专利名称：一种蓝藻污染水微囊藻毒素检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水质捡测方法，特别是一种蓝藻污染水微囊藻毒 素检测方法。
(二)
背景技术：
(1) 世界各地25%-70%的蓝藻水华可产生毒素，在有毒性的7个 属的蓝藻中，主要产毒的是鱼腥藻(Anabaena Bory )、束丝藻
(Aphanizomenon Morr.)禾口微囊藻(Microcystis Ktitz)属中的某 些品系，其中微囊藻毒素是一类分布最广泛且与人类关系最为密切的 七肽单环肝毒素，是强烈的肝脏肿瘤促进剂。微囊藻毒素通常大部分 存在于藻细胞内，当细胞破裂或衰老时毒素释放进入水中，国内外已 有大量文献报道证实湖泊水库及饮用水中发现微囊藻毒素。
微囊藻毒素的检出，对现行饮用水安全评价指标体系构成冲击， 需要重新评价当前水厂主流处理工艺，例如，再也不能像从前一样放 心地使用氯氧化技术、随意地选用各种净水药剂，因为使用不当，会 破坏藻体，释放胞内微囊藻毒素，影响水质安全。为此，世界卫生组 织(WHO)和西方发达国家均制定了饮用水及其水源水中微囊藻毒素 不得超过lpg/L的控制标准，加拿大的标准更为严格(0. 5pg/L)，我 国卫生部2006年新出台的"生活饮用水卫生标准"也规定了 lpg/L 的限制标准，显示了国际供水界及公众对饮用水中微囊藻毒素的广泛 关注。
(2) 然而令人遗憾的是，微囊藻毒素的检测方法尚存在诸多技 术缺陷，世界卫生组织推荐的检测方法实用性及通用性不强，还不够 成熟，这在一定程度上影响了饮用水中微囊藻毒素的监测与控制。
(三)
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效、简便、灵活的蓝藻
污染水微囊藻毒素检测方法，使其能提高饮用水中微囊藻毒素的监测控制的准确性。
为了解决上述技术问题，本发明包括以下步骤
(1) 水样过滤，分离出藻类，胞外微囊藻毒素留在水相中；
(2) 将分离出的藻类冻融、酸解、离心萃取，得含胞内微囊藻 毒素的上清液；
(3) 将步骤(1)中的水相和步骤(2)中的上清液分别进行或 合并在一起后再进行反相固相萃取得微囊藻毒素和非极性 杂质的洗脱液、再将该洗脱液正相固相萃取得微囊藻毒素 洗脱液；
(4) 测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素的种类 和数量。
为了便于本方法的实施，所述步骤(2)中藻类冻融采用液氮冻 融，酸解采用乙酸酸解，所述步骤(3)中反相固相萃取采用C18反 相柱，所述的正相固相萃取采用硅胶正相柱。
为了使方法灵活，易于操作，所述步骤(4)通过酶联免疫法测 定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素总量，通过高效液 相色谱法测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素种类和 含量。酶联免疫法可以快速测定微囊藻毒素总量，高效液相色谱法可 对藻毒素进行定性定量。
本发明的有益效果是本发明采用冻融酸解使胞内微囊藻毒素充 分释放，采用"反相-正相"两级固相萃取使微囊藻毒素富集纯化， 然后分别进行微囊藻毒素总量测定或准确定性定量分析。可方便检测 胞内微囊藻毒素和胞外微囊藻毒素，也可一次测定总的微囊藻毒素， 本发明高效、简便、灵活，本发明方法的使用能提高饮用水中微囊藻 毒素的监测控制的准确性。 具体实施例方式
具体实施例一 本具体实施例包括如下步骤
(1) 将10L蓝藻污染水通过滤膜过滤，过滤后的藻类用纱布包 好，胞外微囊藻毒素留在水相中；
