专利名称：用于制备生物样品的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及根据权利要求1或8前序部分通过一系列含有制备试剂 的不同液体来制备生物样品的方法和装置。通过这种方法例如可以通过
染色对样品进行标记。
背景技术：
对于多种生物样品的检查方法，例如透射电子显微镜检查生物组织 切片，必要的是制备通过染色标记的样品。染色通过利用如重金属溶液 的制备试剂处理来进行。为此在电子显微术中一般情况下使用乙酸双氧
强电子显微图像中的对比度。为处理组织切片，迄今为止使用从手动对 比度调节(kontrastierung)至自动方法的不同方法。
手动对比度调节方法利用将标记溶液滴入培养皿中进行。在此方 面，手动操作需要大量人力劳动，特别是要标记大批量的组织样品时。 此外存在受到污染损害的危险，这些污染可能在手工操作时带入样品和 标记溶液内。
所述手动对比度调节方法存在诸多缺点。乙酸双氧铀和柠檬酸错毒 性极高。柠檬酸铅溶液与C02接触时沉淀出碳酸铅。此外，组织切片在 处理期间受到污染而不能使用。因此手动对比度调节会带来非常大的问 题。此外，同时只能处理少量的网格(="Grids",也就是用于电子显 微术制品的小载物台)。虽然存在可以在简单的支撑装置上处理大量网 格的手动方法，但这些方法不能解决沉淀和污染的问题。
由US 4,358,470已知在前面所述类型的方法和装置中， 一种固定的 室具有第一上部和第二下部连接，它们通过阀系统与液体容器连接。阀 系统这样控制向室内或从室内输入和排出液体，如果所要引入的液体的 比重小于位于室内液体的比重，则液体通过第一上部连接引入室内，而 如果所要加入的液体的比重大于位于室内液体的比重，则使液体通过第
。溶解的重金属吸附在某些细胞结构上并由此增
二下部连接引入室内。由此避免液体混合。
Leica Microsystem GmbH公司以"EMSTAIN"的名称销售一种用 于在一道工序中最高25个网格自动对比度调节的仪器。在这种仪器上， 网格定位在上面和底面上分别具有管道连接的固定的室内。通过由管道 和阀组成的系统，将对比度调节过程所需的溶液依次泵入室内。为不使 重和轻溶液不必要地混合，液流在对比度调节过程期间必须多次通过一 个阀开关变换极性。
在US 4,358,470中和Leica Microsystem GmbH公司的仪器中，需 要一种复杂的阀开关，以改变液流的方向。这一点造成溶液的高消耗。 此外需要复杂的清洗程序。
发明内容
本发明的目的在于，简化前面所述类型的方法或装置中要引入室内 的液体的更换。
本发明的目的特别是在于，减少前面所述类型的方法或装置中要引 入室内的液体必须流过的传输路径及其死角。
此外，本发明的目的在于，简化前面所述类型的方法或者装置的清洗。
这些目的在方法方面通过权利要求1特征部分所述的特征，并在装 置方面通过权利要求8特征部分所述的特征得以实现。
为向室或从室输入和排出用于制备生物样品的液体，该装置具有一 个装置，其由至少一个输入管道、至少一个排出管道、至少一个储液罐 或容器和优选至少一个阀组成，所述阀特别是分配给储液罐并调节液体 从该储液罐到与储液罐连接的输入管道的输入。另一个阀或者多个其他 阀可以将废液流分类到不同的废液管道和废液容器，以便在使用后可以 分开收集所使用的不同液体。
一系列含有制备试剂的不同液体是指将不同的液体随后引入室内 或所要制备的(生物)样品与不同的液体顺序产生接触。在此方面，根 据本发明的方法和根据本发明的装置这样设计，使得不仅可以使用含有
制备试剂的液体，而且也可以使用洗涤液体，特别是水。
正如在US 4,358,470和所提到的Leica Microsystem GmbH公司的 仪器中那样，为避免液体混合，如果所要引入的液体的比重小于位于室 内液体的比重，液体从上面引入室内，而如果所要引入的液体的比重大 于位于室内液体的比重，则液体从下面引入室内。
