用于测量流体中微观对象的光致发光、吸收以及衍射的设备和方法

专利名称：用于测量流体中微观对象的光致发光、吸收以及衍射的设备和方法
用于测量流体中微观对象的光致发光、吸收以及衍射的设备和方法
背景技术：
本发明涉及用于对测量容器中存在的流体的光致发光进行测量的设备 和方法的一般领域。这种设备和方法特别用于对流体，例如生物流体中的 微观对象(或粒子)进行计数。
更准确地说，本发明涉及基于使用部分相干光源(例如发光二极管
(LED))作为激发流体中存在的分子(例如荧光分子)的手段的设备。
由光致发光引起的光发射是一种基本上各向同性的辐射现象，其在由
光能已经在先激发的易激分子返回其基态时产生，所述激发在该分子的特
定波长处发生。由于光致发光引起的光发射总是在低于激发频率的频率处
发生。通常远离入射光的激发轴，并且经由仅将感兴趣的谱带通过检测器
的彩色滤波器来执行测量。
本发明特别涉及能够检测到非常微弱的光致发光信号的开发中的光学
和光电装置，诸如那些用于标记生物分子(例如蛋白质或核酸)的光学和光电装置。
在动物生物学中，测量光致发光信号对于从业者来说尤其有利于作出 诊断，特别是细胞学诊断，在细胞学诊断中，能够检测并对稀有的细胞系， 如造血千细胞或者在血液或其它生物流体中出现的其它元素进行计数是非 常有用的。
生物元素的光致发光测量，不论该光电发射是自然的还是由分子探针 诱发的，都在流式细胞仪和自动细胞仪领域，尤其是对于血液细胞学有着 广泛的应用。
所使用的分子探针可以是对于特定类型的分子各具有固有亲和力的活 休染料或者超活体染料，诸如插入核酸的染料。它们也可以是以下类型的 免疫学探针(immunological probe):即包括单独的或者串联(in tandem) 的抗体和移植于其上的染料分子(通常是荧光染料)，或者有时候是纳米晶 体。抗体将可具体结合到己知作为抗原或抗原决定簇(antigenic determinant)的分子或分子部分上，并且随后可通过测量光致发光进行计数。
通过实施免疫学探针进行标记的方法广泛应用于细胞学鉴别，特别是
借助于流式细胞仪技术。
为了获得这种测量所要求的灵敏度级别，激发光源必须能够传输足够
的能量以使得在己标记的生物元素通过激发光束时，能够以足够的灵敏度
检测到每个已标记的生物元素。
为了获得这种能力，大多数利用这些荧光技术的血细胞计数器或机器
使用基于气态、固态或其它源的激光型光源，或者半导体源，如激光二极
管或其它激光派生物，例如二极管-泵浦固体(DPSS)源。
激光型源具有非常好的空间相干性和高的功率，但是激光束的高斯结 构影响测量点处的光场的均匀性。为了获得测量点处均匀性大于0.5%的场， 必须利用复杂且因此昂贵的光学系统。
所以，利用激光源将带来花费这一主要缺陷，并且尤其是对于使用染 料或多带的紫外线(UV)激发束设备来说，成本更是难以承受，这意味着这 种设备的应用将仅限于较难的生物学分析领域中非常特殊的情况。
激光二极管比较廉价，并且它们具有能够提供高功率密度以及高空间 相干性的优点，但是可用波长与LED能够提供的波长相比更加受限。
关于该主题，例如从文献WO 00/57161中已知在流式细胞仪中使用具 有低空间相干性的这种源，如LED。
图1示出一般性地使用具有低空间相干性的源，如弧光灯或LED，的 设备。这种设备可以用于针对中央注入有用于分析的流体(例如，生物流体) 的测量容器CM中的光致发光进行测量。所建议的光学系统通常认为是落 射荧光(epifluorescence)模式设置。该设备包括用于产生激发光束的光源 S，以及用于拾取由光致发光所发射的光束的元件(例如，光检测器PD)，。
术语"激发光束"或"光"或"辐射"用于表示来自照亮待分析的流 体的光源的光。
术语"发射光束"或"光"或"辐射"用于表示激发光束和待分析的 流体中存在的微观对象之间的非弹性作用所产生的光，如由荧光或光致发 光所发射的光。
在这种落射荧光设备中，光源S所产生的激发光束以及光检测器PD所拾取的发射光束在同一轴上，沿着"系统"轴X传播，因此，可以使用同 一光学系统来发射和接收光。
该设备具有用于将激发和发射光束分隔开的二色性板(dichroicplate)DC。
优选地，该设备还具有两个滤波器F1和F2，分别用于针对来自光源S 的朝向测量容器CM发射的光以及由源S发射的激发光与测量容器CM中 存在的流体中的微观对象之间的非弹性作用所产生的荧光(可能是各种波长 的)进行滤波。
光学单元Ll和L3使得激发和发射光束在通过滤波器Fl和F2以及二 色性板DC时成为平行光束。具有较大的数值孔径的透镜或光学单元L2使 得激发光朿能够聚焦在以测量容器CM的测量点M为中心的小体积 (volume)上。
来自流体中的微观对象并通过由激发光束照亮的点M的荧光由透镜L2 聚焦为平行光束，通过板DC,由滤波器F2滤波，并在由透镜L3聚焦之后 由光检测器PD接收。
通常，相对于所使用的荧光所选择的中心波长的激发光束的功率较弱。 这相应地降低了现有技术设备的鉴别能力，因此它们的应用领域受到限制。 它们只能够检测到例如，与大量表位(epitope)或者在荧光中呈现高等级 效率的标记物相对应的高荧光性的信号。

发明内容
因此，本发明的主要目的在于提供一种用于测量光致发光以及用于测 量吸收和/或衍射的精确、灵敏、廉价的设备以减少现有技术设备的缺陷， 所述设备包括至少两个光学系统，每个光学系统包括呈现低空间相干性并 沿着"系统"轴向所述测量容器传输激发光束的光源，以及用于拾取(获取) 集中在所述系统轴上的光致发光的发射光束的拾取元件(或获取元件)，所述 光学系统同时操作并且定位为使得它们的轴围绕所述测量容器彼此之间形 成非180°的非零钝角，所述光致发光的测量通过将从所述拾取元件同时拾 取的发射光束所获取的数据耦合在一起而得出。根据本发明，所述光学系
