专利名称：发光的转基因非人动物、其后代、细胞衍生物及其应用的制作方法
发光的转基因非人动物、其后代、细胞衍生物及其应用
本发明涉及能在体内合成和表达脱光蛋白(apophotoprotein)的 转基因非人动物及其应用。
背景技术：
干细胞是能长期通过细胞分裂进行自身更新的非特化的细胞(1)。 此外，在某些生理或实验条件下，它们可以分化成不同的细胞类型， 比如搏动的心肌细胞(beating cardiomyocytes )或胰腺的胰島素生 产细胞(2 、 3)。
干细胞可以根据它们的潜力进行细分和分类。全能性干细胞由卵 和精细胞的融合产生。由受精卵细胞的前几次分裂产生的细胞也是全 能性的。这些细胞可以分化为任何类型的细胞。多潜能干细胞是全能 细胞的后代，可以分化成任何细胞类型，全能性干细胞除外。多能干 细胞仅能产生与之紧密相关的细胞家族(举例来说，血细胞，例如红 细胞、白细胞和血小板)。祖(有时称为单能)细胞只能产生一种细 胞类型，但其自我更新能力的特性将它们与非干细胞(3-6 )区别。
干细胞还可以按照它们的来源分类，来源于成体或胚胎，成年千 细胞是在一种特殊组织的已分化细胞中发现的未分化细胞，多为多能 干细胞，能产生几种但有限数目的细胞类型，它们还包含得自嬰儿、 脐带、胎盘和羊水的干细胞。它们也被称为成体干细胞，或组织干细 胞，存在于已分化组织中，在可控方式下，它们分化和/或分裂产生其 起源的组织的所有特化细胞类型(7-9)。
胚胎干细胞具有形成各种特化细胞包括生殖细胞(多能性)的潜 能。它们在允许增殖而不分化的条件培养下(3)，具有无限增殖的能 力。迄今从啮齿动物和人中已发现三种多能胚胎干细胞(10):
衍生自植入前胚泡期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞(ES)。它们 具有正常的核型。已知并且建立了一些老鼠和人胚胎干细胞类型，例
如老鼠ES TBV2、 Rl、 D3细胞(11-13、 63)。
衍生自畸胎癌的胚胎癌细胞(EC)。畸胎癌是性腺瘤，含存在于 来源于三个原胚层(内、中和外胚层)的多种组织的多能干细胞。最 常用的是小鼠EC P19细胞系。这些细胞不具备正常核型(14-18)。
-衍生自胎儿生殖嵴(PGCs )的培养的原生殖细胞的胚胎生殖细胞 (EG)。它们具有正常核型但是遗传印记异常(l9-22)。
ES和EG细胞可以注入受体小鼠的胚泡，产生嵌合动物。在嵌合 小鼠中这些多潜能细胞可以成为各种细胞类型，包括种系细胞(20， 21， 23， 24)。相反，将鼠科EC细胞引入胚胎能移植产生大部分胚胎 镨系，但通常不能移植产生种系细胞，有一个实验例外(25-27 ) 。 EC 细胞无法形成有功能的配子，很可能反映出它们的异常核型(28)。
干细胞是高通量筛选(HTS)技术中一种很有效的工具，因为它们可 以在体外长期培养和扩增，保持自我更新的性质，并且能够进行微型 化。它们允许通过利用可筛选和可诱导标记来制备纯的ES细胞群。基 因靶向/同源重组技术允许敲除(K0)或敲入(KI)特殊的基因。此外胚胎 千细胞可以分化变成类似初级细胞的任何细胞类型，(因为它们是非 肿瘤细胞)。这样它们为靶标提供一种自然环境，它们可以呈递自然 调控和表达的复合目标(像多亚基离子通道)。这是一个重大的改善， 因为通常在HTS筛选中，基于细胞的试验利用肺瘤细胞系建立，而已 知这种肿瘤环境可以改变细胞的生理条件。
在药学领域，利用多潜能胚胎干细胞已获得基础的作用(29)。 例如用于靶标估值，因为成功的药物发现的基础在于了解基因功能， 相对于K0小鼠，鼠科ES细胞是一种更快速和便宜的工具。另外万一 出现致死的K0，利用ES细胞可以有助于基因功能评价。
干细胞也用于胚胎干细胞测试(EST),它由EVCAM (欧洲替代动 物实验方法研究中心)研究进行正面评价。它是针对药物对从3个种 系(内、中和外胚层)产生的细胞和组织分化的毒理学和畸形学试验。 在分析关于由多潜能干细胞分化产生的脉动心肌细胞的变时性活性的 药物副效应时，干细胞也很重要。这类试验可以减少用于毒物学研究的动物数目。例如当前在欧盟销售的多达30000种化学药品在接下来 的IO年里需要重新评价。这意味着利用约一千万只动物。在这种意义 上讲，创建像EST那样的体外试验是至关重要的，它也能允许测试更 多的化学药品，比传统的整体动物试验花费时间更少(30， 31, 32)。 生物发光是活体生物或源自其的物质通过各种的化学发光反应体 系发射可见光的一种现象。生物发光反应需要三个主要部分萤光素 (底物)，荧光素酶(酶)和分子氧。然而， 一些反应也可能需要其 他成分，包括阳离子(Ca"和Mg++)和辅因子(ATP， NAD(P)H)。荧光 素酶是能催化底物萤光素氧化，产生不稳定中间体的酶。当不稳定的 中间体衰退到基态时，产生氧化萤光素，发出光。存在许多不同的没 有关联的萤光素类型，虽然来自至少七个门的很多物种使用相同的萤 光素，称为腔肠素(coelenterazine)。在一些动物(例如水母)中， 萤光素/荧光素酶体系能以稳定的"发光蛋白"形式提取，它结合钾而发 光。发光蛋白区别于荧光素酶的地方在于它们是荧光素酶和费光素的 稳定氧化中间体复合物。
发光蛋白存在于许多海洋腔肠动物中，并允许这些生物因为种种 原因包括繁殖、进食和防卫而发光(33)。存在许多发光的生物，但 是只有七种发光蛋白，即thalassicolin ( 34, 35 )、水母发光蛋白 aequorin( 36, 37， 38 )、 mitrocomin( halistaurin的类似物)(39, 40 )、 clytin(phialidin的类似物)(40, 41)、螅蛋白(34, 38,42, 43 )、 mnemiopsin ( 44, 45 )和瓜水母光蛋白berovin ( 44, 45 )迄今已被分 离。所有这些蛋白质都是由脱辅基蛋白，咪唑并哌唤发色团(即，腔 肠素)和氧形成的复合体。它们的氨基酸序列高度保守，特别是在包 含三个钙结合位点(EF手结构)的区域。术语"发光蛋白"指能发光 的腔肠素结合的多肽，而"脱光蛋白"用来表示没有腔肠素的发光蛋 白。
研究最多的发光蛋白是分离自水母(Aequorea victoria )的水母 发光蛋白(46),以及分离自长薮枝螅水母(Obelia longissima)的 螅蛋白(47)。通过与腔肠素，分子氧，EDTA和2-巯基乙醇或二硫
苏糖醇温育，发光蛋白可从脱光蛋白中再生。由于腔肠素是发光蛋白
水母发光蛋白，mitrocomin， clytin和螅蛋白共同使用的发光底物， 这四种发光蛋白的发光反应很可能是一样的(48， 49， 50， 51)。
研究细胞事件和它们的调控需要灵敏的非侵入的分析方法。发光 蛋白和通常使用的生物发光是极好的报告体系，因为它们与荧光系统 相比，几乎没有背景。
发光蛋白作为报告基因广泛的用在细胞培养体系中，以监视与信 号转导和基因表达相关的细胞事件(33,34,46 )。发光蛋白在哺乳动 物细胞中表达，以监视对不同刺激应答的钙变化。通过添加辅因子腔 肠素到表达脱光蛋白的哺乳动物细胞中并探测指示胞内钓浓度的光子 发射，测定胞内钓浓度。通过利用表达与胞内钾浓度相关的脱光蛋白 和受体的细胞，为筛选影响胞内钾释放的化合物提供有效体系。
高通量筛选试验经常被设计成利用发光蛋白作为报告体系。体系 的敏感性和高信噪比使其能利用小试验体积。
钙通量试验通常在HTS形式下进行，利用适合于同时分析大量样 本并且配备一个发光成像系统的光筛选仪器进行检测。
然而，还可以利用荧光钓染料，例如fluo3、 fluo4、 fura2和钧 染料(分子仪器和分子探针)，利用荧光测定工具如FLIPR (荧光成 像板读出器，分子仪器公司，森尼韦尔，加州，美国)， 一种在HTS 试验中最常用的工具，探测钙浓度的变化。该仪器具备一种光学探测 装置，其允许细胞单层的信号分离从而提高基于细胞试验的灵敏度。
最新的FLIPR⑧系统版本也已经适用于发光试验，虽然同基于CCD 照像机的设备相比，灵敏度有所下降。为了克服系统较低的发光灵敏 度，具有提高光发射的发光蛋白是非常有用的。
本发明的发明者开发了一非人转基因动物，所述非转基因动物通 过对原基因组进行遗传修饰而获得，能表达脱光蛋白。将表达脱光蛋 白的胚胎干细胞注射入假妊娠雌性小鼠的胚泡，再将获得的嵌合体同
野生型小鼠杂交，得到转基因小鼠，作为动物模型。
发明描述
本发明的主题是一种非人转基因动物，其后代和细胞衍生物，它 们能表达脱光蛋白基因，并对胞内钙浓度变化应答，而产生生物发光 信号。细胞衍生物可以是细胞，初级细胞或干细胞、定型细胞、已分 化细胞、细胞群、组织或器官。
在一优选方面，脱光蛋白基因表达和/或应答胞内钙浓度变化的生 物发光信号的产生是普遍存在的。
在另 一个优选方面，脱光蛋白基西表达和/或应答胞内钙浓度变化 的生物发光信号的产生是可诱导的，以及/或者是器官、组织、细胞或 发育阶段特异性的.
