外检测)样品中是否存在 EGFRvA蛋白的方法，它包括将样品与EGFRvA蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体 复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EGFRvA蛋白。在本发明的第八方面，提供了一种检测与人EGFRvA多肽异常表达相关的疾病或 疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
4
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可 被用于筛选促进人EGFRvA多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人EGFRvA多肽活性的拮抗剂、 或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人EGFRvA蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物 用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人 EGFRvA多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗乳腺癌、脑胶质瘤 等病症。在另一优选例中，所述的拮抗剂是特异性结合于EGFRvA多肽且不结合于人表皮 生长因子受体的抗体。在本发明的第十一方面，提供了一种确定测试化合物是否是EGFRvA多肽的拮抗 剂或激动剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组；并将体外培 养的相同的肿瘤细胞作为对照组，其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物，并且表达本发明的EGFRvA多肽；(b)观察测试组和对照组中肿瘤细胞的迁移程度，如果测试组的肿瘤细胞的迁移 程度大于对照组，则表示测试化合物是EGFRvA多肽的激动剂；如果测试组的胚泡着床数量 小于对照组，则表示测试化合物是EGFRvA多肽的拮抗剂。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自于人。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。图1 :EGFRvA与EGFR的差异显示图。图2A =EGFRvA在各个正常组织中的RNA水平检测。图2B =EGFR在肿瘤细胞系中的表达(RT-PCR)。图2C =EGFR在肿瘤细胞系中的表达(Western印迹法)。图2D =EGFRvA在肺癌组织中的表达，T是肿瘤组织，N是癌旁组织。图3 =EGFRvA稳定表达细胞系的建立及分析。其中，3A =Western Blot ；3B 流式分 析。图4 =EGFRvA促进细胞的体外增生。图5 =EGFRvA促进细胞在体外的侵袭和迁移。图6 =EGFRvA促进U87细胞在体内的肺转移，其中A显示了荷瘤小鼠的体重；B显 示了荷瘤小鼠的体重变化；C显示了荷瘤小鼠的肺重。* :P < 0. 05，** =P < 0. Olo图7 =EGFRvA与EGFR相比，其稳定表达细胞系对针对EGFR的抑制剂Erotinib的 敏感性要低。图8 =ShRNA的特异性检测，表明所选的shRNA可特异干扰靶序列。其中，mock为 随机引物对照，blank为空白对照。
图9 在H1299细胞内，所选的shRNA可有效抑制相应的EGFR mRNA表达。其中， mock为随机引物对照。图10 在MDA-MB-468细胞内，所选的shRNA可有效抑制相应的EGFR多肽的表达。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现并分离了一种新的EGFR变异体 (EGFRvA)，它有如下几个特征1)在表皮生长因子受体的胞内区末端出现120个氨基酸的 缺失，而增加了 46个新的氨基酸序列。2、它在多种正常组织和肿瘤组织中存在，在某些肿 瘤组织中过表达。幻该变异体在体外能够明显促进肿瘤细胞的侵袭，迁移。4)该变异体在 体内能够明显促进肿瘤细胞的转移。5)与野生型EGFR(EGFRwt)相比，它对小分子激酶抑制 剂的敏感性更低。6) RNA干扰该变异体可导致某些细胞死亡。7)该变异体在一些肺癌病人 中也存在19号外显子或21号外显子的突变。在此基础上完成了本发明。此外，本发明人还开发一些检测这个基因的方法1)用RT-PCR检测该基因及该基 因在19号及21号外显子的突变。2)筛选了一些单克隆抗体用于EGFRvA和EGFRwt的蛋白 水平检测。3)找到了能特异针对EGFRvA的shRNA。 在本发明中，术语“EGFRvA蛋白”、"EGFRvA多肽”或“表皮生长因子受体变异体 EGFRvA’可互换使用，都指具有人表皮生长因子受体变异体EGFRvA氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的表皮生长因子受体变异体EGFRvA。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。如本文所用，“分离的EGFRvA蛋白或多肽”是指EGFRvA多肽基本上不含天然与其 相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯 化EGFRvA蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。EGFRvA 多肽的纯度能用氨基酸序列分析。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多 肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例 如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起 始的甲硫氨酸残基。本发明还包括人EGFRvA蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人EGFRvA蛋白相同的生物学功能或活 性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是 也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合 所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或 分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“人EGFRvA多肽，，指具有人EGFRvA蛋白活性的SEQ IDNO 2序 列的多肽。该术语还包括具有与人EGFRvA蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形 式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳 地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端 添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例 如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又 比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术 语还包括人EGFRvA蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导 突变体、在高或低的严紧度条件下能与人EGFRvA DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用 抗人EGFRvA多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人EGFRvA 多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID N0:3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外， 本发明还包括了人EGFRvA多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人EGFRvA多肽序列的至 少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳 地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供人EGFRvA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人EGFRvA多肽 的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而 有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通 过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技 术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有 非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不 限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。在本发明中，“人EGFRvA蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列 相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似 或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而 产生。表 权利要求
1.一种分离的人EGFRvA多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽；(c)与SEQID NO :2氨基酸序列有彡95%同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿 瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码氨基酸序列如SEQID NO 2所示的多肽更佳地，该多核苷酸的序列选自下组⑴具有SEQ ID NO :1中44-3454位的序列；(ii)具有SEQ ID NO :1中1-3763位的序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人EGFRvA多肽。
8.一种能与权利要求1所述的人EGFRvA多肽特异性结合且不结合于人表皮生长因子 受体的抗体。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽的拮抗 剂以及药学上可接受的载体。
10.一种确定测试化合物是否是EGFRvA多肽的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于， 包括步骤(a)将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组；并将体外培养的 相同的肿瘤细胞作为对照组，其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物，并且表达权利要求1所述的EGFRvA多肽；(b)观察测试组和对照组中肿瘤细胞的迁移程度，如果测试组的肿瘤细胞的迁移程度 大于对照组，则表示测试化合物是EGFRvA多肽的激动剂；如果测试组的胚泡着床数量小于 对照组，则表示测试化合物是EGFRvA多肽的拮抗剂。
全文摘要
本发明提供了一种新的表皮生长因子受体变异体-EGFRvA蛋白，编码EGFRvA蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种EGFRvA蛋白的方法。本发明还公开了编码这种EGFRvA蛋白的多核苷酸的用途。EGFRvA蛋白具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿瘤细胞迁移功能。
文档编号A61K39/395GK102134275SQ201010100949
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者周敏, 李宗海, 杨胜利, 潘晓蓉, 王海, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所