专利名称：：用于血红蛋白消化的试剂的制作方法用于血红蛋白消化的试剂介绍本发明涉及包含緩冲剂、胃蛋白酶和1，3-二烷基-咪唑镨盐的用于血红蛋白消化的试剂。本发明也公开了该试剂在用于消化血红蛋白的方法、在4全测HbAlc的方法中的用途，及公开了用于收集包含所述用于消化血红蛋白的试剂的全血样品的取样管。
背景技术：
：循环血液葡萄糖水平控制的削弱是糖尿病的标志。非酶统计法中的血糖可与多肽的赖氨酸残基连接，因此产生糖化多肽。对具有长半衰期的蛋白质而言，经常观察到糖化。最经常用于评价循环血液葡萄糖水平的长期控制的蛋白质是血红蛋白。有许多测定糖化血红蛋白的方法。根据糖化和非糖化蛋白质成分在其中被分离和定量的方法基本上可将这些方法分成三組(Goldstein,D.E.等，Clin.Chem.32Suppl.lO(1986)B64-B70)。第一组由基于采用电荷差的物理化学方法組成。这些方法包括采用阳离子交换柱例如Diamat、MonoS和PolyCatA(Bisse法)的HPLC测定，这些是临床化学中最常用的方法。在糖化血红蛋白的情况中，定量评价通常通过HbAlc信号相对于Hb总量的相对测定(％HbAlc)进行。第二组中的方法是利用糖化和非糖化蛋白质的不同化学反应性的那些方法。这些方法包括例如与血红蛋白结合的葡萄糖在其中转化析法，在该方法中糖残基邻近的二醇基团和与支持物共价结合的硼酸基团之间的络合物的形成用于分离糖化和非糖化血红蛋白。所分离的4物质种类用光度测定法定量并计算糖化血红蛋白的相对量，或者在石克代巴比土酸法的情况中，通过用合适的标准物质校准以绝对测定定量。第三，提到了免疫学方法。在免疫学方法中采用特殊的抗体。这些抗体识别例如对HbAlc典型的糖化血红蛋白分子p链的N-终端的结构单位(例如TinaquantHbAlc,RocheDiagnosticsGmbH,Germany)。在免疫学方法中分别测定HbAlc和HbA0的绝对含量。这需要使用目标浓度已经由独立方法附值的校准器(calibmtor)。例如HbAlc的相对含量不能由直接测定获得。HbAk是人类血液中的主要糖血红蛋白类物质。它用于糖尿病患者的血糖控制的长期评价几乎已20年。全面的糖尿病控制和并发症试验(DCCT)已提供了微血管并发症例如视网膜病、肾病和神经病直接与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)患者的高血糖程度相关的大量证据，并已证明血液中HbAk的测定是糖尿病患者的血糖状态的长期监控的优良工具(糖尿病控制和并发症试—验研究组糖尿病的加强治疗对胰岛素依赖型糖尿病长期并发症的发展和进化的作用(TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup:Theeffectofintensivetreatmentofdiabetesonthedevelopmentandprogressionoflong-termcomplicationsininsulin-dependentdiabetesmellitus)，Nathan等,N.Engl.J.Med329(1993)977-986;Santiago,J.V.，Diabetes42(1993)1549-1554;Benjamin,J.和Sacks,D.B.，Clin.Chem.40(1994)683-687;及Goldstein,D.等，Clin.Chem.40(1994)1637-1640)。DCCT研究也清楚地显示分别对HbAk和HbAO—正常的非糖化血红蛋白的可信的和可重复的测定的需要。然而，已知的方法与一些缺点相联系。因此某些物理化学法具有非常差的选择性，因为所测定的糖化蛋白质的信号被非糖化变体重叠。色谱峰的形状经常不对称并且难于积分。所使用的阳离子交换柱在工作条件下对很小的变化和污染敏感。由于选择性差测定太高的值(假阳性值)具有高风险。在化学法的情况中难于使程序标准化并且用很大的努力仅能避免其他含糖成分的干扰。