在一个优选实施方案中，非人转基因动物是非人哺乳动物，更优 选为啮齿类动物，最优选为小鼠。
本发明的非人转基因动物由本领域已知技术获得，即利用胚胎干 细胞，所述胚胎千细胞能表达脱光蛋白，并且在合适发色团底物存在 下，能应答胞内钙浓度变化产生生物发光信号。发光蛋白以及通常生 物发光经常被当作有效的报告系统。
本发明的非人转基因的动物可以是任何非人动物，所述非人动物 通过对原基因组进行遗传修饰而获得，能表达脱光蛋白。典型地，使 用本领域已知技术获得转基因动物，即将表达脱光蛋白的胚胎干细胞 注射入假妊娠雌性动物的胚泡，再将获得的嵌合体同野生型动物杂交。
脱光蛋白可以是任何脱光蛋白，天然的或重组的或合成的。脱光 蛋白可以是天然产生的或诱变处理的突变体，也具有改善的发光活性 和/或钙灵敏度，或者是来源于两种不同天然脱光蛋白的嵌合蛋白质， 也通过一个或多个氨基酸残基的缺失，添加或置换进行进一步修饰，
只要发光蛋白在发射和钙应答方面的活性保持或增加。脱光蛋白的序 列也可以针对哺乳动物密码子的使用而优化，以及/或者融合到线粒体
靶序列上(52， 53， 54)。现有技术中已公开了具有提高生物发光的脱光 蛋白，即脱光蛋白Photina (在EP 1413584中描述，本文中如SEQ ID No. l所示)，它由蛋白质螅蛋白和Clytin蛋白的某一区域嵌合而成。
具有提高生物发光的脱光蛋白也可衍生自诱变，如
W02006/094805中所述，例如Clytin序列(GenBank登录号Q08121) 在位置Gly142->Cys被诱变处理；或者Clytin序列(GenBank登录号 Q08121)在下面12个位置被诱变处理Gly58->Glu、 Asp69->Val、 Ala70->Cys 、 Lys76—>Arg 、 Lys77->Gly 、 Ile78->Cys 、 Asp8「>Glu 、 Val86->Ile、 Glu87->Ala、 Ala9。->Gln、 Val92 - >Uu和Glu9「>Gln。
报告基因脱光蛋白优选在普遍存在的，或者器官、组织、细胞或 发育阶段特异性的，或者可诱导的启动子的控制下克隆。
干细胞通常指全能和/或多潜能非人细胞；或者人或非人肿瘤多潜 能细胞，或者多能细胞或其祖先，它们是胚胎或成体起源。用于产生 转基因动物的千细胞优选是全能和多能胚胎干细胞。
具体地优选的干细胞是小鼠胚胎干细胞，优选ES TBV2 (63)细胞。
典型地，用包含脱光蛋白编码序列的表达载体稳定转染胚胎干细胞。
最终表达脱光蛋白的阳性克隆基于它们的发光蛋白含量和应答适 宜刺激的能力进行选择。
将胚胎干细胞注入到假妊娠雌性小鼠的胚泡。用这种方式产生的
嵌合小鼠再同其他小鼠杂交，产生转基因杂合动物。 为了获得纯合的动物，将两种杂合动物共同杂交。 本发明的非人转基因的动物是可以用于离体药理学研究或移植实
验的组织或器官的珍贵来源。例如郎格罕氏胰島能在离体用于监视基
于glucidic或去极化刺激的钧运动。
本发明的非人转基因动物是细胞衍生物的珍贵来源，比如成体和
胚胎来源的千细胞，和/或包含脱光蛋白报告基因的初级细胞，例如巨
噬细胞前体。本发明的细胞衍生物是初级细胞或者是干细胞，全能的
或多潜能的或多能的或祖细胞，它们是胚胎或成体来源的。
包含作为报告系统的脱光蛋白的细胞衍生物在栽入腔肠素后，或
向动物静脉注射腔肠素后，再添加测试分子或刺激，能直接用于进行
基于细胞的试验。
包含作为报告系统的脱光蛋白的初级细胞衍生物能直接用于筛选
目的，从而识别特殊靶标的激动剂或拮抗剂，或者作为ES/发光蛋白 细胞分化后获得的"类初级"细胞的阳性对照。
干细胞衍生物可以分化成表达特定靶标的特定细胞谱系。干细胞 衍生物可以在分化状态下在载入腔肠素后能用于进行基于细胞的试 验，从而识别特定靶标的激动剂或拮抗剂，或者可以在未分化的状态 下识别促成或抗分化剂。
优选特定细胞谱系是心肌细胞(muscle heart cell)镨系或神经 元镨系或来源于造血或间充质细胞镨系的那些细胞镨系。
本发明有利地提供用于体内化合物识别和/或测试的方法，所述化 合物有多种应用，例如治疗的，诊断的应用。
本发明的上下文中，化合物文库是用于测试或识别的合成或重组 化合物的集合。
本发明的另 一个主题是识别配体的方法，所述配体能刺激特异靶 标以便获得胞内Ca"的变化，包括步骤
a)提供本发明的细胞衍生物，初级或干细胞；b)最终将所述细胞 分化成特定细胞镨系，以使所述靶标表达；c)用适当的发色团作为底 物，加载细胞；d)用包括所述靶标的推定配体的化合物文库接触细胞； e)探测发光蛋白的生物发光。
初级或干细胞可以内源表达乾标。
优选特定细胞镨系是心肌细胞镨系或神经元镨系或来源于造血或 间充质细胞镨系的那些细胞镨系。 更优选的方法是进行高通量筛选。
本发明的另一个主题是识别靶标的拮抗剂，以便获得胞内Ca—的 变化的方法，包括步骤
a)提供本发明的非人转基因动物的细胞衍生物，其为初级或干细 胞；b)最终将所述细胞分化成特定细胞i普系，以使所述靶标表达；c) 用适当的发色团作为底物，加载细胞；d)用包括所述乾标的推定拮抗
剂的化合物文库接触细胞；e)用能刺激所述靶标的配体接触细胞；f) 探测发光蛋白的生物发光变化。
初级或干细胞可以内源表达靶标。
优选特定细胞i普系是心肌细胞镨系或神经元谱系或来源于造血或 间充质细胞谱系的那些细胞谱系。 更优选的方法是进行高通量筛选。
本发明的另一个主题是识别刺激本发明细胞衍生物分化为特定细 胞谱系的试剂的方法，包括步骤
a)提供根据权利要求1-12所述的处于未分化阶段的非人转基因 动物的干细胞衍生物；b)将所述干细胞衍生物暴露于包括推定诱导分 化剂的化合物文库；c)使至少一个特定细胞镨系把标表达；d)用适当 的发色团作为底物，加栽细胞；d)用配体刺激所述特定细胞镨系靶标 以获得胞内Ca—的变化；e)探测发光蛋白的生物发光。
在一优选的实施方案中采用高通量筛选的方法。
本发明的另一个主题是识别抑制本发明干细胞衍生物分化为特定 千细胞谱系的试剂的方法，包括步骤
a)提供根据权利要求1-12所述的处于未分化阶段的非人转基因 动物的干细胞衍生物；b)将所述干细胞衍生物暴露于包括推定抑制分 化剂的化合物文库；c)将该干细胞衍生物暴露于已知诱导分化剂，以 使至少一个特定细胞镨系靶标表达；d)用适当的发色团作为底物，加 载细胞；e)用配体刺激所述特定细胞镨系靶标以获得胞内Ca"的变化； f)探测发光蛋白的生物发光。
在一优选的实施方案中采用高通量筛选的方法。
本发明的另一方面是利用根据本发明的非人转基因动物的细胞衍 生物作为ES/发光蛋白细胞分化后得到的"类初级"细胞的阳性对照。
本发明的另 一方面是根据本发明的非人转基因动物的细胞衍生物 的用途，其中包含发光蛋白作为报告系统的所述细胞衍生物用于化合 物的筛选，所述化合物典型地为激动剂、拮抗剂、促成或抗分化剂。
本发明的另一方面是根据本发明的非人转基因动物的组织或器官
衍生物的用途，所迷组织或器官衍生物包含作为报告系统的发光蛋白， 用于药理学离体研究和动物模型的移植实验。
本发明的另一方面是利用根据本发明的非人转基因动物及其后代 进行生物成像研究。
本发明的另一方面是利用根据本发明的非人转基因动物及其后代 进行与药理学相关动物模型的杂交。优选动物模型是携带报告基因的
转基因动物，或者是K0或KI突变体动物模型。这样的杂交允许产生 携带本发明发光蛋白报告基因并结合其它转基因(例如报告基因)和/ 或突变基因(例如通过同源重组获得的那些基因)的新的动物模型后 代。
本发明的另 一方面是利用根据本发明的非人转基因动物进行某物 质的毒性和/或畸形学体内实验。
参考下列附图，在以下的实验部分更详细地描述本发明。
图1 114个新霉素抗性克隆的克隆库分析。A.使用基于CCD照 像机的光度计测量组胺反应动力学(IOO mM)，用RLU值(相对发光 单位)记录。细胞接种24小时后在96MTP中进行实验。基于CCD照像 机的光度计条件高灵敏度，60秒。B.用Triton X-100裂解细胞后 测量总发光蛋白的残余活性。基于CCD照像机的光度计条件低灵敏 度，读数时间5秒。
图2 12个ES/mito c-Phot〖11&@的最佳克隆的分析。A.细胞以 20000细胞/孔接种24小时后在96 MTP中测量12个最佳mito c-Photina⑧ES克隆的组胺反应(100 nM)。基于CCD照像机的光度计 条件高灵敏度，读数时间60秒。B. Triton X-100裂解细胞后测量 12个最佳mito c-Photina ES克隆的总发光蛋白残余活性。基于CCD 照像机的光度计条件低灵敏度，读数时间5秒。
图3 2个ES/mito c-Photina⑧的最终克隆的分析。A. 10000细胞/ 孔的细胞接种24小时后在96 MTP中测定组胺反应(100pM)。基于CCD 照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。B. 20000细胞/孔的 细胞接种24小时后在96 MTP中测定组胺反应(lOOjuM)。基于CCD照
像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。