然而，与US 4,358,470和所提到的Leica Microsystem GmbH公司 的仪器相反，根据本发明，如果需要从上面或者下面填充室的话，不通 过阀开关改变液体流动的方向。在根据本发明的方法和根据本发明的装 置中，液体始终通过一个和同一个室开口输入到室并始终通过一个和同 一个室开口从室排出。
从上面或者从下面有选择的填充室由此实现，即可以将室置于两个 不同的位置。然后输入口根据位置位于排出口的上面或者下面。
在此方面，与室内的第一开口连接的输入管道和与室内的第二开口 连接的排出管道与室一起运动。也就是说，如果第一开口布置在第二开 口的上面，那么输入管道(至少在与第一开口的接触区内)也布置在排 出管道的上面。输入管道和与其连接的第一开口之间或排出管道和与其 连接的第二开口之间在制备样品期间不分离。
由于室可以转动，因此可以将输入口和排出口分别置于正确位置。 因此不需要在其他情况下必须调节室的输入和排出和定期逆转室内流 动方向的复杂的阀系统。
由于可以将室置于不同的位置，从而不需要改变液体流动的方向， 可以达到明显缩短系统内所使用的传输路径的目的。对于采用方向逆转 的系统来说，需要附加的阀，其结构上始终造成一定的死角。为逆转方 向，或者在室上或者在阀区内在各室开口上需要输入和排出标记溶液的 备选管道。但如果不逆转液流的方向，那么输入口和排出口仅需各一个 管道。
向室输入重金属溶液的管道原则上必须额外冲洗，因为柠檬酸铅不 可以和乙酸双氧铀接触(沉淀)。在采用方向逆转的系统中，比重较大 的溶液通过下面与室连接的管道输入和排出，比重较小的溶液通过上面
与室连接的管道输入和排出。为使不相容的重溶液不直接依次通过下部 管道泵送，残留在管道内的标记溶液剩余物必须额外冲出。
在根据本发明的系统中，所有液体均通过相同的管道以它们需要到 达室内的顺序输入。标记溶液的剩余物因此自动被下个用于标记(并因 此相容)的溶液从管道冲出。
通过根据本发明的系统缩短了传输路径，根据程序清洗所花费的时 间明显少于现有技术的相应仪器所花费的时间。管道系统不需要方向逆 转的备选传输路径。清洗溶液可以像标记溶液那样在一个方向上通过系 统泵送并到达向室输入和排出的总管道系统。
在采用方向逆转的系统中，清洗溶液相反则必须依次通过备选的传 输路径进行冲洗。此外，放弃方向逆转将装置中所需的岡数量和与其必 然相关的死角降到最低限度。
本发明的实施方式是从属权利要求的主题。
此外在Leica Microsystem GmbH公司的仪器中阀和泵的敏感部件 与液体直接接触。这些部件由耐侵蚀的材料制成，它们在这里表现出不 够稳定。由此会导致沉积，另外所使用溶液的低pH值造成损害和功能 干扰。因此利用这种仪器经过较长时间不能达到恒定的对比度调节质 量。
为避免这种损害和功能干扰，在根据本发明的装置中，泵和/或者阀 包含由对所使用的侵蚀性介质稳定的柔性材料制成的空心体，优选是软 管，其中，通过泵和/或阀流动的液体在通过泵和/或阀流动期间仅与该 空心体接触。由此液体不与泵或者阀的敏感部件接触。与此相应，泵和 /或者阀优选由软管蠕动泵(Schlauchperistaltikpumpe )或软管夹紧阀 (Schlauchklemmventile)组成。
所使用的软管优选然后根据所使用溶液的化学特性进行选择。此 外，软管损坏时可以比泵和阀的其他机械部件更加简单和成本更加低廉 地进行更换。不言而喻，这种具有对侵蚀性介质稳定的空心体的泵和/ 或阀不仅可以在根据本发明的装置上，而且也可以在侵蚀性介质通过泵 和/或阀流动的现有技术的任何仪器上使用，特别是在根据权利要求8
前序部分，用于通过一 系列含有制备试剂的不同液体来制备生物样品的 装置上使用。
所使用溶液的化学特性以及例如用于电子显微镜制品的高纯度标 准对对比度调节仪器提出通过根据本发明的方法和根据本发明的装置
可以满足的下列要求
(1)所述装置应具备防止空气接触(特别是柠檬酸铅与co2)的性能。
(2 )管道系统以及阀和泵应对液体的侵蚀性物质和可能的沉积尽可能 不敏感。