把例如HbAlc和其他糖化血红蛋白变体区别开来是不可能的。免疫学方法的特征在于对糖化蛋白质变体的非常高的选择性。然而，结果的质量取决于校准所采用的标准的质量。合适的最佳质量的主要标准目前不存在，特别是对HbAlc而言。由于缺乏合适的参照方法不能获得基质从属物的信息。在该情况中也经常获得假阳性值(参见例如Tiran,A.等，J.Clin.Lab.Anal.8(1994)128-134)。KoboldU.等(US5,631,140)描述了基于包含在该样品中的蛋白质的蛋白水解消化的糖化蛋白质如血红蛋白的检测的方法。肽片段的检测因此用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)进行。最近，Jeppsson,J.-O.等，Clin.Chem.Lab.Med.40(2002)78-89报道了由国际临床化学和实验室医学联盟(InternationalFederationofClinicalChemistryandLaboratoryMedicine)(IFCC)批准通过的HbAlc测定参考方法。该方法基于血红蛋白的消化。糖化和非糖化形式均用酶消化，而血红蛋白的两种形式的N-终端肽片段用HPLC-MS定量。在血红蛋白的酶裂解中采用BoehringerMannheim,Mannheim,Germany(Id.no.1047817)的排序级内切蛋白酶(Endoproteinase)Glu-C。为了达到血红蛋白的完全消化，建议分别采用过夜消化例如18小时或用胰蛋白酶消化2小时。胰蛋白酶裂解裂解部位C-端一侧的赖氨酸和精氨酸之间的肽键，即它使血红蛋白的第八个和第九个氨基酸之间裂解。Jeppsson等(同上)能够显示p-链中第八位上的赖氨酸残基在高HbAlc水平的样品中也可糖化，但是在正常水平的那些中不能。因此为了定量的目的，采用胰蛋白酶释放N-端八肽将包括分别得到在Lys-1或在Lys-8位糖化的双糖化八肽或单糖化八肽的危险。因此这些研究者得出结论，胰蛋白酶裂解是不可采用的。内切蛋白酶Glu-C裂解第六和第七位上的两个6谷氨酸残基之间的P-链的N-端部分。所得片段仅在N-端缬氨酸含有单一糖化部位，因此可用于分离HbAlc。实际的裂解部位在pH4.0的温和变性条件下易于暴露于酶。消化前的完全变性使另外的底物暴露于该酶并产生更复杂的肽混合物。通过采用在线HPLC和电喷雾-质谱或HPLC和毛细管电泳的离线系统的现代多维分析技术，HbAlc和HbA0的两个卩-N-端六肽能被分离并用必要的分析手段定量。当分析由全血样品的内切蛋白酶Glu-C消化产生的肽片段混合物时，他们获得HbAlc测定的高特异性和灵敏性。某些蛋白水解酶导致有可能以不同速率产生的肽片段。这又导致所测定的浓度的高度变化或相当长的温育时间。为了评价糖化血红蛋白的部分而用于消化血红蛋白的试剂应能够使所期望的肽片段迅速地形成以及稳定地形成。如将认识到的，长的消化时间为样品产量的目的花费并且成本高。对临床常规而言能确保血红蛋白的迅速消化并在相同的时间使得例如HbAlc和HbAO能够准确定量的试剂将是高度期望的。然而，似乎是基于血红蛋白的消化的用于检测血红蛋白的方法甚至时至今日仍需要相当长的温育时间和/或不产生稳定的肽片段。现在已发现并确立的是，可以提供如下所公开的及如权利要求中所描述的蛋白水解试剂，该试剂在蛋白质的消化，从而例如导致糖化和非糖化血红蛋白的迅速消化中非常有用。发明概述本发明涉及用于血红蛋白消化的试剂，该试剂包含緩冲剂、胃蛋白酶和由1,3-二烷基-咪唑输阳离子和反荷离子组成的1，3-二烷基-咪唑镥盐。也公开了消化血红蛋白的方法，该方法包括步骤将含血红蛋白的样品与根据本发明的试剂混合，将该血红蛋白消化1-60分钟从而得到由血红蛋白的14个N-端氨基酸组成的血红蛋白片段。