图4未分化的ES/mito c-Photina /29克隆的免疫荧光分析。利
用下列抗体进行免疫荧光试验
A. 小鼠抗-SSEA-1 —抗+抗小鼠FITC 二抗。
B. 小鼠抗oct3/4 —抗+抗小鼠FITC 二抗。
图5用EIJ^磷酸酶染色试剂盒测定的碱性砩酸酶活性。 图6 ES/mito c-Photina /29克隆的体夕卜心肌(cardiomyocytic) 分化试验。
A. 分化第二天悬浮液中的胚状体。
B. 分化第5天在涂布至明胶包被的培养皿上之前的悬浮液中的胚 状体。
C. 包含由形态分析评估的脉动区域的胚状体百分比。
图7对来自ES/mito c-Photina /29克隆的体外分化的心肌细胞 的免疫荧光分析。利用下列抗体进行免疫荧光试验
A. 小鼠抗肌节ot -辅肌动蛋白 一抗+抗小鼠FITC 二抗。
B. 兔抗肌球蛋白重链(MHC) —抗+抗兔FITC 二抗。
C. 兔抗GATA4 —抗+抗兔FITC 二抗。
图8对来自ES/mito c-Photina /29克隆的体外分化的心肌细胞 的基于CCD照像机的发光功能试验。
A. 20000细胞/孔的细胞接种4小时后，在96 MTP中检测Tyrode 緩沖液，去甲肾上腺素(100jiM)，和内皮缩血管肽-1 (50nM)的反应。 基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。
B. 在5 juM硝苯地平存在或不存在的条件下检测的去极化刺激 (40 mM KC1)。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60 秒。
C. 用Triton X-10Q裂解细胞后测量总发光蛋白的残余活性。基于 CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间30秒。
图9 88/111"0 0- 110"11&@/29克隆的体外神经元分化试验的可视 成像。A. 分化第7天涂布在明胶包被的培养皿上的胚状体。
B. 分化第9天涂布在明胶包被的培养皿上的胚状体。
C. 分化第11天涂布在明胶包被的培养皿上的胚状体。
D. 分化第13天涂布在明胶包被的培养皿上的胚状体。
图10 96 MTP上来自ES/mito c-Photina /29克隆的体外分化的 神经元的免疫荧光分析。利用下列抗体进行免疫试验
A. 兔抗神经丝H (NF H) —抗+抗兔FITC 二抗(与B同视野)。
B. 小鼠抗神经元核(NeuN) —抗+抗小鼠罗丹明化的 (rhodaminated ) 二抗(与A同视野)。
C. 兔抗神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP) —抗+抗兔FITC 二抗。
D. 小鼠抗巢蛋白(Nestin) —抗+抗小鼠FITC 二抗。
图ll对来自83/11^0(;- 1101:111&@/29克隆的体外分化的神经元的 基于CCD照像机的发光功能试验。
A. 第14天在96MTP中测定标准tyrode和谷氨酸盐(100 juM)的 反应。基于CCD照像机的光度计条件低灵敏度，读数时间60秒。
B. 第H天，38賴TP中，在6 juM co-食鱼螺毒素GVIA存在或不 存在的情况下测定标准tyrode和40mMKCl的反应。基于CCD照像机 的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。
图12对来自ES/mito c-Photina /29克隆的体外未分化和分化 (第16天)神经元的FLIPW"功能试验。将细胞与膜电位试验试剂盒 一起在37X:温育30分钟，然后注射KC1，终浓度为40mM，用于FLIPR384 分析。记录荧光信号250秒，表示为RFU (FLIPFT设定为膝光时间 0.3秒；注射速度20 pl/秒；注射高度50 n 1;读数时间360秒)。
图13转基因mito c-Photina⑧小鼠中发光蛋白的组织定位。A. 从表达mito c-Photina⑤的阴性和阳性小鼠中移出14个不同的组织/ 器官，室温下用20 jiiM腔肠素中温育3小时。注射250 mM CaCl2和 Triton X-100的溶液，测量各组织的发光蛋白含量。基于CCD照像机 的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。B.比较从表达mito c-Phot ina⑧的不同年龄段(3， 6和10月龄)的阴性和阳性小鼠中移出的
8个组织/器官，室温下用20 iiM腔肠素中温育3小时。加入250 mM CaCh和Triton X-100的溶液，测量各组织的发光蛋白含量。基于CCD 照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。
图14不同条件下与腔肠素温育的组织和器官。A.向阳性转基因 mi to c-Photina⑧小鼠和阴性对照系统内注射2. 8 mg/kg腔肠素后,用 基于CCD照像机的光度计分析不同的组织/器官。3小时后，从两种小 鼠中移出16个不同的组织/器官。该材料的一半直接接种于白色96MTP 中。B.余下的材料进一步在室温下与20 nM腔肠素温育3小时，用基 于CCD照像机的光度计分析。所有样品的发光蛋白含量由基于CCD照 像机的光度计通过记录注射250 mM CaCh和Triton X-100溶液后的 发射光而分析。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间 60秒。
图15在从转基因mitoc-Photina⑧小鼠上分离的胰岛上进行的基 于CCD照像机的光度计功能试验。胰岛分离自一个阳性转基因mito (;-？110"11&@小鼠和一个阴性小鼠。过夜培养后，10个胰鸟/孔放入白 色96MTP中。
A. 两个不同的各包含10个胰岛的孔与10 jiM腔肠素一起温育3 小时，分别用11 mM葡萄糖或ll mM甘露醇作为阴性对照进行刺激。 ^吏用Luminoskan光度计。积分时间0. 5秒。读数时间150秒。
B. 然后用40 mM KC1刺激胰岛。用基于CCD照像机的光度计测量 发射光，设置如下高灵敏度，读数时间60秒。
C. 用含有Triton X-100的溶液裂解细胞后，记录发射光，评价胰 岛总发光蛋白的残余活性。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度， 读数时间60秒。
图16 c-Photina③转基因小鼠衍生的巨噬细胞的细胞裂解后，测 量的总光释放。在96MTP平板中接种细胞，20000细胞/孔。基于CCD 照像机的光度计条件高灵敏度，积分时间O. 6秒，读数时间60秒。
图17 2个ES/mito i-Photina⑧的最终克隆的分析。A.接种10000 细胞/孔24小时后，在96孔板上测定克隆N. 70的组胺剂量反应。基
于CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。B.Triton X-100裂解细胞后测量2个最佳的ES/mito i-Photina⑧克隆的总发光 蛋白残余活性。基于CCD照像机的光度计条件低灵敏度，读数时间5 秒。
图18 2个ES/i-Photina⑧的最终克隆的分析。A.接种10000细胞 /孔24小时后，在96MTP中测定克隆N. 113的组胺剂量反应。基于 CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。B. Triton X-100 裂解细胞后测量2个最佳的83/1- 110"11&@克隆的总发光蛋白残余活 性。基于CCD照像机的光度计条件低灵敏度，读数时间5秒。
图19 2个P19/mito c-Photina⑧的最终克隆的分析。A. 20000细 胞/孔的细胞接种24小时后在96MTP中测定P19/mito c-Photina 1A1 克隆的组胺反应(100 jLiM)。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度， 读数时间60秒。B. 20000细胞/孔的细胞接种后24小时在96MTP中测 定P19/mito c-Photina lA2克隆的组胺反应。基于CCD照像机的光度 计条件高灵敏度，读数时间60秒。C.用Triton X-100裂解细胞后测 量总发光蛋白的残余活性。基于CCD照像机的光度计条件低灵敏度， 读数时间30秒。
图20在96MTP上来自P19/mito c-Photina /lAl克隆的体外分 化的神经元的免疫荧光分析。利用下列一抗进行免疫荧光试验
A. 兔抗神经丝H (NF H) —抗+抗兔FITC 二抗。
B. 小鼠抗神经元核一抗+抗小鼠罗丹明化的二抗，在荧光和可见光 显微镜下可见。
C. 小鼠抗巢蛋白 一抗+抗小鼠FITC 二抗，在荧光和可见光显微镜 下可见。
图21对来自P19/mito c-Photina /lAl克隆的体外分化神经元 的基于CCD照像机的功能试验。.