(3) 该系统应该可利用溶解沉积的硝酸(HN03)得到4艮好的冲洗。这 一点得益于短的传输路径和尽可能少的死角。此外，由此减少(有毒) 化学品的消耗。
(4) 管道系统的所有组成部分均应可以简单和低成本地更换。
根据本发明装置的第一开口优选与具有至少一个储液罐和至少一 个阀的输入管道系统连接，以便可以向室输入制备或者冲洗样品所需的 液体。特别有利的是具有一个以上的储液罐，以便可以简单方式将一系 列不同的液体导入室内。
在本发明的一种优选实施方式中，所述室具有与第一开口相邻，也 就是说，特别是直接靠近第一开口这样布置的第三开口，使得所述第三 开口与室内第二开口相关的几何定位基本上与第一开口与室内第二开 口相关的几何定位相同。
室的第三开口优选与输入管道系统连接，该系统基本上与在本发明 的一种优选实施方式中第一开口所连接的输入管道系统相同构成。但所 使用的储液罐的数量可以在与第一和与第三开口连接的输入管道系统 之间变化。
在本发明的一种可选择的实施方式中，第三开口这样构成，使其可 以接收一个可手动操作的填充装置。为此可以将用于中继(vermittlung ) 所述填充装置在第三开口的接收的转接器安装在第三开口上或者整合 入第三开口 。本发明意义上可手动操作的填充装置例如是常用的单路注
射器(Einwegspritze )或者哈密顿注射器或用于计量流体的相应装置。
上述装置优选这样构成，使得在所述输入管道系统中整合入一个混 合装置，所要使用的不同液体可以以可预先规定的确定混合比例导入该 混合装置内。在将所导入的液体混合后，这些液体然后可以输入到室和 位于室里面的样品。本发明的这种方案仅适合在所要混合的液体彼此间 没有不相容性反应(例如像析出沉淀物或者类似物质)的情况下使用。
下面借助附图，特别是图l对本发明的实施例进行详细说明。其中
图1示出本发明第一实施例在第一工作状态下的示意图2示出本发明第一实施例在第二工作状态下的示意图3示出本发明第二实施例的示意图4示出本发明第三实施例的示意图。
具体实施例方式
图1中采用10标注室。室10具有一个输入口 12和一个排出口 14。 室10环绕轴16可转动地放置在(附图中未示出的)支架上，从而可以 将室10置于不同的位置。室10通过(附图中未示出的)电动机进行转 动。室10可在两个180。角度交错的位置上锁定。
在室10的图1所示的位置上，输入口 12位于排出口 14的下面。 在此，排出口 14垂直位于输入口 12的上面。这对应室10根据本发明 的第二位置，其相当于装置的第一工作状态。在图1中图纸上对着上面 的室10的面(在该面布置排出口 14)实际上在根据本发明的装置中也 向上定位，而图1中对着下面的室10的面(在该面布置入口 12)在根 据本发明的装置中则向下定位。
在所示的实施例中，所述室由两部分组成，即一个底板和一个盖板。 底板为正方形，侧面长度约5cm和高度为5mm。底板作为网格板的垫 板(Auflage)使用。盖板的侧面长度相同且高度为10mm。盖板具有4 mm深、直径38 mm的圆形凹槽(Aussparung )。该凹槽形成里面由溶 液环绕冲洗网格的空腔。凹槽内通入两个约lmm的孔(开口 12和14), 它们在室安装的情况下分别位于凹槽的最低和最高点上。两个室部分与 布置在其间的网格板通过未示出的直接与电动机连接的接收装置
(Aufnahmevorrichtung )结合。
输入口 12和排出口 14不一定非得像图1所示那样从下面或从上面 通向室10的圆柱形空腔的圆周上，而是也可与空腔的圆周垂直，也就 是垂直通向圆柱形空腔在图1中向前的覆盖面，并产生室10的空腔与 软管18、 36的输入或者排出系统相应的连接。在这种情况下，输入口 12和排出口 14在室IO的安装状态下布置在室IO的凹槽或空腔的基本 最高点或基本最低点上，它们在本发明的意义上也理解为室10的最高 或者最低点。
室10或其空腔不一定非得是圆柱形，而是可以具有任意的形状。 在室IO或其空腔的体积方面，也可以设想很大的变化可能性。事实证 明，约3.5ml的体积有益于网格的处理。对于其他用途来说，体积明显 更大或者明显更小可能是有利的。