统还以如下方式定位即在第一光学系统的源的激发光束与第二光学系统的拾取元件所拾取的发射光束之间存在至少一个部分重叠光束，并且所述
设备还配备有至少一个"消光(extinction)"拾取元件，其位于至少一个源 的附近并用于拾取部分重叠光束中的激发波长的光，吸收和/或衍射的测量 山所述消光拾取元件拾取的光中所获取的数据得出。
本发明特别建议增加光学系统的数目，每个光学系统使用低空间相干 性的光源，并且将接收到的发射光束耦合在一起。对于n个光学系统，这 使得测量点处的激发功率能够比使用单个系统时大n倍，并且使得接收到 的光致发光发射的功率比从单个系统接收到的大nM咅，因为其是在n个光 学系统上同时接收的。光致发光发射辐射的各向同性特性确保在将落射荧 光屮使用的光学系统增加n个时，设备的检测灵敏度基本上增加112倍。从 而，可使用呈现低相干性的光源而没有任何有害的灵敏度损失。
此外，假设通过来自同时操作的两个系统的两个激发光束激发测量体 积，并且荧光所发射的光是各向同性的，则荧光发射光束由两个光学系统 的两个拾取元件同时收集。由于两个系统都是落射荧光设置的，即发射和 接收发生在利用同一光学系统的公共的轴上，并且由于两个系统设置为两 者之间具有严格的钝角，所以由每个光学系统接收的荧光发射光束相对于 来自其它光学系统的激发光束存在角度偏移。
随后所接收的荧光发射光束由于直接的光照明而几乎未受到干扰，并 且由于使用了两个激发光束而不是如现有技术设备中那样仅使用单个激发 光束，所以荧光发射光束的强度也是二倍。
此外，由于两个光学系统在测量容器周围彼此之间形成钝角，重叠光 朿的重叠程度很小，其存在也保证了最大功率到达该容器，同时产生最小 量的干扰光。
本发明建议使用适于拾取来自重叠光束的光的消光拾取元件，该光呈 现出代表通过重叠光束的微观对象的吸收和/或衍射的强度变化。使用适当
的拾取元件能够量化该吸收。
在本发明的-个实施例中，该设备具有奇数个光学系统，其定位为使
得它们的轴围绕所述测量容器彼此之间成对地形成非180°的非零钝角。 根据具体特征，所述光学系统定位为使得它们的轴围绕测量容器形成
相等的角。优选地，光学系统的数目等于三。那么该设备包括位于所述测量容器 周闱的三个光学系统，它们的轴围绕所述测量容器彼此之间形成相等的角。
该具体特征用于限制测量容器周围的空间大小，同时使得每个拾取元 件从测量容器CM接收到的每个荧光发射光束的强度与使用单个光学系统 的激发相比，提高三倍。
此外，光学系统在测量容器周围120°处的位置以及需要具有重叠光束 嬰求所使用的激发和发射光束具有大的数值孔径。这提供了相应地增大用 于激发容器中的荧光的功率的优点。
此外，通过使用这种大数值孔径的光源，可获得非常均匀的光场。因 此，使用二个光学系统提供了积极的协作效果。
另外，使用三个光学系统提供了一种在光学系统之间的角度、可用的 光功率、重叠、光场均匀性、成本以及灵敏度方面的优选的配置。
然而，应该观察到，三光学系统配置的许多优点与重叠光束以及消光 拾取元件的存在与否无关。此外，这种配置能够完美地实现使用具有低空 间相干性的光源来测量荧光而不用测量消光，而与重叠光束的存在与否无 关。
在一种优选的实施中，发射光束拾取元件连接到公共的光检测器或一 组公共的光检测器。
这种实施使得能够将拾取元件同时接收到的荧光信号直接在公共的光 检测器内相加。然后，由于是使用单个光检测器获取的数据，所以该数据 被直接耦合。这种特征用于执行光信号的光学相加。光检测器通常对单个 波长敏感。因此，在仅预料到一个光致发光波长时使用单个光检测器将更 适合，其中单个光致发光波长通常对应于单个激发波长。
相反，针对拾取元件使用一组光检测器能够检测到多个光致发光波长。 因此，当预料到多个光致发光波长时这更加合适，其中多个光致发光波长 通常对应于多个波长的激发。例如，这对应于三个光学系统不一定都发射 相同波长的光的配置。
在两种配置中，光检测器执行光信号的光学相加。
优选地，光检测器连接到数据处理器装置，其中所述数据处理器装置 适于由所述光检测器接收的数据得出所述光致发光的测量。在实施例中，消光拾取元件连接到光检测器，光检测器本身连接到数 据处理器装置，所述数据处理器装置适于由所述光检测器接收的数据得出 吸收和/或衍射的测量。
根据本发明的具体特征，发射光束拾取元件和/或消光拾取元件是圆形 或矩形截面的光纤。
根据本发明的另一个具体特征，光源包括具有低空间相干性的LED， K耦合到用于使得激发光束均匀的光学元件。
优选地，所述光学元件是光导管(light conductor),例如，光纤。
在本发明的实施例中，所述测量容器在光学系统放置的平面上是多面 体截面的，所述多面体的面垂直于光学系统的轴。
当使用以规则角度围绕容器放置的三个光学系统时，容器呈现等边三 角形形式的截面。
在另一实施例中，测量容器是圆柱形的。
优选地，每个光学系统包括像差校正装置，用于校正由于测量容器的 几何形状而在各个光束中引入的像差。
在本发明的特别有利的应用中，所述流体是生物流体。
在该应用中，本发明的设备可以用于检测已经标记了荧光的生物元素 并对其进行计数。特别是在流式细胞仪领域中有多种应用，更具体地用于 外周血样本或者骨髓或者任何其它生物流体中生物细胞的鉴别和计数。