A.分化神经元的第8天在384MTP中测定Tyrode和40 mM KC1的 反应。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。B. 分化神经元的第11天在384MTP中测定Tyrode和40 mM KC1的反应。
基于CCD照像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。
图22在第8天对来自P19/mito c-Photina /lAl克隆的体外分 化神经元的FLIPR^功能试验。
对于FLIPR3"分析，将培养基替换为Fluo-4 N萨钩敏感荧光染料。 然后将培养板在37"C温育30分钟以及在室温下温育30分钟，再注射 KC1溶液(终浓度40 mM)。记录荧光信号360秒，表示为RFU (FLIPR384 设定为曝光时间0.3秒；注射速度20 jul/秒；注射高度50 jli l;读数时间:360秒)。
图23在笫8天对来自P19/mito c-Photina /lAl克隆的未分化 和体外分化神经元的FLIPIT功能试验。对于FLIPFT分析，将培养基 替换为25 pl/孔的Fluo-4 Nf钾敏感荧光染料。然后温育培养板1 小时，再注射组胺或谷氨酸盐(终浓度100 pM)。记录荧光信号360 秒，表示为RFU (FLIPR^设定为曝光时间0. 3秒；注射速度20 ju 1/秒；注射高度50 pl;读数时间330秒)。A.接种24小时后检测 的3000细胞/孔的未分化P19/mito c-Photina /lAl克隆细胞的 FLIPR3"反应。B.在第8天来自P19/mitoc-Photina /lAl克隆的分化 神经元的FLIPIT反应。
图24 P19细胞中不同发光蛋白(mito Photina 、mito c-Photina 、 mito i-Photina⑧)的瞬时转染。A.用Luminoskan光度计检测100 jiM 组胺反应。读数时间60秒。B. Triton X-100裂解细胞后，用Berthold 光度计测定总的光发射。读数时间3秒。
图25 mi to i-Photina (A.)和mi to Photina (B.)稳定转染的 P19细胞库的分析。10000细胞/孔的细胞接种后24小时在96MTP中检 测50、 100和150 jiM组胺的剂量-反应。基于CCD照像机的光度计条 件高灵敏度，读数时间60秒。C. 10000和20000细胞/孔的细胞接 种后24小时在96MTP中用Triton X-100裂解细胞后测量总的光发射。 基于CCD照像机的光度计条件低灵敏度，读数时间30秒。
图26 P19 mito c-Photina⑧的2个最终克隆的FLIPR和基于CCD 照像机的光度计的比较。接种20000细胞/孔后24小时在384MTP中测
定P19/mito c-Photina lAl克隆(A.)和P19/mito c-Photina⑧lA2克 隆(B.)的组胺反应。对于基于CCD照像机的光度计分析，在37r下用 10 juM腔肠素溶液在读数前4小时替换培养基(基于CCD照像机的光 度计条件高灵敏度，读数时间60秒)。对于FLIPR⑤分析，用Calcium 3 Assay试剂盒0. 5X在读数之前30分钟替换培养基(FLIPlT设定为 曝光时间0.2秒；注射速度20 pl/秒；注射高度50 ial;读数时 间60秒)。对于两种测定法，组胺的终浓度都为100 pM。计算和记 录光度计(表示为RLU :相对发光单位)和荧光计(表示为RFU :相对荧 光单位)的信噪比。
材料和方法
发光蛋白描述
Photina
嵌合发光蛋白Photina⑧在专利EP 1413584中描述，本文中表示 为SEQ ID No. 1 :
MetSerSerLysTyrAlaValLysIjeii]jysThrAspPheAsp
AsnProArgTrp工leIjysArgHis]jysHisMetPheAspPhe
LeuAsp工leAsnGlyAsnGlyLyslieThi:LeuAspGlulie
vaiSerLiysAlaSearAspAsplieCysAlaLys!LeuGlyAla
ThrProGluGinThrLysA巧HikGinAspAlaValGluAla
PhePheLiys!Lys工leGlyMetAspTyrGly!LysGluValGlu
PheProAlaPheValAspGlyTrpLysGluLeuAlaThxSe:r
GluLieuLiysLysTrpAlaArgAsnGluProThrUeu工leArg
GiuTrpGlyAspAlaValPheAsp工lePheAsp!LysAspGly
SerGlyThrlieThrLieuAspGluTrpLysAlaTyrGlyLiys
lieSerGly工leSerProSerGinGluAspCysGluAlaThar
PheArgHisCysAspLeuAspAsnSerGlyAspLeuAspVal
AspGluMetThrArgGinHisLeuGlyPheTrpTyrThrLeu
AspProGluAlaAspGlyLieuTyrGlyAsnGlyValPro
i-Photina
i-Photina (专利申请EP05005390. 9)通过Clytin发光蛋白 (GenBank登录号Q08121) Glyl42->Cys的诱变获得。
c-Photina
c-Photina⑧(专利申请EP06000171)通过Clytin序列(GenBank 登录号Q08121)在以下12个位置的突变获得:Gly58->Glu，Asp69->Val, Ala70—>Cys , Lys76—>Arg ， Lys7「>Gly ， Ile78—>Cys , Asp8i—>Glu ， Val86—>Ile， Glu87—>Ala， Ala90—>Gln， Val92—>Leu,和Glu97—>Gln。
用于在哺乳动物细胞中表达的发光蛋白优化
c-Phot 111&@和i-Photina⑧基因的密码子使用适合于高度表达 哺乳动物基因的密码子偏好。另外已经尽可能避免GC含量非常高 (>80%)或非常低(<30%)的区域。
为了有效的翻译起始，在起始密码子上游引入Kozak共有序列。 加入二个终止密码子以保证有效终止。
克隆方法
将基因克隆到具有或不具有线粒体标记(mito)的pcDNA3. 1+载体
(Invitrogen)，从而获得pcDNA3 mito c-Photina 、 pcDNA3 mito
i-Photina 、和pcDNA3 i-Photina ,为了线粒体定位(52-54),使用
人细胞色素 c 氧化酶亚基 VIII 信号序列 5,-ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTT
CAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC-3， (SEQ ID No. 2). 由全长双脱氧法测序验证获得的构建体。
ES细胞培养
利用标准方法(55， 56)培养ES细胞。 ES培养基，接种和温育
TBV2(129S2/SvPas)胚胎干细胞(63)培养于15。/。胎牛血清，FBS (ES 级另ij， Invitrogen，目录号16141079) DMEM Dulbecco's改良的Eagles 培养基，高葡萄糖，不含丙酮酸钠(Invitrogen，目录号10313021)， 100 mM P-琉基乙醇(Invitrogen，目录号31350010)， 2mM谷氨酰胺 (Invitrogen，目录号25030024)， 1000 U/ml白血病抑制因子，LIF (Prodotti Gianni，目录号ESG1107) ， 37t:， 5% C02。
初级小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养于1(^胎牛血清，FBS (Celbio 目录号CHA11152) DMEM Dulbecco' s改良的Eagles培养基，高葡萄糖 (Invitrogen,目录号10313021) ， 1 mM丙酮酸钠(Invitrogen目录号 11360039)非必需氨基酸(Invitrogen，目录号11140-035)， 2 mM谷氨 酰胺(Invitrogen,目录号25030024) ， 371C， 5% C02。
稳定转染
利用电穿孔法转染对应于发光蛋白的DNA构建体。30-40 ng用 BglII (New England Biolabs)线性化的mito c-Photina 、 mito i-Photina⑧和i-Photina DNA用于转染7x106 ES细胞(电穿孔条件: 500 |a F， 0. 24kV， BioRad基因脉沖器)，冰上温育10-20分钟。细 胞悬液在包含LIF的ES细胞培养基中稀释，转移至直径100 mm的明 胶化的培养板上。大约"小时后，利用含200 jig/ml G148 (遗传霉 素Geneticin， SIGMA,目录号G5013)的ES培养基开始选择。
通常在电穿孔后8-9天可以挑选菌落。
克隆选择过程
1. 挑选114个ES pcDNA3/mito c-Photina⑧克隆，130个ES pcDNA3/mito i-Photina⑧克隆和99个ES pcDM3/i-Photina⑧克隆。
2. 接种24小时和48小时后，转染细胞涂布于2x96 MTP白板上 的含有LIF的ES培养基中。
3. 培养基被替换为50 n 1/孔的tyrode (130mMNaCl， 5mMKCl， 2 mM CaCl2， 1 mM MgCl2， 5 mM Na跳和20 mM HEPES， pH 7. 4， 2 mM Ca2+)和10 juM腔肠素(Pharma Tech International)。
4. 选择阳性克隆，评价
-对100 jaM组胺(Sigma目录号H7125-5G)的反应。基于CCD照 像机的光度计条件高灵敏度，读数时间60秒。
-用Triton X-100裂解细胞后测量总发光蛋白的残余活性。基于 CCD照像机的光度计条件低灵敏度，读数时间5秒。
针对每一种载体，选择12个克隆，扩增，并在96 MTP为 10000-20000细胞/孔的细胞数，384 MTP为2500细胞/孔的细胞数时 重新测试。
-对100 pM组胺的反应。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏 度，60秒。
-用Triton X-100裂解后测量总发光蛋白的残余活性。基于CCD 照像机的光度计条件低灵敏度，5秒。 DNA提取
从明胶涂层培养亚里的ES细胞中提取DM，使用标准蛋白酶K消 化和苯酚-三氯甲烷-异丙醇提取法(59)。 通过定量PCR测定插入片段的数目
在ES/mito c-Photina⑧细胞中进行QPCR (定量聚合酶链式反应)， 每一反应利用大约3 ng DNA和"Platinum SYBR Green QPCR SuperMix UDG "方法(60，Invitrogen)。利用Primer Express⑧软件v2. 0 (Applied Biosys tems)设计使用的引物，c-Phot ina (CPH)和新霉素(neo)基因上 的引物用于检测被用于转染的质粒，gusB基因的特异引物用于检测基 因组DNA :
CPH-正向引物CACCAAGTGTGCGTGGAGG (SEQ ID No. 3); CPH-反向引物GCGATCTCCTTGCCGTACTC (SEQ ID No. 4); neo-正向引物CACGTACTCGGATGGAAGCC (SEQ ID No. 5); neo-反向引物CCCTGATGCTCTTCGTCCAG (SEQ ID No. 6); gusB-正向引物GGAGGTGATTCAGCCACAGC (SEQ ID No. 7); gusB-反向引物TCGGCTTCTGATGCGTCTTA (SEQ ID No. 8). 所有的QPCR实验都在ABI Prism 7700序列检测器(Applied Biosys t ems)上运行。
PCR实验方法如下保持2分钟，95C保持2分钟，40个 循环95X:， 15秒，60n, 1分钟；95"C， 15秒。20分钟温度梯度从 60'C到95^ (熔解曲线步骤)。
运行结束时，PCR期间获得的荧光数据按照ABI Prism 7700用户 手册所述进行处理。
PCR产物的熔解温度图形分析由"解离曲线1.0 "软件(Applied Biosystems)处理。在任一 QPCR实验中没有产生引物二聚物。
为了计算每个二倍体基因组(即每个细胞)的新霉素和/或 c-Photina⑧基因的拷贝数，我们在下列公式中输入Cts (循环阈值)和 PCR效率
(PCR效率目标)-("目标) #每一个细胞的拷贝数- 2 x -
(PCR效率gJ-(Ct 一)
其中
PCR效率，标=新霉素或c-Photina⑧基因的PCR效率； PCR效率一 -gusB基因的PCR效率； Ct目标=新霉素或c-Photina⑧基因的Ct; Ct gusB = gusB基因的Ct.