室10的输入口 12可通过一个或更多个软管18和电磁软管夹紧阀 与液体容器连接。在所示的实施例中，具有四个这种软管夹紧阀20、 22、 24和26和四个这种液体容器28、 30、 32和34。通过电磁软管夹紧阀 20、 22、 24和26，调节所需的液体从液体容器28、 30、 32和34向室 10的输入。
在所示的实施例中涉及一种对比度调节器(Kontrastierer),通过其 利用重金属溶液处理组织薄切片。与此相应，液体容器28含有水，液 体容器30含有硝酸。液体容器32含有乙酸双氧铀和液体容器34含有 柠檬酸铅。室10用于容纳装备有网格的网格板(Hiraoka公司，通过 Electron Microscopy Sciences以产品编号71560-10销售)。这种网格板 由挠性塑料组成并具有容纳网格的缝隙。缝隙可以通过将板弯曲打开并 装入网格。在松开板时将网格锁定。
室10的排出口 14通过软管36与软管蠕动泵38连接。此外，软管 蠕动泵38通过软管40与两个3通软管夹紧阀42和44连接。在3通软 管夹紧阀42和44的后面，软管46、 48和50通向(附图中未示出的) 废液容器。(在前面所述Leica Microsystem GmbH公司的仪器中废液同
样分类，但不使用3通软管夹紧阀)。
这里所4吏用的软管蠕动泵是Rietschle Thomas Puchheim GmbH公 司(Siemensstr. 4， 82178 Puchheim )的SR 25型号，而这里所4吏用的软 管夹紧阀是Sirai Deutschland GmbH ( Mfinchener Stra卩e 15， 85643 Steinh6ring)的S104.09和S305.07型号。
该装置利用下列步骤实施对比度调节法
1. 水打开阀20并将1120从容器28通过泵38抽入室10内，直至将 其完全注满。H20在室内保留约5分钟。
2. 利用乙酸双氧铀进行对比度调节打开阀24并将乙酸双氧铀从容器 32抽入室10内。在将水通过乙酸双氧铀完全更换后断开泵并关闭阀24。 乙酸双氧铀在室内保留约30分钟。
3. 冲洗将室10转动180。，打开阀20并将位于室10内的乙酸双氧 铀通过水替换(参照图2 )。在这种情况下接通阀42和44，从而液体通 过软管50排出。多次重复这一过程。结束时再将室10转回180° 。
4. 利用柠檬酸铅进行对比度调节打开阀26并将柠檬酸铅从容器34 抽入室10内。在将水通过柠檬酸铅完全更换后断开泵38并关闭阀26。 柠檬酸铅在室10内保留约20分钟。
5. 冲洗将室10转动180° ，打开阀20并将位于室10内的柠檬酸铅 通过水替换(参照图2)。在这种情况下接通阀42，从而液体通过软管 48排出。多次重复这一过程。结束时再将室10转回180° 。
6. 排空室10:将室10转动180。(参照图2)。将软管18与输入口 12 分开。接通泵38并将位于室10内的水通过软管46泵出。再将软管18 与输入口 12接上。
在本发明一种可选择的实施方式中，室10借助附加的阀进行排空，该 阀可以将空气通过输入口 12输入到室10内。在这种情况下，可以免去 将软管18分开和随后重新与输入口 12连接，这样可以使根据本发明的 装置的操作变得容易。
7.清洗为此打开阀22并将HNO3从容器30通过室10、泵38和排出 软管36、 40泵出。在约2分钟后，重新关闭阀22并打开阀20,从而水 以相同的方式通过系统泵入并洗掉HN03 。
该方法优选通过计算机程序控制。程序运行通过图1中未示出的计 算机控制，其通过继电器模块控制泵38、阀20、 22、 24、 26、 42和44 以及用于转动室10的电动机。
已表明，与现有技术相比通过根据本发明的方法和根据本发明的装 置，所使用的对比度调节溶液可以减少40 %以上和废液量可以减少60% 以上。此外，根据本发明的装置允许使用单独制造的溶液(如传统上在 手动对比度调节时所使用的那样)，该溶液因此可以现场根据相应的应 用领域确定。