本发明还提供了一种对测量容器中存在的流体中的光致发光、吸收和/ 或衍射进行测量的方法，其特征在于所述测量容器中的流体同时接收来自 两个光学系统的至少两个激发光束，每个光学系统具有沿着"系统"轴向 所述测量容器发送所述激发光束的低空间相干性的光源，以及用于接收集 中在所述系统轴上并来自所述流体的光致发光的发射光束的拾取元件，所 述光学系统定位为使得它们的轴围绕所述测量容器彼此之间形成非180° 的非零钝角，所述光致发光的测量通过将从所述拾取元件同时拾取的发射 光束所获取的数据耦合在一起而得出。根据本发明，所述光学系统定位为 使得在来自第一光学系统的源的激发光束与由至少一个第二光学系统的拾 取元件所拾取的发射光束之间存在部分重叠光束，并且位于至少一个源附 近的至少一个消光拾取元件拾取部分重叠光束中的至少一个激发光波长，吸收和/或衍射的测量由所述消光拾取元件拾取的光中所获取的数据得出。


本发明的其它特性和优点将从下面参考附图所做的描述中变得显而易 见，其中附图示出了没有限制性特征的实施例。附图中-图1示出现有技术中已知的光致发光测量设备； 图2是示出本发明的光致发光设备的原理的视图3示出在图2中所示的设备的测量容器中沿着水平方向的光束的强 度llll线；
图4示出在图2中所示的设备中使用的滤波器和二色性板的光谱特性 的实例；
图5示出噻唑(thiazol)染料以实线表示的吸收光谱和以虚线表示的荧 光中的发射光谱；
图6所示为本发明的光致发光测量设备所分析的体积的三维视图7是本发明的光致发光测量设备的第一实施例的透视图8示出用于校正由于测量容器的形状造成的像差的装置；
图9示出作为玻璃/空气界面处入射角的函数的发射光束的透射系数；
图10是用于测量多个光致发光值的本发明设备的第二实施例的透视
阁；
图IIA、图IIB和图IIC示出消光拾取元件在本发明的设备中的多个 位置；
图12A和图12B分别示出三角形容器和透视图中的重叠光束； 图13是示出根据本发明的吸收和衍射测量的原理的视图； 图14示出在用作消光拾取元件的光纤的出口处观察到的结果； 图15示出染料藻红蛋白花青5 (dye phycoerthyrine cyanine 5)以实线 表示的吸收光谱和以虚线表示的荧光中的发射光谱；以及
图16是其上绘制有使用如图2中所示的设备所测量的网状细胞群 (population)的特性的视图。
具体实施方式
图2是本发明的光致发光测量设备在圆柱形测量容器CM中的图。该 设备包括三个类似的光学系统Ca、 Cb和Cc，每个系统分别以轴Xa、 Xb 和Xc为屮心。这些轴Xa、 Xb和Xc彼此之间形成不是180°的非零角。 在图2屮所示的优选实施例中，光学系统Ca、 Cb和Cc规则地分布在测量 容器CM周围，因此这些角相等且等于120° 。这是己知为落射荧光设置的 光学系统，其中同一光学系统既用于发射光也用于接收光。在这种设置中， 朝向测量容器发射的光的轴与从测量容器接收到的光的轴相一致。
给定了所使用的光学系统Ci(其中i=a、 b或c)之间的相似性，为方便起 见，在卜lf的描述中下标i-a、 b或c仅在使用它们对于理解来说是必需时 才指明。在图中，只有示出设备原理的图2的视图具有所有带下标的标记。
每个光学系统Ci具有源Si和拾取元件CEi，源Si用于向测量容器CM 发射用实线表示的激发光束，拾取元件CEi用于拾取与沿着轴Xi的激发光 束相同的轴上的、以虚线部分表示的由荧光发射的光束。
在实施例中，以几乎没有空间相干性的明亮的LED作为源Si是有利的， 特别是由于其比较廉价。
己知明亮的LED构造为集成电路，其表面上包括由于存在用于向半导 体结供电的电触点而不均匀的区。因此所产生的光束是不均匀的，并且将 二极管的图像投影到测量体积中并不能实现检査情况下微观对象之间的精 确辨别。
因此，并且尤其是在生物学分析领域，无法获得使用这种普通均匀性 的激发光束给出正确结果的血液分析仪。
所以，如图2中所示，LEDSi最好与各自的光学元件EOi耦合，该光 学元件EOi具有使激发光的场均匀的功能。光学元件EOi最好是光导管， 例如光纤，或者诸如非成像光束转换器的特定光学元件。例如，可使用具 有阶跃折射率或渐变折射率的具有圆形或矩形截面的光纤。
为了将光源Si与光学元件EOi耦合，包含二极管的集成电路的发射区 可以放置在光导管光学元件EOi的入口面。这种耦合是廉价且易实现的。 由于集成电路的温度可以达到高于100。C的值，所以最好使用能够耐受这种 温度的材料，例如硅。
或者，可以通过将诸如由硅或人造红宝石制成的玻璃微珠透镜的特定光学系统插入到光导管EO与集成电路之间来使用由塑料材料制成的光导
符EO。还应该观察到，例如通过将集成电路放置在微珠透镜的焦平面上， 该微珠透镜可进一步提高激发光场的均匀性。在这种情况下，光导管EO由 平行光束照亮，光源的每个点都发射耦合到光纤中的波。
离开光导管EO的激发光束的发散由其数值孔径给定，对于光纤来说， U:是光导部分及其周围的包覆层之间的折射率差的函数。
例如，光导管EO可以是直径为940微米Oim)、光学孔径为0.22的硅 光纤。在测量容器CM中的总功率为4.5毫瓦(mW)的情况下，耦合到每个 光纤的功率为1.5 mW。光纤放置为与馈入2000毫安(mA)的(金龙 型)OSRAM商标的LED相接触。
在该实例中，提供给集成电路的功率可能会超过制造商指定的数据， 闪此最好提供用于冷却该结的装置，尤其是在连续照明模式下使用激发光 束吋。例如，在本发明的设备中可以实施由低热阻的散热器以及与其相邻 的珀耳帖(Peltier)效应元件构成的冷却电路。
对于等同的光度预算，当光源在脉冲条件下使用并且脉冲由诸如消光 信号或使用库尔特(Coulter)效应的已知类型的电阻抗变换器的辅助装置 触发吋，口J以避免进行冷却。