公式右边的分数给出了每个gusB拷贝的插入DNA拷贝数目。因为 一个二倍体基因组中存在两个gusB拷贝，所以分数乘以二。 DNA印迹
ES/mito c-Photina⑤细胞的10 jli g ES基因组DNA用不同的限制 酶消化，HindIII、 Xbal、 BamHI HindlII/Xbal (Biolabs)，载入至 0. 8%琼脂糖凝胶上，转移至带正电的尼龙膜上(Roche，目录号 1417240)。使用["P]dCTP标记的c-Photina⑤编码序列(59 )作为探 针。
ES/mito i-Photina⑤细胞和ES/i-Photina⑧细胞的10 p g ES基 因组DNA用EcoRI限制酶消化(Biolabs)，栽入至0. 8%琼脂糖凝胶， 转移至带正电的尼龙膜上(Roche,目录号1417240)。使用["P]dCTP标
记的i-Photina⑧编码序列(59)作为探针。 免疫荧光分析
1. 除去培养基，用IX PBS冲洗三次。
2. 室温下，ES细胞固定在4%多聚甲醛(PFA， MERCK， Whitehouse Station, NJ， USA，目录号1. 04005. 1000)溶液中20分钟。
3. 除去固定液，室温下用IX PBS冲洗三次。
4 .通过将细胞与含有10%正常山羊血清(Chemicon,目录号 S26-100m1)/0. 2% Triton X-100的IX PBS在室温下温育30分钟进行 封闭和透化过程。
5. 除去封闭液，室温下用IX PBS冲洗2次。
6. 不同的抗体在含10%正常山羊血清0. 1% Triton X-100的IX PBS 中在室温下温育2小时。
-小鼠单克隆抗体抗oct 3/4 (C-IO) (Santa Cruz Biotechnology, 目录号SC-5279)按1: 100稀释使用。
-小鼠单克隆抗体抗SSEA-l (Santa Cruz Biotechnology,目录号 SC21702)在不含Triton X-100透化剂的緩冲液中按1: 100稀释使用。
-兔多克隆抗体抗肌球蛋白重链(MHC) (H-300) (Santa Cruz Biotechnology,目录号SC-20641)按1: 50稀释使用。
-兔多克隆抗体抗GATA-4 (H-112) (Santa Cruz Biotechnology, 目录号SC-9053)按1: 50稀释使用。
-小鼠单克隆抗体抗肌节ot-辅肌动蛋白(EA-53) (SIGMA,目录号 A7811)按l:50稀释使用。
-兔多克隆抗体抗神经丝H (NF-H) (Chemicon,目录号AB 1989) 按l : 100稀释使用。
-小鼠单克隆抗体抗神经元核(NeuN) ( Chemicon,目录号MAB377 ) 按l : IOO稀释使用。
-兔多克隆抗体抗神经胶质纤丝酸性蛋白(Dako，目录号Z0334)按 1: 100稀释使用。
-小鼠单克隆抗体抗巢蛋白(Rat-401) (Chemicon,目录号MAB353)
按1: IOO稀释使用。
7. 在室温下用IX PBS冲洗三次。
8. 将单独的荧光素化的抗小鼠，或者是抗兔FITC 二抗或其与罗丹 明化的抗小鼠抗体(山羊和小鼠IgG/IgM罗丹明，Chemicon，目录号 AP130R)结合，在10%正常山羊血清/0.1% Triton X-100的IX PBS中 室温下温育l小时，以进行二抗的温育。使用的抗体以1:200稀释。
9. 在室温下用IX PBS冲洗三次
10. 在4",细胞留置在1X PBS中。 含有胚状体(EB)形成步骤的心肌分化方法 参见参考文献(57)中描述的方法。 关于心肌细胞的基于CCD照像机的光度计测定方法 -在分化第9天用Accutase TM (Chemicon，目录号SCR005)分离EB，
计数，371C温育3小时(96MTP中，20000细胞/孔)于10 pM腔肠素 中，所述腔肠素在标准tyrode緩冲液中(用于GqPCRs测试)和没有KC1 的tyrode中(用于L型钩离子通道的测试)。 -细胞接种3小时后进行测试。
-基于CCD照像机的光度计测量针对50 nM内皮缩血管肽-1， 100 pM去甲肾上腺素(Noraepinephrine)的反应(条件高灵敏度，读数 时间60秒)。
电压门控钙离子通道由40mMKCl刺激。将细胞与5 nM硝笨地平
(一种特异的L型电压门控钙离子通道抑制剂)(SIGMA3目录号N7634)
在测定前温育15分钟，检验通道的特异性。
-剩余总发光蛋白活性用基于CCD照像机的光度计在用Triton
X-100裂解细胞后测定(条件高灵敏度，30秒)。 含有胚状体(EB)形成步骤的神经元分化方法 参见参考文献(64， 65)中描述的方法。 关于神经元的基于CCD照像机的光度计测定方法 -解离视黄酸诱导(RA. Sigma,目录号R-2625)的EB，以6500细
胞/孔接种于多聚D-赖氨酸(Sigma，目录号G7121)包被的384 MTP中，
94 MTP为24000细胞/孔，用于进一步的分化期。
在分化第14天，在37C在10 MM腔肠素中温育3小时，所述腔 肠素在标准tyrode緩沖液中(用于谷氨酸盐反应测定)，和没有KC1 的tyrode中(用于电压门控钙离子通道测定)，有或者没有用6 jiM co-食鱼螺毒素GVIA (—种特异的N型电压门控钙离子通道抑制剂) (BACHEM,目录号H6615. 1000)预温育15分钟。
-由基于CCD照像机的光度计测量反应(96MTP中用于谷氨酸盐反 应的条件低灵敏度，读数时间60秒；384MTP中用于电压门控钙离子 通道反应的条件高灵敏度，读数时间60秒)。
对分化神经元和未分化ES/mito c-Photina ES/29克隆的荧光成 像阅读仪(FLIPR )测定方法
在第16天测定分化的细胞(在解离视黄酸诱导EBs和以6500细 胞/孔接种于多聚D -赖氨酸包被的384黑壁透明底平板后获得)。
未分化的ES/mito c Photina ES"9克隆在测定24小时前以 10000细胞/孔接种于明胶包被的384黑壁透明底平板上。
进行实验之前，除去培养基，在371C，细胞在25 jul/孔的溶解 在tyrode中的膜电位染料(Molecular Devices,目录号R8034)中温 育，30分钟。
注射12. 5 |i 1/孔的含有120mMKCl ( 3X)的tyrode(15 mM NaCl， 120 mM KC1， 2mM CaCl2， 5 mM NaHC0" 20 mM Hepes),记录荧光信 号250秒，表示为RFU (相对荧光单位)。
FLIPR3"设置
曝光时间0. 3秒
注射速度20 )ii/秒 注射高度50 pi
发光蛋白转基因小鼠的发光蛋白组织分析
第一次实验
使用两只小鼠，分别为c-Photina⑧转基因阳性和阴性的。
200 jil的血样取自两只小鼠的尾部静脉。用生理溶液灌注以除
去血液污染物。从两只小鼠中移出一些组织(大脑、小脑、肝、脂肪、 脾、骨骼肌、坐骨神经、整个胰腺、肺、肾、血、胃、睾丸、心脏)，
室温下在溶液中温育3小时，所述溶液含有20 mM Tris-HC1 pH7. 5， 150 mM NaCl， 5 mM DTT， lmM EDTA， 0.1% BSA， 20 juM腔肠素，和 蛋白酶抑制剂混合液cocktails (Roche,目录号1836145)。 样品全部用手术刀剪切，以便将组织切割成更小的部分。 样品然后等量均分在白色96白孔/培养板的3个孔中。 注射Triton X-100和250mM CaCl2溶液后由基于CCD照像机的光 度计读取它们，条件是高灵敏度，60秒，积分时间0.6秒。
为了检查期间发光蛋白报告蛋白质在不同组织/器官中的存在和 稳定性，另外处死不同年龄的6只动物(3只为c-Photina⑧转基因阳 性，3只为阴性)两只小鼠3个月大，两只小鼠6个月大，两只小 鼠10个月大。它们全部用生理溶液灌注以除去血液污染物。大脑、小 脑、脾、肺、肾、胃、生殖腺和心脏从小鼠中移出，室温下在溶液中 温育3小时，所述溶液含有20 mM Tris-HCl pH7. 5, 150 mM NaCl， 5 mM DTT， lmM EDTA， 0. 1% BSA， 20 pM腔肠素，和蛋白酶抑制剂混合 液。
样品全部用手术刀剪切，以便将组织切成更小部分，再等分于白 色96白孔/平板。
注射Triton X-100和250 mM CaCh的溶液后由基于CCD照像机
的光度计读取它们，条件是高灵敏度，60秒，积分时间O. 6秒。 第二次实验
使用两只小鼠，分别为c-Photina⑧转基因的阳性和阴性。经由尾 部静脉注射300 jil每kg小鼠含2.8mg腔肠素的腔肠素溶液(373 ja M腔肠素，3.3% DMS0， 990 nM谷胱甘肽，溶于生理溶液)。
3小时后，200 Ml的血样取自两种小鼠的尾部静脉。用阿佛丁麻 醉小鼠(12. 5 pl/g体重)。将胶原酶(类型V, 1 mg/ml) (Sigma Chemical, St. Louis, MO)注射入肝管，进行小鼠胰島分离。然后切 断腹腔静脉/主动脉，通过放血处死小鼠。接着消化分离的胰腺，通过 密度梯度(Histopaque-1077; Sigma)纯化P-胰岛。胰岛在37*C，潮 湿空气，5% C02,添加10°/。胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 |i g/ml 链霉素M199培养基(Invitrogen，目录号22350-029)中过夜培养。
每孔10个Mito c-PhoUna⑧转基因小鼠的胰岛置于白色96MTP中， 在37t:在含10 nM腔肠素的标准tyrode溶液中温育4小时。胰島钙 动力学反应由Luminoskan Ascent (Labsystems)光度计领'J量；持续 150秒，积分时间0.5。测量之前用葡萄糖刺激物(llmM)，或作为阴性 对照的甘露醇(ll mM)进行刺激。葡萄糖浓度标准化为3 mM，然后在 基于CCD照像机的光度计中(高灵敏度，60秒)用去极化刺激物(40mM KC1)刺激胰鸟。在用基于Triton X-100的緩冲液裂解细胞后，测定胰 岛的总发光蛋白含量(高灵敏度，60秒)。
-从两只小鼠中移出一些组织(大脑、小脑、肝、脂肪、脾、心脏、 坐骨神经、胃、肺、睾丸、骨、骨骼肌、肾、血、胸腺)，用手术刀 剪切，以便将组织切成更小的部分。
全部的样品被分为两批。 一部分置于溶液中，所述溶液含20 mM Tris-HCl pH7, 5， 150 mM NaCl, 5 mM DTT， lmM EDTA, 0.1% BSA， 和蛋白酶抑制剂混合液，不含腔肠素，随后立即在基于CCD照像机的 光度计中测定；另一部分改为用包含20 mM Tris-HCl pH7.5， 150 mM NaCl， 5 mM DTT， lmM EDTA， 0. 1% BSA， 20 pM腔肠素，和蛋白酶抑 制剂混合液的溶液在室温下温育3小时，然后在基于CCD照像机的光 度计中测定。
全部样品然后等量均分在白色96白孔/平板的2个孔中。 它们全部由基于CCD照像机的光度计读数，条件是高灵敏度，持
续60秒，积分时间0. 6秒，测量之前注射TritonX-100和250 mMCaCl2
的溶液。
第三次实验
另一只c-Photina③转基因小鼠和一只阴性小鼠被处死，从骨髓中 分离单核细胞(体外分化为巨噬细胞)(68)。
每一只小鼠的细胞以20000细胞/孔接种在96MTP中，用Triton
X-100裂解细胞，以检验总的细胞裂解活性(高灵敏度，持续60秒， 积分时间0. 6秒)。
P19细胞培养 P19培养基，接种和温育
在37X:，含5% C02的潮湿空气的条件下(61), P19胚胎癌多能 干细胞(ATCC，目录号CRL-1825)培养于10%胎牛血清、FBS (ES级别， Invitrogen,目录号16141079) cxMEM、具有GLUTAMAX的最低基础培养 基Eagle (Invitrogen,目录号32571028)中、该培养基具有1%青霉素 /链霉素(Invitrogen,目录号15140122)。
Mi to c-Photina⑧稳定转染
DNA构建体的转染利用电穿孔方法，也可用另 一优选方法代替。