轴16在图1所示的实施例中与输入口 12和排出口 14距离对称地 布置在室10的中心。在本发明一种未示出的方案中，轴比排出口 14更 靠近输入口 12布置。这样做在室IO转动时的优点是，与其同时转动的 输入管道系统的软管18仅需完成较小的运动。由此软管18比轴16中 心布置的情况下具有更小的长度，这样在输入管道侧上减少所要流过的 体积。
但在这种方案中，排出管道侧的软管36必须略微加长构成，因为 它在室10的相应转动时必须完成比轴16的中心布置更大的运动。但输 入管道侧上的软管16节省体积的优点明显超过排出管道侧上的软管36 加大体积可能产生的缺点。
图2示出本发明第一实施例的示意图，其中室IO位于第一位置上， 而不是像图l那样位于第二位置上。在该第一位置上，输入口 12布置 在排出口 14的上面，从而密度小于位于室IO内液体密度的液体可以注 入室IO或其空腔100内。
图2的视图仅示出第一实施例的第二工作状态，其与图l所示的第 一工作状态区别在于室10的位置不同。图1和2的装置其他方面彼此 没有区别，从而参阅对图1的上述说明。
图3示出本发明第二实施例的示意图，其中，该装置不变的部件具
有与图l和2相同的附图标记；在相应的"^兌明方面参阅对图l和2的上 述详细说明。
与第一实施例的区别在于，室10具有作为第三开口的第二输入口 15，其与输入口 12相邻与排出口 14基本上垂直相对布置。用于接收注 射器17的转接器19与第二输入口 15流体连接。借助注射器17可以将 少量的液体额外地与通过软管18输入的液体一起引入室10或其空腔 100内。这种液体可以是与室10内相同的液体或者是与室10内已经存 在的液体不同的液体。
在第二输入口 15的一种相应实施方式中，也可以放弃布置转接器。
图4示出本发明第三实施例的示意图，其中，该装置不变的部件具 有与图l和2相同的附图标记；在相应的i兌明方面参阅对图l和2的上 述详细说明。
在该实施例中，在软管18，也就是输入软管系统中，额外在容器 28、 30、 32、 34与室10之间提供作为混合装置的混合器21。来自容器 28、 30、 32、 34的液体因此首先被导入混合器21内，在那里混合并随 后输入到室IO或其空腔。
不同实施例的不同部件可以任意结合相互组合。对于专业人员来说 显而易见的是，根据本发明的装置或根据本发明的方法不仅适用于处理 在电子显微术中所使用的网格，而且也适用于处理大量不同的样品。在 每种情况下所要使用的液体也相应地不同。所提供的储液罐或容器的数 量可以与此相应进行匹配。在这里详细介绍的实施例中为不同的液体分 别使用四个容器28、 30、 32、 34，而相应地可以使用更多或更少的容器。 所使用的阀数量然后相应匹配。
本发明在附图中未明确示出的另 一实施例是一种通过一系列含有制备 试剂的不同液体制备生物样品的装置，该装置包含(a)具有第一和第二 开口 (12、 14)的室(10)，和(b)具有用于向室(10)或从室(10)输 入和排出液体的装置(38)，其中，(c)该装置具有至少一个泵和/或至少 一个阀，它们具有由对所使用介质稳定的柔性材料组成的空心体，其中， 通过泵和/阀流动的液体仅与该空心体接触。
权利要求
1. 用于在具有向室(10)或从室(10)输入和排出液体的第一和第二开口(12、14)的室(10)内通过一系列含有制备试剂的不同液体来制备生物样品的方法，其特征在于，a)如果待引入室(10)内的液体的密度小于位于室(10)内的液体的密度，那么室(10)被置于第一位置，在该位置上第一开口(12)位于第二开口(14)上面，b)如果待引入室(10)内的液体的密度大于位于室(10)内的液体的密度，那么室(10)被置于第二位置，在该位置上第一开口(12)位于第二开口(14)下面。
2. 根据权利要求l的方法，其特征在于，第一开口 (12)在第一 位置上位于室(10)的最高点和/或第二开口 (14)在第一位置上位于 室(10)的最低点。