随后沿着测量容器CM中的流体的流动方向，在本发明的光致发光测 量设备的上游执行消光或电测量，例如测量电阻或阻抗。在图2中，该流 动方向垂直于图面。通过这种方式，当发射光束的模数转换器(ADC)由阻抗 咽测量触发时，激发光束的触发最好延迟所检测的微观对象从阻抗传感器 到测量点M处的光学测量点所花费的时间。
该吋间是己知的，因为它是由两个测量点之间的距离除以流体流的速 度v的比值所给出的，速度v由于是受控的所以该速度本身是已知的。流 体的运动本身由液压系统驱动，其中该液压系统附加于设置之上，并且包 括步进电机或气动致动器(图中未图示)。
在每个光学系统Ci中，准直器Lli使得来自光导管EOi的激发光束平 行。随后激发光束最好由滤波器元件Fli滤波，该滤波器元件Fli是由待检 测的荧光分量的吸收光谱或光谱所限定的带通滤波器。
随后已滤波的光束施加到二色性滤波器DCi，该二色性滤波器DCi是卨通滤波器，其能够将激发光束朝向测量容器CM反射并将来自测量容器
CM的荧光中发射的光束沿着落射荧光设置的轴经由滤波器F2i和传感器元 件CEi透射到光检测器PD。随后光学系统L2i将光纤EOi的出口面成像到 测最容器CM中。
图3示出测量容器CM中获得的、以点M为中心的光场在水平方向上 的强度IL的归一化曲线。可以在点M的宽度上看到良好的空间均匀性，在 该实例中，该宽度为300 pm。这具体是由于使用了大数值孔径的激发光束
图4示出了在对利用橙色噻唑染料或具有相同光谱特性的任何其它染 料进行了着色的微观对象进行测量的应用中，滤波器Fl和F2以及二色性 板DC的光谱特性的实例，其中特别地将增益G描绘为波长的函数。在本 发明的主要应用之一，例如，对网织细胞进行分类计数(differential counting) 中，所使用的这种染料具有图5中以实线表示的吸收特性和以虚线表示的 荧光特性。利用本发明还可检测具有核子或其它生物元素的细胞。如图5 屮曲线所不，在以488纳米(nm)为中心的窄带上进行激发，并在以530 nm 为中心、宽度为30nm的带上测量荧光。
因此，在图4中，滤波器Fl位于激发波长为470nm、宽度为15nm的 中心，滤波器F2位于荧光发射波长为540 nm、宽度为20nm的中心。滤波 器F2具有单个通道。然而，当需要测量多个荧光时，优选地使用多通道滤 波器。二色性滤波器DC具有非常陡的上升沿，在大约10 nm内从最小传 输上升到最大传输。这是用于使荧光发射波长通过同时反射激发波长的高 通滤波器。这种滤波器可以从例如OMEGA和SEMROCK的供应商处购得。
此外，应该理解，发送到测量容器CM中的光功率越大，荧光现象越 强。因此由光学单元Ll和L2构成的光学组件的放大倍率Gr是决定该功率 的参数。
禾U用矩形截面(aXb)的光导管EO，投射到计数室中的图像大小为(a/Gr) X(b/Gr)。将单个光导管中的光功率记为P，那么光导管EO的出口面处的 功率强度为P/(aXb)。
在该图像中，对激发光束聚焦将产生等于(GifP/(aXb)的功率强度，即， 该功率强度是光导管EO出口面处的(Grf倍。因此，放大倍率Gr最好尽可能地大，并且光学单元L2最好具有较大 的数值孔径。
利用图2的设备，基于使用彼此以120。放置的三个光学系统，领懂体 积的每个微观对象接收三个激发光束，从而得益于其荧光的三次激发。
考虑单个激发束的测量体积的激发，假定荧光是各向同性的，则荧光 发射光束由三个光学单元L2a、 L2b和L2c收集。在每个光学系统Ci中， 发射光朿随后透射通过二色性板DCi，并且随后通过滤波器F2i进行滤波。 随后，发射光束由光学单元L3i聚焦到拾取元件CEi上。
拾取元件CEa、 CEb和CEc优选为光导管，例如光纤，每个光导管的 -端放置在透镜L3a、 L3b或L3c中一个透镜的焦点处，另一端指向单个光 检测器PD的敏感面，该光检测器可以是光电倍增管、简单的光电二极管或 者雪崩效应光电二极管。
光检测器PD同时接收到来自三个拾取元件CEa、 CEb和CEc中每一 个的发射光束，并将三个光纤CEa、 CEb和CEc所拾取的光能相加。
由于本发明的设备提供了三个同时的激发光束，所以同样的推导可以 应用于每个激发光束。最后，与图1中所示类型的现有技术设置相比，灵 敏度的提卨达到(32)=9。
因此该组件所收集的光的量大于单独使用每个系统所收集的光的量的 总和，并且对于根据本发明的原理使用两个光学系统的情况，这也同样适 用。
此外，在本发明的所有设备中，由于落射荧光设置呈现非180°的非零 钝角，所以图2的设备中的激发光束彼此之间有所偏移。这种配置避免了 激发和发射光束完全重叠，从而使得现场的背景光最小，其中该背景光构 成丫光检测器PD处噪声的主要来源。
假定考虑使用正方形截面的容器，其中使用四个光学系统、每个光学 系统在测量容器一侧互相面对的情况，将具有四个相对的面用于对待分析 的微观对象进行照明，并因此激发荧光。然而，这种配置并不理想，因为 在激发和发射光束之间会存在100%的重叠，并且直接后果是杂光(parasitic light)的水平大于本发明的设备。这种杂光造成了DC分量Ib和变量(j、2 qlt3的随机光电噪声，其中q是电子电荷，B是接收器电路的通带。应该观察到，Ib越小，测量设备识别的越多。由于激发光束未重叠或仅 仅部分重叠，所以在本发明的设备中Ib将最小化。
优选地，图2的设备还具有空间滤波器D，例如简单针孔，将其放置
在拾取元件CE的前方。这种滤波的作用在于消除某些不想要的信号，诸如 测量容器CM壁上的杂散反射。因此这将有助于减小分量Ib，从而提高信噪比。
这种空间滤波的另一个作用在于降低M中的测量体积v，该体积由激 发光朿的交点限定。图6示出了对于圆形光导管OE的这种测量体积v。体 积v对应于按照图2中所示的原理彼此以120°放置的三个激发光束的所有交点。