大约10 jng在pcDNA3中的mito c-Photina DNA用BglII线性 化(New England Biolabs),由电穿孔转染2. 5 x 106细胞(电穿孔条 件500 n F， 0.24 kV， BioRad基因脉沖器)。
用700 ng/ml G418在转染48小时后开始选择。通常在电穿孔后 8-9天可以杏lL选菌落。
克隆选择方法
1. P19 pcDNA3/mito c-Photina⑤克隆。
2. 接种24小时和48小时后，已转染的细胞以10000和15000细 胞/孔涂布于2 x 96MTP白色平板上。
3. 将培养基替换成50 nl/孔的tyrode (2 mM Ca"和10 uM腔 肠素)。
4. 选择阳性克隆，评价
-对100 jiM组胺的反应。基于CCD照像机的光度计条件高灵敏 度，读数时间60秒。
-用Triton X-100裂解细胞后测量总发光蛋白的残余活性。基于 CCD照像机的光度计条件低灵敏度，30秒。
P19/mito c-Photina /lAl克隆在体外的神经元分化 参见参考文献(67)中描述的方法。
基于CCD照像机的光度计对来源于P19/mito c-Photina /lAl克 隆的神经元的测定方法
在神经元分化过程的第8天和第11天(分别是接种于多聚D -赖 氨酸包被的384MTP后的第4天和第7天)，分化自P19/mito c-Photina /lAl克隆的神经元温育于含有10 jaM腔肠素的标准 tyrode緩冲液，每孔25 pl， 4小时，37匸。
通过注射40 mM KC1诱导的去极性刺激的反应由基于CCD照像机 的光度计记录(条件高灵敏度，读数时间60秒)。
FLIPR⑧对来源于P19/mito c-Photina Ul克隆的神经元的测定
在神经元分化过程的第8天(接种于多聚D -赖氨酸包被的384孔 板后的4天)，分化自P19/mito c-Photina /lAl克隆的神经元在25 p 1/孔的Fluo-4 N^钾敏感的荧光染料(Invitrogen，目录号F36205) 中，在黑暗条件下温育。
培养板在37t:下温育30分钟，然后在室温下在温育30分钟。
注射12.5 m1/孔的120 mM KC1 (3X)溶液，记录荧光信号330 秒，表示为RFU (相对荧光单位)。
FLIPRW设置
瀑光时间Q. 3秒
注射速度20 y 1/秒 注射高度50 n l
FLIPI^对未分化的P19/mito c-Photina /lAl克隆和来源于 P19/mito c-Photina /Ul克隆的神经元的测定
关于未分化的P19/mito c-Photina /lAl克隆，以3000细胞/孔 接种于明胶包被的384孔培养板上。接种24小时后，黑暗条件下将细 胞温育于25 ju 1/孔的Fluo-4 N俨钾敏感荧光染料。
关于分化自P19/mito c-Photina /lAl克隆的神经元，在神经元 分化过程的第8天(接种于多聚D-赖氨酸包被的384孔板后的4天)， 黑暗条件下将细胞温育于25 p 1/孔的Fluo -4 NW^丐敏感的荧光染料 中。
两种培养板在37X:下温育30分钟，然后在室温下在温育30分钟。 12.5 m 1/孔的在tyrode緩沖液中的下列3X化合物被注射，记录 荧光信号360秒，表示为RFU。
3x化合物300 juM组胺，和300 "M谷氨酸。 FLIP『设置 曝光时间0. 3秒
注射速度20 n 1/秒
注射高度50 Ml
瞬时转染分析
1. 转染24小时后，将培养基替换为50 ju 1/孔的tyrode (2mMCa2+ 和IO juM腔肠素)，在371C温育4小时。
2. 利用luminoskan Ascent (Labsystems)注射50 n 1/孑L的200 juM组胺(2X)。光度计条件积分时间l秒，读数时间60秒。
-在Triton X-IOO裂解细胞后，用Microlumat LB 96P (EG & G Berthold)测量剩余总发光蛋白活性。读数时间3秒。 MUo i-Photina⑧和mito Photina⑧的稳定转染 DNA构建体的转染利用电穿孔方法，也可用另 一优选方法代替。 大约10 |ig mito Photina⑧和DNA用BglII线性化(New England Biolabs)，由电穿孔转染2. 5xl(T细胞(电穿孔条件500 jLi F， 0. 24 kV， BioRad基因脉冲器)。
用700 pg/ml G418在转染48小时后开始选择。 电穿孔9天后合并菌落并收集。
-对50、 100和150 pM组胺的反应。基于CCD照像机的光度计条 件高灵敏度，读数时间60秒。
-用Triton X-100裂解细胞后测量总发光蛋白的残余活性。 基于CCD照像机的光度计条件低灵敏度，30秒。 荧光成像阅读仪(FLIPR )测定
20000细胞/孔的细胞涂布于384黑壁透明底平板(MATRIX目录号
4332) (25 nl/孔)，细胞接种后24小时进行检测。进行实验之前， 除去培养基，细胞在37C在50 jjl/孔的钙3试验试剂盒0. 5X (Molecular Devices,目录号R8090)中温育30分钟。
注射25 jil/孔的300 )LiM组胺(3X)，记录荧光信号60秒，表 示为RFU (相对荧光单位)。
FLIPR3"设置
曝光时间0. 2秒
注射速度20 jul/秒
注射高度50 pi
实施例
1.建立转染发光蛋白的ES细胞系世代 1.1.1Mito c-Photina ES TBV2克隆
鼠科ES tbv2 mito 0- 1101^&@细胞系是通过用BglII限制酶线 性化的含有mito c-Photina⑧发光蛋白基因的pcDNA3栽体电穿孔ES TBV2 pl6细胞而获得(材料和方法)。
转染48小时后细胞用200 lig/mlG418进行选择。经过8天选择 后，挑选出152个抗药性菌落。经过形态分析后只有约114个菌落在 MEF层上扩增，直到它们在一式5份的96孔/平板中达到汇合，其中
1- 两个在明胶包被的96白色MTP上，用于接种后24和48小时基 于CCD照像机的光度计测定。
2- 一个在明胶包被的96白色MTP上用于DNA提取。
3- 两个在滋养层上，用于-8ox:冻存。
l丄2Mito c-Photina ES TBV2克隆选择
检测前4小时，将阳性克隆的培养基替换为50 n 1/孔的tyrode 緩沖液，2 mM Ca"和10 mM腔脉素，在黑暗条件下，在371C,含5% C02的潮湿空气中以便重新组成有活性的发光蛋白。
为了光发射检测，首先分析细胞应答组胺的能力(发光信号)，已 知组胺能刺激ES内源性的组胺-l受体(58)，提高胞质Ca"浓度。第一
个60秒期间注射100 ju M组胺后发射的光子数由基于CCD照像机的光 度计测定。得到的反应动力学如图1A所示。
每一项实验的结尾，细胞被裂解(用包含Triton X-100的溶液)。 细胞中表达的所有发光蛋白与游离钙反应和测定发射光(图IB)。信 号是细胞内部包含的发光蛋白的总数的指示物。
选择12个最佳组胺应答克隆，在96MTP中的计数细胞中进行重复 试验(图2A和B)。
根据不同的参数筛选出两个最终克隆。应答组胺的能力(图3)和 细胞裂解后的总发光蛋白含量(数据未显示)是主要的鉴别因素，但也 分析了细胞形态和生长率。此外也进行DNA印迹分析(59)和定量PCR (60)。 DNA印迹分析对于保证仅有一个片段随机插入是很重要的。为 了检查，基因组DNA用限制酶消化，所述酶只酶切转染的栽体一次(为 了寻找多联体concatenates)，或者用两种酶进行双酶切(它们也用在 单酶切中)，所述酶能酶切发光蛋白基因，以保证结果的特异性.用 于试验的探针是发光蛋白基因。也进行定量PCR来分析基因插入的数 目。
最终克隆也通过核型分析来表征(61) 。 N. 29和84克隆被挑选 出。N. 29克隆只有一个发光蛋白基因拷贝整合到基因组中，而N. 84 克隆有两个拷贝作为倒置多联体inverted concatenate—次性整合到 基因组中。
它们也自发地在悬滴胚状体形成标准方法后分化成搏动心肌细 胞，以及在视黄酸存在下在胚状体形成后分化成神经元细胞类型(57, 64， 65)。
1.1.3. ES/mito c Photina /29克隆的千细胞特性证实 对ES/mito 0砰110"肌@/29克隆进行间接免疫荧光试验，以检查 未分化多潜能小鼠胚胎干细胞特异标记的存在，如同特异细胞表面抗 原(SSEA-1)(图4A)和转录因子oct3/4 (图4B)—样。结果很好，报 告在图4A和4B中。
这些细胞显示的另 一个干细胞特性是碱性磷酸酶酶活性的存在，
所述碱性磷酸酶活性用EIJ^磷酸酶染色试剂盒(ATCC,目录号 SCRR-3010)检测(图5)。
1.1.4.用ES/mito c-Photina⑧/29克隆进行的体外分化试验。
29克隆细胞的多潜能性也通过这些细胞体外分化成来源于不同 胚层的细胞类型，如心肌细胞和神经元的能力而被证实。
利用不同的方法进行分化实验，比如包括胚状体(EB)形成步骤的 悬浮方法和粘着方法(数据未显示)。
具体地利用含有EBs步骤的方法获得最理想的结果(见材料和方法)。
心肌细胞
通过上述方法我们观察到从分化第6天开始的自发搏动心肌细胞 的出现。包含脉动区域的EB百分比约为80% (图6)。也利用不同的 支持介质保持这一百分比，比如明胶包被的24MTP, 96MTP, 384MTP 和腔式栽玻片(数据未显示)。
为了验证成熟心肌细胞的存在，进行免疫荧光试验，寻找特异心 肌细胞标记的存在，比如细胞骨架蛋白cx-辅肌动蛋白(图7A)，肌球 蛋白重链(MHC)(图7B)，或转录因子GATA-4 (图7C)。
用人""&86@緩沖液解离胚状体，并将其重悬在10 JLlM腔肠素
tyrode緩冲液中后，在基于CCD照像机的光度计上进行预功能实验。 进行细胞计数，以20, 000细胞/孔的细胞浓度接种到96MTP中。37X: 4小时后，用作为对照的标准tyrode緩冲液，50 nM内皮缩血管肽-1 和100 MM去甲肾上腺素刺激细胞，所述内皮血管肽和去甲肾上腺素 分别是GqPCR内皮缩血管肽受体的激动剂和oc 1-肾上腺素能受体的激 动剂，其在心肌细胞中以高浓度存在(基于CCD照像机的光度计条件 高灵敏度，60秒)。显示的应答反应是强烈(大部分针对内皮缩血管 肽受体)和特异的(图8A)。用40mM去极化刺激物KC1刺激相同的 细胞，以活化在心肌细胞中高浓度存在的L型电压门控钩离子通道。 将细胞(在KC1注射前)与5 pM硝苯地平预温育15分钟或者不进行 该该步骤，以观察应答反应的特异性，硝苯地平是一种特异的L型电
压门控钾离子通道抑制剂(图8B)。
剩余发光蛋白活性在注射细胞裂解緩冲液后测定(基于CCD照像 机的光度计条件高灵敏度，30秒)(图8C)。
神经元
为了神经元的分化，胚状体在l juM的全部反式视黄酸中形成。 涂布到组织培养物处理过的培养皿上2天后，可以看到细胞延长部分， 其长度随时间增加(图9 )。
用视黄酸处理的EB也可以解离，重新涂布于不同涂层基质上，并 在无血清的条件下用神经元特异培养基培养。用免疫荧光(神经丝H、 神经元核抗原，在本文净艮告为用两种不同的荧光染料fluorocromes 进行复染色-图10A和B),或者神经胶质标记(神经胶质纤丝酸性蛋 白，图10C)，或者神经前体细胞标记(巢蛋白，图10D)来研究这些 细胞中特异标记的存在。重要的是注意到有一点，细胞群体不是都是 由完全分化的神经元组成，也包含神经胶质细胞和神经前体。图10 报告了这样一种群体(在分化的第18天)的例子。
这些细胞的功能用基于CCD照像机的光度计进行研究。在分化的 第14天，细胞与包含IO pM腔肠素的tyrode溶液一起温育4小时。 注射IOO jiM谷氨酸盐刺激细胞(图11A),以研究谷氨酸盐受体应答 反应，或者在6 juM co-食鱼螺毒素GVIA存在或不存在的条件下(预 温育15分钟)，用40mMKCl去极化细胞，以便特异性抑制N型电压 门控钙离子通道(图11B)。
这些细胞的功能也用FLIPR^进行研究。在分化第16天，除去培 养基，在371C,细胞与溶于标准tyrode中的膜电位染料一起温育30 分钟。用40 mM KC1刺激后，记录荧光信号180秒，表示为RFU (图 12，实线)。在未分化的ES/mito c-Photina⑧/29克隆上进行同样的 实验，作为对照(图12，虚线).