7还公开了测定HbAlc的方法，该方法包括步骤将含血红蛋白的样品与根据本发明的消化血红蛋白的试剂混合，将该血红蛋白消化1-60分钟，从而得到包含HbAlc的14个N-端氨基酸的HbAlc片段，测定所述HbAlc的N-端片段，并将所获得的值与HbAlc的浓度相关。在另一个实施方案中，描述了由1，3-二烷基-咪唑镜阳离子和反荷离子组成的1,3-二烷基-咪唑镜盐在胃蛋白酶消化血红蛋白中的用途。本发明也涉及取样管，该取样管包含如本发明中所公开的用于血红蛋白消化的试剂组合物。发明详述在第一个实施方案中，本发明涉及用于血红蛋白消化的试剂，该试剂包含a)緩冲剂，b)胃蛋白酶及c)由1，3-二烷基-咪唑镜阳离子和反荷离子组成的1，3-二烷基-咪唑输盐。所公开的试剂或试剂混合物可用于有效地消化血红蛋白。酶消化由胃蛋白酶产生。胃蛋白酶是消化系统中的三种主要蛋白质分解，或蛋白水解酶之一，其他两种是胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。这三种酶是首先以结晶形式分离的。在消化过程期间，这些酶(它们各自在切断特定类型的氨基酸之间的键上特别有效)相互合作将饮食中的蛋白质分解成其组成成分，即肽和氨基酸，它们可易于^皮小肠内层吸收。胃蛋白酶由胃内层以非活性形式合成；盐酸，也由胃粘膜产生，需要将非活性的前酶或酶原转化成活性酶并且维持最佳酸度(pH1-3)使胃蛋白酶起作用。有几种命名为A、B、C和D的胃蛋白酶。胃蛋白酶A是主要成分，分子量为35,000道尔顿，及如果底物是天然蛋白，对该底物如酪蛋白或血红蛋白的最佳pH约为1.0。胃蛋白酶优先在芳族氨基酸例如苯丙氨酸和酪氨酸的羧基处裂解蛋白。在含缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸的键处将不裂解。其作用将长的多肽链分解成更短长度的肽。根据本发明的试剂被緩冲以确保胃蛋白酶迅速和有效地作用。因为胃蛋白酶在强酸性pH下活性最强，所以緩冲剂将优选调节到pHl-pH4之间。也优选pH将在pH1.5-pH3之间。熟练的技术人员在选择适当的pH以及适当的緩沖系统上将无问题。酸性緩沖系统可以例如基于甘氨酸或柠檬酸盐。优选HC1用于调节所期望的pH。调节緩冲剂的浓度以确保血红蛋白消化中适当的pH。优选緩冲剂的浓度在10mM-lM之间。也优选緩沖剂的浓度将为50-200mM。胃蛋白酶(E.C.3.4.23.1)采用血红蛋白作为底物基于Anson，M.L.,丄Gen.Physiol.22(1938)79-89的方法测定。单位定义在37。C、pH2.0下一单位使280nm处的吸光度增加0.001/分。优选在根据本发明的试剂中胃蛋白酶以30-6000U/ml的浓度存在。如上所讨论，胃蛋白酶如果在正常消化条件下用于血红蛋白的消化，除了产生其他肽片段外，还导致分别两个具有7个和14个氨基酸的N-端片段的形成。因为这两种肽以不同的速率形成，所以例如通过测定这14个氨基酸肽的可靠的HbAlc测定是不可能的。已发现并在实施例部分中显示，胃蛋白酶在1,3-二烷基-咪唑锁盐的存在下导致血红蛋白N-端的14个氨基酸肽片段的迅速及稳定的形成。根据本发明的试剂因此包含1,3-二烷基-咪唑输盐。式I:1,3-二烷基-咪唑锚盐其中Rl和R2独立代表烷基残基，及其中A'代表反荷离子。优选包含在根据本发明的试剂中的1,3-二烷基-咪唑镞盐的烷基残基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。也优选在所述1，3-二烷基-咪唑镄中的两个烷基残基独立选自曱基、乙基或丙基。根据本发明的试剂将包含适当浓度的1，3-二烷基-咪唑输盐以达到胃蛋白酶活性和蛋白消化的有利效果。优选在最终浓度中它占91-25%。也优选根据本发明的试剂中的1,3-二烷基-咪唑锁盐的浓度将在2-20%或4-15%的范围内。如熟练的技术人员可容易地认识到的，包含在1，3-二烷基-咪唑输盐中的反荷离子将含有负电荷并且不是决定性的。优选反荷离子选自磷酸根、烷基磷酸根、硫酸根和烷基辟u酸根。