图7是示出本发明的第一实施例的透视图，其中使用三角形的测量容 器CM。测量容器CM的面垂直于彼此成120°角的光学系统Ca、 Cd和Cc 的轴Xa、 Xb和Xc。
在每个系统Ci中，二色性板DC在激发和发射光束的交点处以45。角 放覽，并且其具有如图4中所示的光谱传输特性。
图7中所示的实施例适于检测单个荧光波长并对其计数，并且其根据 本发明的原理使用三个光学系统Ca、 Cb和Cc。该设备可以具体用于检测 外周总血量的样品中的网织细胞并对其进行计数。在该图中，微观对象在 光学系统的照明平面中的通过由穿过测量容器CM的、形成一条线的连续 珠子来表不。
在该实施例中，三个发射光束由三个拾取元件CEa、 CEb禾BCEc拾取， 该拾取元件由指向单个光检测器PD的光导管构成。每个发射光束通过使用 二色性板PC和干涉滤波器(未图示)进行光谱滤波，其中所述干涉滤波器优 选位于二色性板DC与光学单元L3之间。
在'种变型中，通过位于拾取元件CEa、 CEb和CEc的三个出口与光 敏检测器PD之间的干涉滤波器来执行光谱滤波。
在测量容器是矩形的实施例中，每个光学系统Ca、 Cb和Cc最好包括 用于对测量容器CM的每个面所构成的厚的表面所引入的光学像差进行校 正的装置。因此，光学单元L2最好需要校正首先与光束的大的数值孔径相 关联、其次与通过厚的表面相关联的几何像差，其中该孔径可大于0.6，该厚的表面具体是测量容器CM的表面，以及通过直到到达测量点M的流体
的厚度。
已知称作几何像差的各种类型的像差是造成测量点M处功率密度降^氐 的原因。在这些情况下，球差是需要校正的主要像差。由于测量容器CM 的形状是不变的，所以可以实施本领域技术人员已知应用中的各种解决方
案来校止球差。
图8示出了包括一组具有适当曲率和折射率的透镜的校正的一个实例，
it:屮两个连续透镜之间的间距也是可以变化的尺寸参数。 .
在图8屮，该校正是针对等边三角形的测量容器CM进行的。其包括 三个平面的组合，例如，由2.5mm的玻璃壁以及1.5mm的二氧化硅组成。
因此，在图7中所示的实例中，光学单元L1是一个消色差双合透镜， 其能够使488 nm处的色差最小，光学单元L2由一组四个包含接触双合透 镜(touching doublet)的透镜构成，该接触光合透镜包括图8的表面。最后， 光学单元L3是平凸透镜。
应该观察到，非球面透镜也可用于校正类似的像差或其它类型的像差。
所述的透镜对由经过由容器的玻璃壁和水的厚度所构成的厚的表面所 引入的几何像差和色差进行校正，其中水在测量容器CM的壁和通过点M 的微观对象，例如细胞之间延伸。
随后激发光束通过空气/玻璃第一界面，紧接着通过玻璃/水第二界面， 其将光量减小了等于需要考虑的界面处的菲涅耳(Fresnel)透射的因子。
多电介质处理可以用于将需要考虑的界面处的光的反射最小化。图9 小出了作为材料-空气界面上的入射角的函数的发射光束的透射系数，其作 为波长488 mn处的折射率为n=1.46的材料的入射角的函数。
可以看出，全内反射现象限制了发射光束的数值孔径。如果测量容器 的透明壁的折射率记为n，则反射角将几何角限定为值e，使得sine-l/n。 冈此可以看出，使用圆柱形或球形的测量容器，如图2中所图示的，可以 限制由测量容器CM的几何形状引入的像差。
还应该观察到，可以通过不仅校正几何像差，而且校正与激发光谱带 宽相关联的色差来最优化由光学单元Ll和L2构成的光学组件。
此外，由光学单元L2和L3构成的光学组件可以通过校正如下的色差来设优化，其中该色差首先与荧光集中于朝向更长波长偏移的波长的事实 相关，其次与该荧光的检测发生在有限宽度的光谱带上的事实相关。
因此，例如通过将三个基本波长0.460 pm(蓝色)、0.500 pm(绿色)禾口 0.600 ^uii(红色)在轴上和场边计算的像差限制为小于士20 pm来最优化激发 fl I发射光束的光学特性是有用的。
在图7的设备中，荧光发射光束由三个拾取元件CEa、 CEb和CEc收 柒，这三个光学拾取元件是一起构成耦合到光电检测器PD的单个光束的光 3行，其巾该光电检测器PD可以是光电倍增管或是雪崩光电二极管。
光检测器PD将从三个光纤拾取的光能相加。随后基于本领域技术人员
的知识对荧光进行计算，特别是在预先校准该设备之后。从而，得到测量 休积v中产生的荧光的测量。
图IO是适于对测量容器CM中的流体中的多个荧光波长进行测量的本 发明的设备的第二实施例的透视图。
测量容器CM中存在的微观对象再次由来自三个系统Ca、 Cb和Cc的 源Si的三个激发光朿来照亮，该激发光束通过可选的光学光谱滤波器(未图 小-)和二色性分离器板DC进行滤波。在每个光学系统Ci中，二色性板DCi 将来自Si的光向测量容器CM反射，L2i将所述光会聚到测量容器CM中。 相反的，—色性板DCi透射来自被照亮的微观对象的更长波长以使得其朝 向拾取元件CEa、 CEb和CEc传播，这些元件优选地是诸如光纤的光导管。
这二个拾取元件CEa、 CEb和CEc依次组合在例如由衍射光栅DG和 n个光检测器PD1至PDn构成的公共的光谱仪检测器单元上。所述n个光 检测器相对于光栅DG进行空间定位，使得它们中的每个能够拾取并测量 波K:的带，每个带对应于通过容器CM的生物元素所发射的荧光的目标波 长中的一个。这些光检测器PD1至PDn可以是选自例如排列成行或带的光 电二极管、可选的雪崩效应光电二极管、例如形成为矩阵或行的光电倍增 管、电荷耦合器件(CCD)型的多个光学传感器的检测器。
随后对于多个不同的波长带获得不同的荧光强度。不同波长处荧光的 存在是由于所检测的对象之间的差异或者由于存在用于发射的多个波长， 所述多个增大了多个不同波长处的荧光。