1.1.5.种系传递分析
含有发光蛋白报告基因的小鼠胚胎干细胞(ESTBV2)由种系传递 测定。克隆N. 29和84均注入怀孕的雌性小鼠宿主的胚泡中(EMBL
Monterotondo)。后代显示高度的的嵌合性(几乎100% )和雄性表型。 挑选出来源于29的2只最佳嵌合雄性小鼠，当它们达到性成熟时，与 BL6雌性小鼠杂交，以研究转基因ES细胞的种系传递能力，种系传递 是证明小鼠胚胎干细胞全能性的唯一的无可辩驳的方式。
正如所料，由此杂交产生的小鼠的一半是发光蛋白基因杂合的转 基因小鼠。
使这些杂合的转基因小鼠自交，以获得纯合的种群。出生小鼠的 四分之一是纯合的并且表型正常，证明转基因没有使任何重要基因分 裂。
这些04110"11&@转基因小鼠是细胞的珍贵来源，如成人干细胞
(例如造血干细胞或间充质干细胞)、定向祖细胞，以及包含发光蛋白 的初级细胞。
来源于发光蛋白转基因动物的细胞能作为"类初级'，细胞(ES细胞 分化后获得)的阳性对照，但是它们也是包含发光蛋白的初级细胞的 良好的来源，用于HTS过程本身。
为此我们决定研究发光蛋白在哪些组织中表达。
我们处死两只小鼠，分别为c-Photina⑧转基因的阳性和阴性。从 两种小鼠中移出一些组织，用含有20mM Tris-HCl pH7. 5, 150mMNaCl， 5 mM DTT， lmM EDTA， 0. 1% BSA， 20 n M腔肠素和蛋白酶抑制剂混合 液的溶液温育。室温下温育3小时后，我们同时注射Triton X-100 溶液和250 mMCaCl2，裂解组织/器官，以便在钙未饱和的环境下释放 样品中存在的全部发光蛋白(图13A)。在不同年龄(3， 6, IO个月大) 的动物中检验不同组织中转基因发光蛋白的存在，同时用上述相同方 法分析更多动物。期间测定信号似乎稳定，说明样品量未标准化的事 实(图13B)。
然后我们进行第二项实验，其中在经由尾部静脉注射2. 8 mg腔肠 素/kg进行系统静脉内注射后，我们检验腔肠素扩散和负荷存在于不 同组织/器官的发光蛋白的能力(66) 。 3小时后处死小鼠，移出一些 组织/器官。 一半的材料经细胞裂解和注入钙溶液后直接用基于CCD
照像机的光度计检测(高灵敏度，60秒，积分时间O. 6)(图14A)。 另一半材料转移至另一个96MTP,用包含20 jiM腔肠素的溶液再温育 3小时。该培养板中的材料也经细胞裂解和注入钙溶液后直接用基于 CCD照像机的光度计检测(高灵敏度，60秒，积分时间0. 6)(图14B)。
处死小鼠前，我们也分离和纯化胰岛(见材料和方法)。胰乌在 37t:过夜培养。次日人工挑选胰乌，放进96MTP(lQ个胰乌/孔)。
在37C，它们在包含10 pM腔肠素的标准tyrode中温育3小时。
然后用11 mM葡萄糖刺激它们，以活化钾介导的胰島素通路。作 为对照，胰岛也用另一种糖(不能诱导钩介导的胰岛素应答)甘露醇 (终浓度llmM)刺激。用Luminoskan lumi謹er测量；持续150秒， 积分时间0. 5 (图15A)。
将葡萄糖浓度标准化为3 mM，此外用去极化剂(40 mM KC1)刺激 胰岛，在基于CCD照像机的光度计中进行测量(高灵敏度，持续60秒) (图15B)。注入细胞裂解緩冲液，检验剩余发光蛋白活性(高灵敏度， 持续60秒)(图15C)。
转基因动物也是包含发光蛋白的初级细胞的重要来源。为此，单 核细胞作为初级细胞的实例，从阳性和作为对照的阴性小鼠的骨髄中 分离。这些细胞然后在体外分化，以便获得巨噬细胞(68)。
细胞培养建立后，用Triton X -IOO溶液裂解细胞，检验转基因 c-Photina⑧的存在(图16 )。
1.2. l.Mito i-Photina ES TBV2克隆
鼠科ES TBV2 mito i-Photina⑧细胞系是通过用BglII限制酶线 性化的含有mito i-Photina③发光蛋白基因的pcDNA3载体电穿孔ES TBV2 pl6细胞而获得(材料和方法)。
转染48小时后，用200 pg/ml G418进行选择细胞。
经过8天的选择后，挑选130个抗药菌落，在MEF层上扩增直到 它们在一式5份的96孔/培养板上达到汇合，其中
-两个在明胶包被的96白色MTP上，用于基于CCD照像机的光度
计在接种后24和48h后检测。
-一个在明胶包被的96白色MTP上，用于DNA提取。
-二个在滋养层上，用于-80t:冻存。
1.2. 2. Mi to i-Photina ES TBV2克隆选择
用正如上述的用于ES TBV2 mito c-Photina⑧细胞系的方法选择 克隆。
最终的克隆是第70号和43号。70号克隆显示最高的组胺应织图 17A) ， 43号克隆也显示很好的组胺剂量反应(数据未显示)。两者 细胞裂解后的总光发射都很好(图17B)。
也用DNA印迹分析它们，显示只在一个位点整合，但没有应用实 时PCR分析它们。
两者的核型都是正确的。
1. 3. 1. i-Photina ES TBV2克隆
鼠科ES TBV2 i-Photina⑧细胞系是通过用BglII限制酶线性化的 含有i-Photina⑧发光蛋白基因的pcDNA3栽体电穿孔ES TBV2 p16细 胞而获得(材料和方法)。
转染48小时后，对细胞用200 Mg/ml G418进行选择。经过8 天的选择后，挑选99个抗药菌落，在MEF层上扩增直到它们在一式5 份的96孔/培养板上达到汇合，其中
-两个在明胶包被的96白色MTP上，用于基于CCD照像机的光度 计在接种后24和48h后检测。
-一个在明胶包被的96白色MTP上用于DM提取。
-二个在滋养层上，用于-80lC冻存。
1. 3. 2. i-Photina ES TBV2克隆筛选
用正如上述的用于ES TBV2 mito c-Photina⑧细胞系的方法选择 选克隆。
最终克隆是第113号和109号。113号克隆号显示了最高的组胺 应答(图18A)。两者细胞裂解后的总光发射都很好(图18B)。
也用DNA印迹分析它们，显示只在一个位点整合，但没有应用实
时PCR分析。
两者的核型都是正确的。
2.转染发光蛋白的P19细胞系的建立
2. 1.1. Mito c-Photina P19克隆
P19 mito c-Photina⑧细胞系是通过用BglII限制酶线性化的含有 mito c-Photina⑧发光蛋白基因的pcDNA3载体电穿孔P19细胞而获得 (材料和方法)。
转染48小时后，对细胞用700 ng/mlG418进行选择。经过7-8 天的选择后，挑选抗药菌落，并扩增。
2. 1.2.Mito c-Photina P19克隆选择
检测前4小时，在黑暗中，在371C下，于含5。/SC02的潮湿空气中， 将培养基替换为50 pl/孔的tyrode緩冲液，2 mM Ca'+和10 juM腔 肠素，以便重新组成有活性的发光蛋白。
针对光发射检测，首先分析细胞应答组胺的能力(发光信号)，已 知组胺能刺激P19内源组胺-1受体(58)，提高胞质Ca"浓度。
根据应答组胺的发光蛋白活性和用Triton X-100裂解细胞后检测 的发光蛋白总含量，选择出两个最终克隆(图19)。也考虑他们分化 过程后分化成自发搏动心肌细胞和神经元的能力，所述分化过程在 0.5-1% DMS0和视黄酸存在或不存在的条件下利用胚状体获得，DMS0 是心肌细胞发育的诱导剂，视黄酸是神经元发育的诱导剂 (61,62,64,67 )。
2. 1.3. P19/mito c-Photina /lAl克隆体外向神经元镨系分化
表达mito c-Photina⑧细胞的多潜能胚胎癌P19 1A1克隆，经证 实能在体外分化成神经元细胞类型。免疫荧光证明这些细胞表达神经 元特异标记，如神经丝H (NFH)和神经元核(NeuN)(图20A和20B)， 或者神经前体细胞标记(巢蛋白)(图20C)。
这些细胞的功能也用基于CCD照像机的光度计进行研究。在分化 的第8天和第11天(分别是胚状体解离和接种到384MTP中的聚D-赖 氨酸上后的第4天和第7天)，细胞在包含10 juM腔肠素的tyrode
溶液中温育4小时。电压门控钩离子通道通过注入40 mM KC1或作为 对照的标准tyrode进行刺激，显示最佳应答反应(图21)。
在分化第8天，同样的细胞也在FLIPRW中分析，通过将细胞用 FLU0-4 N^温育，注入40 mM KC1去极化剂来进行。在这种情况下， 因为细胞有钙进入，也存在信号的明显增加，即使带有用发光报告系 统观察到的最差的动力学形状(图22)。
也用FLIPR^分析处于相同发育阶段的细胞(第8天)，以检验 代谢型或离子型谷氨酸盐受体(图23B，虚线)或者组胺-l受体(GqPCR) (图23B,实线)的存在。在未分化的P19/mito c-Photina /lAl克 隆上同时进行相同的实验(以3000细胞/孔接种于384MTP后24小时。 图23A)。显著地，未分化细胞中在组胺刺激后记录的信号更高(如同 预期，因为它在此阶段高度表达)，并且在分化期间减少。谷氨酸盐刺 激显示相反的结果，因为它在分化细胞中的表达要高于未分化细胞。 谷氨酸盐受体的存在更进一步地证明了这些细胞的神经元定向。
3. 瞬时转染