根据本发明的试剂混合物已证明在血红蛋白的消化中是有利的，并预期在例如包含在人血清中的任何蛋白的消化中也是有利的。胃蛋白酶的更迅速及更恒定的作用预期类似地可在任何其他相关的多肽中见到。这将促进全部血清蛋白组合物或包含在其中的其他单一蛋白的分析。在另一个实施方案中，本发明涉及用于血红蛋白的消化的方法，该方法包括步骤a)将含血红蛋白的样品与根据本发明的试剂混合，及b)将该血红蛋白消化1-60分钟，从而得到由血红蛋白的14个N-端氨基酸组成的血红蛋白片段。血红蛋白消化的方法优选分别用于血红蛋白和/或糖化血红蛋白的测定。在优选的实施方案中，本发明涉及测定HbAlc的方法，该方法包括步骤a)将含血红蛋白的样品与根据本发明的试剂混合，b)将该血红蛋白消化1-60分钟，从而得到由HbAlc的14个N-端氨基酸组成的血红蛋白片段，及c)测定所述HbAlc的N-端片4爻。本发明也涉及测定总血红蛋白中HbAlc的相对浓度的方法，该方法包括步骤将含血红蛋白的样品与消化血红蛋白的试剂混合，该试剂包含(a)緩冲剂，(b)胃蛋白酶及(c)由1,3-二烷基-咪唑镄阳离子和反荷离子组成的1,3-二烷基-咪唑输盐，将该血红蛋白消化l-60分钟，从而分別得到由糖化或者非糖化的血红蛋白的14个N-端氨基酸組成的血红蛋白片段，分别测定血红蛋白的所述N-端糖化和所迷N-端非糖化片段，及将(c)中获得的值与总血红蛋白中HbAlc的相对浓度相关。10如实施例中所示，加入根据本发明的试剂混合物，非常快地消化血红蛋白是可能的，即约一分钟后已经可见最大消化。也已发现由血红蛋白的14个N-端氨基酸组成的肽片段保持稳定至少一小时。这分别对非糖化(HbAO)以及糖化HbAlcN-端肽片段适用。这些发现极大地方便了样品操作，并且允许分别测定HbA0和HbAlc的灵活的时间选择。由于这些稳定的测定，。/。HbAlc的计算不进行广泛的变化，因此相当准确和可信。HbA0和HbAlcN-端的14个氨基酸片段分别可通过任何适当的手段定量。在优选的实施方案中，定量通过免疫学方法实现。在另一个优选的实施方案中，这些肽的测定通过HPLC和质谱进^f亍。再一个优选的实施方案涉及由1，3-二烷基-咪唑镜阳离子和反荷离子组成的1，3-二烷基-咪唑输盐在胃蛋白酶消化蛋白质中的用途。进一步优选本发明涉及由1,3-二烷基-咪唑镜阳离子和反荷离子组成的1，3-二烷基-咪唑镜盐在胃蛋白酶消化血红蛋白中的用途。直接将全血样品收集到含有根据本发明的试剂的取样管中可能是理想的和最好的。在优选的实施方案中，本发明因此也涉及包含根据本发明的试剂组合物的取样管。提供下列实施例以帮助理解本发明，其准确的范围在权利要求中描述。应理解在所提出的方法中可以进行修改，而不背离本发明的精神。实施例1血红蛋白(Hb)蛋白水解的一般方法将24微升含有0.2mg/mL血红蛋白和50mM醋酸铵(pH4.3)的血红蛋白溶液的等份试样与216^d含胃蛋白酶(300U/mL)/pH2.4的20mM柠檬酸的溶液及任选1,3-二烷基-咪唑输盐(10%重量/体积)混合。反应溶液室温保存直到测定。消化1分钟、11、21、31、41、51和61分钟的时间后，分别用HPLC-MS(参见实施例2)进行测定。报道了胃蛋白酶消化时所释放的由HbA0和由HbAlc的卩链衍生的N-端肽[1-14]的量，及这些肽的比率(HbAlc/HbAO)。实施例2用HPLC-MS测定HbAO和HbAlc的N-端肽将10pl按实施例1获得的消化物注入HPLC。HPLC系统由具有DR5溶剂递送系统的HP1090液相色i普4义(Agilent)、恒温装备的自动取样器、自动进样器和HPLC和质谱仪之间的分流阀组成。检测器是线性离子阱质谱仪，ThermoElectronLTQ,电喷雾离子化。对色谱分离而言，采用具有SymmetryC18颗粒作为床材料，内柱直径为2mm，柱长200mm和0.5(im孑L大小的玻璃原料的HPLC柱。洗脱剂是0.ly。甲酸水溶液(A)-0.1。/。