这种特定光谱检测组件的一个优点在于它能够适用于不同波长的荧光，并且该设备可以容易地用于检测具有不同特性的对象而不用修改该设 各。此外，每个光检测器的位置对目标波长和检测带的宽度都有影响。
在--个变型中，这三个拾取元件CEa、 CEb和CEc组合在例如由隔离 器板，二色性板所构成的单个检测组件上，其中所述二色性板共享多个光 检测器PD1至PDn之间的光束。
在进行测量之前，发射光束可以利用适用于所使用的荧光的干涉滤波 器进行滤波。
在本发明的优选实施例中，至少一个光学系统，例如图2中的Ca，包 括所谓的"消光"拾取元件DT，其放置为接近所讨论的系统Ca的源，该 实例屮为Sa。该消光拾取元件DT用于拾取与源Sa的波长具有相同特性的 光。该光由二色性板DC从容器CM反射到源Sa。消光拾取元件DT耦合 到光检测器PDT。
图11示出了消光拾取元件DTa接近源Sa的一些可能的位置，这是通 过选择能够保证源Sa所产生的光束均匀的光学元件EOa来确定的。
这种消光拾取元件DT用于观察激发和发射光束，也称为重叠光束，的父点。
从几何上来说，这些交点基于光学单元L2i的光瞳对应于并指向测量室 CM的中心的六个锥体的交点这些重叠光束或体积FC如图12中所示。 如果透镜L2的数值孔径足够大时，存在这些情况。
图12A是测量容器CM的水平截面，其上标记有三个光学系统Ca、 Cb 和Cc的轴Xa、 Xb和Xc。由系统Ca接收的、分别与光学系统Cb和Cc 的激发光束的激发相对应的重叠光束标记为FCK和FCca。该标记方法也用 于系统Cb和Cc所接收的其它重叠光束。
图12B给出了这些相同的重叠光束的三维视图。
这种重叠光束的存在有利于对测量容器中存在的微观对象所产生的吸 收和衍射进行测量。消光拾取元件DT用于拾取这些光束的光。
在图11A中，光学元件EOa的截面是矩形，并且内接在正方形内，其 'l'该正方形的顶部部分用于放置多个用于接收表示吸收的信号的消光拾取 元件DTa'和用于接收表示衍射的消光拾取元件DTa〃。使用放置在源Sa的 任一侧上的两个矩形消光拾取元件DTa'可以拾取来自重叠光束的光，因为光朿的几何形状使得它们可以位于激发光束的任一侧上。使用中间的消光
拾取元件DTa〃用于拾取任何衍射光。在该实例中，应该观察到，其它光学 元件EOb和EOc的截面优选也是是正方形的。
图IIB和图llC示出单个圆形截面的拾取元件DTa相对于由光学元件 EOa的截面表示的源Sa的另外两个位置。
图13图示了在如图7中所示的光致发光测量设备中进行吸收和/或衍射 测;il:的^理。为了说明目的，假定测量容器CM由来自光学系统Cb和Cc 的两个激发光朿照亮。
来自源Sb和Sc的激发光束的孔径使得重叠光束FCba和FCCa与系统 Ca的发射光束一起存在。
山系统Ca(未图示)拾取的荧光波长的发射光束通过板DCa而不发生偏 转，而从源Sb和Sc接收到的构成重叠光束的光由二色性板DCa偏转。在 阁13中，只显示了与源Sb和Sc具有相同波长的重叠光束FCK和FCca。 它们来自测量容器CM并经由二色性板DCa朝向消光拾取元件DTa行进。 消光拾取元件DTa最好是圆形截面的光纤。
实际上，存在两种与源Sb和Sc具有相同波长的光束到达消光拾取元 件DTa:形成重叠光束FCba或FCCa—部分的那些，以及未形成重叠光束
FCba或FCCa—部分的那些。
不属于任何重叠光束FCa的那些光束只包括已经在测量容器CM中衍
射并表示测量容器CM内的衍射的光线RD。因此光线RD不属于重叠光束
i''Cbjn FCX所界定的扇形角，除非微观对象已经对测量容器CM中的激发
光进行了衍射。
属于FCa的那些光束，例如源Sa的FCca包括来自源Sb、 Sc或者甚至 是Sa(如果其在工作的话)中的一个的衍射光线，并且包括来自源Sc的重叠 光束经过测量容器CM而未偏转或吸收之后的光线。
因此，重叠光束的光线既部分表现出衍射也表现出吸收，因为由于吸 收微观对象所引起的消光在由重叠光束所限定的扇形角中是可见的。
本发明的优点之一在于有可能看到并利用重叠光束FC以及在重叠光 束FC界定的扇形角中衍射的光线RD。
根据本发明特别具有优势的特征，光纤，优选地是圆形截面的光纤，川于实施为消光拾取元件DTa，当只有一个这样的元件时。这种光纤的光 学特性用于利用进入光纤的光线的不同进入角，该光线形成重叠光束FCba 或FCCa的一部分或未形成其一部分。如图13中所示，重叠光束FCh和FCca 的光线以相对于光纤的轴的一角度进入光纤，其中该角度大于重叠光束所 界定的扇形角中的衍射光线RD的角度。该角度特性在整个光纤上均存在， l到为重叠光束的光线沿着光纤弯曲但是仍保持接近阶跃折射率线或折射率 梯度线，而其它以相对于光纤的轴来说较小的角度进入的衍射光线可以分 布在光纤的整个截面上。
因此，如图14的光纤截面中所示，通过将光纤DTa的出口发射到多元 件光检测器PDT上，其中每个元件与光纤DTa的截面的特定部分有关，可 以看出光纤DTa的轮廓CNT是连续明亮的，并且在微观对象通过时发生消 光，该消光是由于对象的吸收造成的。随后在轮廓CNT上观察到的光表示 吸收并且部分表示衍射，其中在重叠光束的扇形角中衍射不会为零。
还可以看出，光纤DTa的中心CTR只有在微观对象通过时才变得明亮， 发明由所述对象衍射的光。假设衍射是各向同性的，可以通过将光检测器 PDT连接到处理器装置以减小在光纤的轮廓中观察到的光的强度，以便获 得对于吸收的值。
在使用例如图IIA的配置的多个消光拾取元件时，拾取元件DTa'所传 输的光的存在和强度决定了与吸收有关的测量，并且拾取DTa"所传输的光 的存在和强度决定了与衍射有关的测量。