用不同的线粒体标记的发光蛋白转染P19细胞(材料和方法)， 以《吏评价这些其他发光蛋白，以测定胞内钙释放的能力和获取发光蛋 白表达水平的信息。
检测前4小时，在黑暗中，在37匸，含5%0)2的潮湿空气中将培 养基替换为tyrode緩沖液和10 juM腔肠素，以便重新组成有活性的 发光蛋白。
100 pM组胺注射后记录发光信号60秒。
然后用Triton X-100裂解细胞以探测总光释放(图24)。
4. 稳定转染
在P19细胞中进行不同线粒体标记的发光蛋白的稳定转染(材料 和方法)以便研究在稳定整合方式下发光蛋白的表达水平，以及检验 P19细胞中稳定表达的发光蛋白在长期的培养过程中都没有毒性。
检测前4小时，在黑暗条件，37"，含5% C02的潮湿空气中，将 培养基替换为tyrode緩冲液和10 p M腔肠素，以便重新组成有活性的
发光蛋白。
注射50、 100和150 pM组胺后记录发光信号并测定60秒。 然后用Triton X-100裂解细胞以探测总光释放(图25)。 5.FLIPIT基于细胞的荧光试验
P19 mito c-Photina⑧的最终克隆(1A1和1A2 )也用FLIP『检 测，所述检测通过测量由内源组胺1受体活化诱导的钙浓度变化而进 行，所述检测使用荧光而非发光的方法。
用钩3-试验试剂盒温育细胞(Molecular Devices Corporation, S醒yvale， CA， USA)。
进行这些实验以比较使用荧光钩检测方法代替基于发光的钩检测 的结果，并评价发光优于荧光的优点。获得的结果显示与发光比较， 基于荧光的方法具有较高的背景。这反映为荧光较低的信噪比的背景。 相反地，发光的信噪比背景较高，这反映在与荧光相比较宽的动态范 围上(图26)。
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权利要求
1. 非人转基因动物、其后代和细胞衍生物，所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物能表达脱光蛋白基因，并产生应答胞内钙浓度变化的生物发光信号。
2. 根据权利要求1所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物，产生是普遍存在的。
3.根据权利要求1所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物，产生是可诱导的和/或是器官-、组织-、细胞-、或发育阶段特异性 的。
4. 根据上述任意一项权利要求所述的非人转基因动物、其后代和 细胞衍生物，它们为非人哺乳动物。
5. 根据权利要求4所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物，它们是啮齿类动物。
6. 根据权利要求5所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物， 它们是小鼠。
7. 根据上述任意一项权利要求所述的非人转基因动物、其后代和 细胞衍生物，其中所述脱光蛋白基因是任何天然的或者重组的或者合 成的来源的脱光蛋白基因。
8. 根据权利要求7所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物， 其中所述脱光蛋白是具有改良的发光活性和/或钙敏感性的天然的或 者诱变处理的突变体。
9. 根据权利要求8所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物， 其中所述脱光蛋白基因具有针对哺乳动物密码子使用而优化的序列和 /或融合到线粒体靶序列上的序列。
10. 根据权利要求1所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生 物，其中所述脱光蛋白序列如SEQ ID No. l所示。
11. 根据权利要求1所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物，其中所述脱光蛋白序列是，在下述位置Gly142->Cys进行诱变处理 的Clytin序列(GenBank登录号Q08121)。
12. 根据权利要求1所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生 物，其中所述脱光蛋白序列是，在下述12个位置进行诱变处理的 Clytin序列(GenBank登录号Q08121) : Gly5「>Glu、 Asp69->Val、 Ala70—>Cys 、 Lys76_>Arg 、 Lys7「>Gly、 Ile7「>Cys 、 Asp 8广〉Glu 、 Val86->Ile、 Glu8「>Ala、 Ala90->Gln、 Val92->Leu和Glu97->Gln
13. 根据上述任意一项权利要求所述的非人转基因动物的细胞衍 生物，它们能够成为，或者分化为特定细胞镨系，以得到特异目标基 因的表达。
14. 根据权利要求13所述的非人转基因动物的细胞衍生物，其中 所述特定细胞谱系是心肌细胞谱系或者神经元谱系或者间充质细胞谱 系或者造血细胞i脊系。
15. 识别能刺激特异靶标从而获得胞内Ca"变化的配体的方法， 其包括下述步骤a) 提供根据权利要求13或14的细胞衍生物；b) 得到所述靶标的表达；c) 用适当的发色团作为底物，加载细胞；d) 用包括所述靶标的推定配体的化合物文库接触细胞；e) 探测发光蛋白的生物发光。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述特定细胞镨系是心肌 细胞i普系或神经元i普系。
17. 根据权利要求15或16所述的的方法，其通过高通量筛选进行。
18. 识别靶标拮抗剂从而获得胞内Ca"变化的方法，其包括下述 步骤a) 提供根据权利要求13或14的细胞衍生物；b) 得到所述靶标的表达； c) 用适当的发色团作为底物，加载细胞；d) 用包括所述靶标的推定拮抗剂的化合物文库接触细胞；e) 用能刺激所述靶标的配体接触细胞；f) 探测发光蛋白的生物发光变化。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中特定细胞谱系是心肌细胞 镨系或者神经元谱系或者间充质细胞i普系或者造血细胞谱系。
20. 根据权利要求18或19所述的方法，其通过高通量筛选进行。
21. 识别能剌激根据权利要求13或14的细胞衍生物分化为特定 细胞镨系的试剂的方法，其包括下述步骤a) 提供根据权利要求1-12的处于未分化阶段的非人转基因动物 的干细胞衍生物；b) 将所述干细胞衍生物暴露于包括推定诱导分化剂的化合物文库；c) 得到至少 一个特定细胞谱系靶标的表达；d) 用适当的发色团作为底物，加栽细胞；d) 用配体刺激所述特定细胞谱系靶标从而获得胞内Ca"的变化；e) 探测发光蛋白的生物发光。
22. 根据权利要求21所述的方法，其通过高通量筛选进行。
23. 识别能抑制根据权利要求13或14的细胞衍生物分化为特定 细胞镨系的试剂的方法，其包括下述步骤a) 提供根据权利要求1-12的处于未分化阶段的非人转基因动物 的干细胞衍生物；b) 将所述干细胞衍生物暴露于包括推定抑制分化剂的化合物文库；c) 将所述干细胞衍生物暴露于已知诱导分化剂，以得到至少一个特定细胞镨系靶标的表达；d) 用适当的发色团作为底物，加载细胞；e) 用配体刺激所述特定细胞谱系靶标从而获得胞内Ca—的变化；f) 探测发光蛋白的生物发光。
24. 根据权利要求23所述的方法，其通过高通量筛选进行。
25. 根据权利要求l-12任一项所述的非人转基因动物的细胞衍生 物的用途，其中所述细胞衍生物用作ES/发光蛋白细胞分化后得到的"类初级"细胞的阳性对照。
26. 根据权利要求1-12任一项所述的非人转基因动物的细胞衍生 物用途，其中包含作为报告系统的发光蛋白的所述细胞衍生物用于化 合物的筛选。
27. 根据权利要求1-12任一项所述的非人转基因动物的组织或者 器官衍生物的用途，所述组织或器官衍生物包含作为报告系统的发光 蛋白，用于药理学的离体研究和动物模型中的移植实验。
28. 根据权利要求1-12任一项所述的非人转基因动物及其后代的 用途，其用于生物成像研究。
29. 根据权利要求1-12任一项所述的非人转基因动物及其后代的用途，其用于与药理学相关动物模型杂交.
30. 根据权利要求28所述的非人转基因动物及其后代的用途，其 中所述动物模型是携带报告基因的转基因动物，或者KO或KI突变体动 物模型。
31. 根据权利要求1-12任一项所述的非人转基因动物及其后代的 用途，其用于某一物质的毒性和/或畸形学的体内测试。
全文摘要
本发明描述一种能在体内合成和表达脱光蛋白(apophotoprotein)的非人转基因动物、其后代、细胞衍生物及其应用。
文档编号G01N33/68GK101384616SQ200780005156
公开日2009年3月11日 申请日期2007年1月10日 优先权日2006年1月11日
发明者C·努奇, S·卡伊纳卡, S·洛默尔, S·科拉扎 申请人:Axxam股份公司