曱酸乙腈溶液(B)的梯度洗脱剂，1分钟100%A,4分钟内至15%B，其后2分钟内至50%B。流速为0.2mL/min。HbA0和HbAlc肽[1-14]分别在约4.4-5.2分钟洗脱。检测通过MS/MS转变进行，HbA0m/z748.5-683.2，HbAlcm/z829.1-802.0。表1-3分别给出加入l-乙基-3-甲基咪唑镜乙基硫酸盐，1-丁基-3-曱基咪唑镜曱基硫酸盐或者不加入1,3-二烷基-咪唑镜盐所得到的血红蛋白消化的结果。表1:l-乙基-3-曱基咪唑锁乙基硫酸盐的消化结果12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>无咪唑徵盐748.5->683.2829.1->802.0面积Ans2)面积("咖2)比率T〖min.AO附'14A1cB1-14〗A1c/A0fl[1.14〗15155792672660.5184115652253437420.6082215明"33147920.5353314996323494210.6994415118293473660.6787515922453493650.58的615897843430780.5817平均5517723307190.602s41248304870.07了9"VK(%)n.11min了410VK(%)n.21min841权利要求1.一种测定HbAlc的方法，所述方法包括步骤a)将含血红蛋白的样品与消化血红蛋白的试剂混合，所述试剂包含aa)缓冲剂，ab)胃蛋白酶，及ac)由1，3-二烷基-咪唑鎓阳离子和反荷离子组成的1，3-二烷基-咪唑鎓盐，b)将所述血红蛋白消化1-60分钟，从而得到包含HbAlc的14个N-端氨基酸的血红蛋白片段，及c)测定所述HbAlc的N-端片段。2.权利要求1的方法，其中所述用于消化血红蛋白的试剂的緩沖剂的pH在pHl-pH4之间。3.权利要求1或2的方法，其中所述用于消化血红蛋白的试剂的緩冲剂的浓度在10mM-lM之间。4.权利要求1-3中任一项的试剂，其中在所述用于消化血红蛋白的试剂中包含的胃蛋白酶以30-6000U/ml之间的浓度存在。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在所述用于消化血红蛋白的试剂中包含的1,3-二烷基-咪唑镄的两个烷基残基独立选自甲基、乙基或丙基。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中在所述用于消化血红蛋白的试剂中包含的反荷离子选自磷酸根、烷基磷酸根、硫酸根和烷基硫酸根。7.—种消化血红蛋白的方法，所述方法包括步骤a)将含血红蛋白的样品与消化血红蛋白的试剂混合，所述试剂包含8.aa)緩冲剂，ab)胃蛋白酶，及ac)由1，3-二烷基-咪唑镜阳离子和反荷离子组成的1,3-二烷基-咪唑镜盐，及b)将所述血红蛋白消化1-60分钟，从而得到由血红蛋白的14个N-端氨基酸组成的血红蛋白片段。9.由1,3-二烷基-咪唑镜阳离子和反荷离子组成的1，3-二烷基-咪唑镜盐在胃蛋白酶消化血红蛋白中的用途。10.—种取样管，所述取样管包含用于消化血红蛋白的试剂，所述试剂包含a)緩沖剂，b)胃蛋白酶，及c)由1，3-二烷基-咪唑输阳离子和反荷离子组成的1,3-二烷基-咪唑输盐。全文摘要本发明涉及包含缓冲剂、胃蛋白酶和1，3-二烷基-咪唑鎓盐的用于血红蛋白消化的试剂。本发明也公开了该试剂在用于消化血红蛋白的方法、在检测HbA1c的方法中的用途，及公开了用于收集包含所述用于消化血红蛋白的试剂的全血样品的取样管。文档编号G01N33/72GK101490558SQ200780027614公开日2009年7月22日申请日期2007年7月19日优先权日2006年7月21日发明者B·沃格特,H·冯德埃茨,R·赫曼恩,T·杜埃尔弗,U·科博德申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司