这种对重叠光束的使用对于区分与其吸收和/或衍射特性有关的生物细 胞来说非常有利。特别是，这种消光测量可以用于细胞学目的，在细胞学 中它们可以被解释为形态学或化学信息。
为了对衍射各向同性实现更好的控制，最好使用化学试剂使细胞尽可 能地成球形。
本发明的设备的上述实例使得当通过测量容器CM的每个微观对象， 例如生物对象，接收到三个具有相同波长的光束并且使用落射荧光设置来 测量荧光发射的光时，能够从敏感性细胞中测量到光的发射，所述三个落 射荧光组合在用于需要考虑每个荧光波长的单个光检测器上。
接下来描述通过执行本发明的光致发光测量来区分生物元素并对其进行计数的方法，所述生物元素具体而言是利用抗体或其它荧光化合物标记 的元素。
如上所述，生物元素的分类鉴别和计数一般在流式细胞仪中进行。为 此，血液样本与待鉴别的生物元素专用的抗体一起培养。这些抗体与标记 物(通常是荧光)结合在一起。通常选择荧光来特定地鉴别每个抗体，因此测 「ft荧光对应于鉴别其所结合的抗体。因此，可通过测量相应数目的不同波 长来鉴别多个不同抗体。
在图10中所示的设备中，可测量多个不同波长。因此可至少测量与波
长数目相同的特定标记物或抗体。
这些原理可以用于大量应用中。接下来描述适用于任意流式细胞仪标 记的一般性原理。
如上所述，图5的光谱对应于噻唑橙色。其还可以应用于普遍与抗体 打i ^使川的异硫氰酸荧光素(FITC)染料。
图15涉及另一种染料，藻红蛋白花青5串联，其也普遍用于流式细胞 仪中。这两种染料可以用于在所述设备中鉴别至少两张不同的抗体。
为了利用如图7或图IO中所示的设备来分析生物元素，应该执行下面
的步骤
将全血的一部分，例如50立方毫米(mm3)，与专用于目标生物元素 的组合抗体混合；
将该溶液避光培养充足的时间，例如20分钟，该时间能够使生物元 素完全标记并用于将细胞间质染色；
■将所得到的生物元素的溶液以如下方式注入测量容器CM:即生物元 素一个接一个连续地通过容器CM的中心M，以便与照亮所述区域的光相 互作用。优选地，将容器CM设置为可使用专利FR 2 653 885中所述的阻 抗测量方法，依次对通过其中的所有元素的体积进行测量；以及
对通过容器CM的每个生物元素进行连续测量，以通过阻抗测量确定 其体积，并测量其荧光。
根据所使用的设备和所使用的标记物，可以以单个波长或多个波长来 执行测量。
已经执行上述步骤来使用图7的设备区分了网织细胞并对其进行了计数。网织细胞是红血球或红细胞的早期状态。它们的特征在于由RNA构成
的网织组织的胞浆内存在。这些痕量物(trace)是所排出的核子在骨髓内 从冇核红细胞阶段到网织细胞阶段的残余。在这种排出之后大约24小时， 网织细胞从骨髓进入血液。在外周血液中，它们的存在不超过48小时，核 糖体降解，以将网织细胞转换为成熟的有核红细胞。
红血球的平均生命周期是120天，因此正常的再生率为0.83%。通常接 受的正常平均百分比在0.5%至1」1.5%的范围内，这些值在小于3周的婴儿中 较卨(在2%到6%的范围内)。因此，对网织细胞进行观察并计数可提供与有 核红细胞活动有关的指示，从而构成特别用于以下方面的参数监控化疗 之后的骨髓恢复、监控重组细胞红细胞生成素蛋白质(rHuEpo)的治疗、贫血 的研究预算、或者寻找代偿性出血或溶血。
"']测量网织细胞的荧光时，具体如专利FR 2 759 166中所述的，使用 》冇噻唑橙色的试剂来执行稀释全血样本的步骤。
将荧光和体积测量的结果进行重构并优选进行排列以提供需要考虑的 牛物元素的绝对和分类计数。
然后可以基于细胞内RNA的荧光来提取红血球的数目和网织细胞的数 1〗和百分数。
还可以基于与其荧光相关的元素的分布来计算未成熟网织红细胞指数 (1RF)。大多数荧光元素被认为是最年轻的。
图16绘制出使用本发明获得的结果网织细胞的群体分布在图上作为 通过阻抗测量所测量的细胞体积VC(以]Lm^为单位)的函数并将其沿横坐标 绘制，以及在纵坐标上绘制的以皮瓦(pW)为单位的荧光信号的强度IF。
在本发明的原理下，各种变型和实施对于本领域技术人员来说是显而 M见的。
尽管上面以具有三个光学系统的特别有利的配置描述了本发明，但是 几可以利用各种数目的光学系统来实现，从数目二开始并且成对偏移的角 度不为零且不同于180。。尤其是，利用本发明的这种特性，可以利用如上 所述以及所要求保护的重叠光束。除了所测量的荧光特性，这种特性对区 分不同的微观对象也是非常有用的。
当光学系统的数目超过三时，发现至少两个光学系统必须成非钝角，然而本发明要求至少一对光学系统彼此成钝角，与其它光学系统无关。为 f观察重叠光束并因此根据本发明执行吸收和/或衍射测量，这种特性尤其必须。
在某些特定应用中，还可以设想改变源Sa、 Sb和Sc的波长。因此， "J以利用具有两个或更多波长范围的激发光束，或者利用不同波长的激发 光朵，来照亮通过测量容器CM的微观对象，并单独测量所产生的落射荧光。
还可以设想将拾取元件CEa、 CEb和CEc分隔幵以使得它们能够成对 组合或者每个单独连接到匹配的光检测器。此外，还可以在本发明的设备 屮使用各种其它的光检测装置。
权利要求