3. 根据权利要求1或2的方法，其特征在于，第一开口 (12)在 第二位置上位于室(10)的最低点和/或第二开口 (14)在第二位置上 位于室(10)的最高点。
4. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于，在室(10)的 第一位置上第一开口 (12)垂直位于第二开口 (14)上面和/或在室(10) 的第二位置上第二开口 (14)垂直位于第一开口 (12)上面。
5. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于，所述液体通过 室(10)的流动始终从第一开口 (12)向第二开口 (14)进行。
6. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于，室(10)从第 一位置向第二位置和从第二位置向第一位置的运动通过室(10)分别旋 转180°来进行。
7. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于，室(10)的运 动通过电动机来进行。
8. 用于通过一系列含有制备试剂的不同液体来制备生物样品的 装置，所述装置包含(a) 具有第一和第二开口 (12、 14)的室(10),和(b) 用于向室(10)或从室(10)输入和排出液体的装置(38)，其特征在于，(c) 室(10)是可转动地放置的，和(d) 所述装置具有用于将室(10)有选择地转动到第一和第二位置 的转动装置，其中，(e) 在室(10)的第一位置上第一开口 (12)位于第二开口 (14) 上面，和(f) 在室(10)的第二位置上第一开口 (12)位于第二开口 (14) 下面。
9. 根据权利要求8的装置，其特征在于，(a) 第一开口 (12)仅构成为输入口，和(b) 第二开口 (14)仅构成为排出口，其中，(c) 所述液体通过室(10)的流动始终从第一开口 (12)向第二开 口 ( 14 )进行。
10. 根据权利要求8或9的装置，其特征在于，所述转动装置具有 电动机。
11. 根据权利要求8 10中任一项的装置，其特征在于，所述装置 具有至少一个泵和/或至少一个阀，它们具有由对所使用介质稳定的柔 性材料构成的空心体，其中，通过泵和/或阀流动的液体仅与该空心体 接触。
12. 根据权利要求8 11中任一项的装置，其特征在于，第一开口 (12)与具有至少一个储液罐和至少一个阀的输入管道系统连接。
13. 根据权利要求8 12中任一项的装置，其特征在于，所述装置 具有与第一开口 (12)相邻布置的第三开口 (15)。
14. 根据权利要求13所述的装置，其特征在于，第三开口 (15) 与具有至少一个储液罐和至少一个阀的输入管道系统连接。
15. 根据权利要求13所述的装置，其特征在于，第三开口 (15) 设计为用于接收可手动操作的加料装置(17)。
16. 根据权利要求12或14的装置，其特征在于，所述输入管道系 统具有设计用于将待输入到室(10)的不同液体以可预先规定的混合比 例接收和混合的混合装置(21)。
全文摘要
本发明涉及用于制备生物样品的方法和装置，其中在具有向室(10)或从室(10)输入和排出液体的第一和第二开口(12、14)的室(10)内通过一系列含有制备试剂的不同液体来制备生物样品。如果待引入室(10)内的液体的密度小于位于室(10)内的液体的密度，那么室(10)被置于第一位置，在该位置上第一开口(12)位于第二开口(14)上面。如果待引入室(10)内的液体的密度大于位于室(10)内的液体的密度，那么室(10)被置于第二位置，在该位置上第一开口(12)位于第二开口(14)下面。
文档编号G01N1/30GK101384893SQ200780005079
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月9日 优先权日2006年2月10日
发明者亚历山大·格鲁尔, 比约恩·夸斯特 申请人:柏林自由大学