1、一种用于对测量容器(CM)中存在的流体中的光致发光、吸收和/或衍射进行测量的设备，所述设备包括至少两个光学系统(Ci，i＝a，b，c)，每个光学系统包括光源(Si)以及拾取元件(CEi)，所述光源(Si)呈现低空间相干性并沿着“系统”轴(Xi)向所述测量容器(CM)传输激发光束，所述拾取元件(CEi)用于拾取集中在所述系统轴(Xi)上的光致发光的发射光束，所述光学系统(Ci)同时操作并且定位为使得它们的轴(Xi)围绕所述测量容器(CM)彼此之间形成非180°的非零钝角，所述光致发光的测量通过将从所述拾取元件(CEi)同时拾取的发射光束所获取的数据耦合在一起而得出，所述光学系统(Ci)还以使得在第一光学系统(Cb)的源(Sb)的激发光束与第二光学系统(Ca)的拾取元件(CEa)所拾取的发射光束之间存在至少一个部分重叠光束(FCba)的方式定位，并且所述设备还配备有至少一个消光拾取元件(DTa)，其位于至少一个源(Sa)附近并用于拾取所述部分重叠光束(FCba)中的激发波长的光，吸收和/或衍射的测量是从通过从所述消光拾取元件(DTa)拾取的光中所获取的数据得出。
2、 根据权利要求1所述的设备，其特征在于，其具有奇数个光学系统 (Ci)，所述奇数个光学系统定位为使得它们的轴(Xi)围绕所述测量容器(CM) 彼此之间成对地形成非180°的非零钝角。
3、 根据权利要求2所述的设备，其特征在于，所述光学系统(Ci)定位 为使得它们的轴(Xi)围绕所述测量容器(CM)彼此之间形成相等的角。
4、 根据权利要求2或3所述的设备，其特征在于，其具有定位于所述 测量容器(CM)周围的三个光学系统(Ci)，它们的轴(Xi)围绕所述测量容器 (CM)彼此之间形成相等的角。
5、 根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，所述发射光束拾 取元件(CEi)连接到公共的光检测器(PD)或一组公共的光检测器(PDl ， PDn)。
6、 根据权利要求5所述的设备，其特征在于，所述光检测器(PD)连接 到数据处理器装置，其中所述数据处理器装置适于从所述光检测器(PD)接 收的数据得出所述光致发光的测量。
7、 根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，所述消光拾取元 件(DTa)连接到光检测器(PDT)，所述光检测器(PDT)连接到数据处理器装 赏，所述数据处理器装置适于从所述光检测器(PDT)接收的数据得出吸收和 /或衍射的测量。
8、 根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，所述发射光束拾 取元件(CEi)和/或消光光束拾取元件(DT)是具有圆形或矩形截面的光纤。
9、 根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，所述光源(Si)包 括耦合到用于使激发光束均匀的光学元件(EOi)的具有低空间相干性的 LED。
10、 根据权利要求9所述的设备，其特征在于，所述光学元件(EOi)是光导管。
11 、根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，所述测量容器(CM) .在放置所述光学系统(Ci)的平面上是多面体截面的，所述多面体的面垂直于 所述光学系统(Ci)的轴。
12、 根据权利要求1至10中任一项所述的设备，其特征在于，所述测 量容器(CM)是圆柱形的。
13、 根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，每个光学系统(Ci) 包括像差校正装置，所述像差校正装置用于校正由所述测量容器(CM)的几 何形状在各个光束中引入的像差。
14、 根据任一前述权利要求所述的设备，其特征在于，所述流体是生物流体。
15、 一种对测量容器中存在的流体中的光致发光、吸收和/或衍射进行 测量的方法，其中所述测量容器中的所述流体同时接收来自两个光学系统 的至少两个激发光束，每个光学系统具有低空间相干性的光源以及拾取元 件，所述光源沿着"系统"轴向所述测量容器发送所述激发光束，所述拾 取元件用于接收集中在所述系统轴上并来自所述流体的光致发光的发射光 束，所述光学系统定位为使得它们的轴围绕所述测量容器彼此之间形成非 180°的非零钝角，所述光致发光的测量通过将从所述拾取元件同时拾取的 发射光束所获取的数据耦合在一起而得出，在所述方法中，所述光学系统 以使得在来自第一光学系统的源的激发光束与由至少一个第二光学系统的 拾取元件拾取的发射光束之间存在部分重叠光束的方式定位，并且位于至 少一个源附近的至少一个消光拾取元件拾取部分重叠光束中的至少一个激 发光波长，并且吸收和/或衍射的测量从通过从所述消光拾取元件拾取的光'l:'所获取的数据得出。
全文摘要
本发明涉及一种用于测量测量容器(CM)中存在的流体中的光致发光的设备和方法。根据本发明，测量容器(CM)中的流体同时接收来自两个光学系统(Ci)的至少两个激发光束。所述光学系统(Ci)定位为使得它们的轴(Xi)围绕测量容器(CM)彼此之间形成非180°的非零钝角。根据本发明，光致发光的测量通过将从拾取元件(CEi)同时拾取的发射光束所获取的数据耦合在一起而得出。光学系统(Ci)还定位为使得在来自第一光学系统(Cb)的源(Sb)的激发光束与第二光学系统(Ca)的拾取元件(CEa)所拾取的发射光束之间存在至少一个部分重叠光束(FCb_a)。该设备还配备有至少一个消光拾取元件(DTa)，其位于至少一个源(Sa)的附近并用于拾取部分重叠光束(FCb_a)中的激发波长的光，吸收和/或衍射的测量由消光拾取元件(DTa)拾取的所述光中所获取的数据得出。
文档编号G01N15/14GK101421605SQ200780012813
公开日2009年4月29日 申请日期2007年3月2日 优先权日2006年3月6日
发明者B·梅谢, D·勒菲弗, J-P·吉内斯, P·尼林 申请人:赫拉巴Abx公司