(2) 将过滤得的藻类置入液氮罐中保持lmin，然后放入离心试管，加以5。/o乙酸10mL，在3600r/min下离心萃取9分钟，重复萃取3次，合并上清液。(3) 将步聚(1)所得的水相和步骤(2)所得上清液合并在起 进行反相固相萃取得微囊藻毒素和非极性杂质的洗脱液、再将该洗脱 液正相固相萃取得微囊藻毒素洗脱液；反相固相萃取包括以下步聚a反相柱准备先用10mL甲醇清洗并活化反相柱，再加15mL超 纯水将活化好的反相柱条件化。b反相柱富集将水样以4mL/min的滤速通过反相柱，过滤完成 后，用12mL的甲醇水混合液(4>甲醇=20%)清洗反相柱，干抽5min 后，用2ml甲醇洗脱。正相固相萃取包括以下步聚a正相柱准备用10mL甲醇清洗并活化柱床，再用10mL的甲醇 水混合液(小甲醇=20%)将活化好的正相柱条件化。b正相柱纯化将反相固相萃取的甲醇洗脱液稀释成甲醇水混合 液(小甲醇=20%)，以4. 5mL/min的流速通过硅胶柱，抽干8min后， 用2mL甲醇洗脱并定容至2mL，即得微囊藻毒素洗脱液。(4) 测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素的种类 和数量。具体实施例二 本具体实施例包括如下步骤(1) 将10L蓝藻污染水通过滤膜过滤，过滤后的藻类用纱布包 好，胞外微囊藻毒素留在水相中；(2) 将过滤得的藻类置入液氮罐中保持1.6min，然后放入离心 试管，加以5%乙酸10mL，在3950r/min下离心萃取8.5分钟，重复 萃取3次，合并上清液。(3) 将步聚(1)所得的水相进行反相固相萃取得微囊藻毒素和 非极性杂质的洗脱液、再将该洗脱液正相固相萃取得胞外微囊藻毒素 洗脱液；将歩骤(2)所得上清液进行反相固相萃取得微囊藻毒素和 非极性杂质的洗脱液、再将该洗脱液正相固相萃取得胞内微囊藻毒素洗脱液；反相固相萃取包括以下步骤a反相柱准备先用10mL甲醇清洗并活化反相柱，再加20mL超 纯水将活化好的反相柱条件化。b反相柱富集将水样以4. 5mL/min的滤速通过反相柱，过滤完 成后，用llmL的甲醇水混合液(4)甲醇二20%)清洗反相柱，干抽8min 后，用2ml甲醇洗脱。正相固相萃取包括以下步骤a正相柱准备用10mL甲醇清洗并活化柱床，再用12mL的甲醇 水混合液(4>甲醇=20%)将活化好的正相柱条件化。b正相柱纯化将反相固相萃取的甲醇洗脱液稀释成甲醇水混合 液((]> 甲醇二20%)，以5mL/min的流速通过硅胶柱，抽干6min后，用 2mL甲醇洗脱并定容至2mL，即得微囊藻毒素洗脱液。(4) 通过酶联免疫法测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微 囊藻毒素总量。(5) 通过高效液相色谱法测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液 中微囊藻毒素种类和含量。采用酶联免疫法可以快速检测微囊藻毒素总量，所述步骤(5)， 采用高效液相色谱法对藻毒素进行准确的定性定量。具体实施例三 本具体实施例包括如下步骤(1) 将10L蓝藻污染水通过滤膜过滤，过滤后的藻类用纱布包 好，胞外微囊藻毒素留在水相中；(2) 将过滤得的藻类置入低温环境中保持1.9min，然后放入离 心试管，加以适量硫酸，在4000r/min下离心萃取10分钟，重复萃 取3次，合并上清液。(3) 将步聚(1)所得的水相和步骤(2)所得上清液合并在起 进行反相固相萃取得微囊藻毒素和非极性杂质的洗脱液、再将该洗脱 液正相固相萃取得微囊藻毒素洗脱液；反相固相萃取包括以下步骤aC'8反相柱准备先用10mL甲醇清洗并活化Clft反相柱，再加18mL Milliq超纯水将活化好的C,8反相柱条件化。b C,8反相柱富集将水样以4. 9mL/min的滤速通过"反相柱， 过滤完成后，用14mL的甲醇水混合液(4>甲醇二20%)清洗U反相柱， 干抽10min后，用2ml甲醇洗脱。正相固相萃取包括以下步骤a硅胶正相柱准备用10mL甲醇清洗并活化柱床，再用15mL的 甲醇水混合液(小甲醇二20%)将活化好的正相柱条件化。b硅胶正相柱纯化将反相固相萃取的甲醇洗脱液稀释成甲醇水 混合液(小甲醇二20%)，以4. lmL/min的流速通过硅胶柱，抽干8min 后，用2mL甲醇洗脱并定容至2mL，即得微囊藻毒素洗脱液。(4)根据需要，采用冻融酸解或高效液相色谱法测定步骤(3) 所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素的种类和数量。
权利要求
1. 一种蓝藻污染水微囊藻毒素检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)水样过滤，分离出藻类，胞外微囊藻毒素留在水相中；(2)将分离出的藻类冻融、酸解、离心萃取，得含胞内微囊藻毒素的上清液；(3)将步骤(1)中的水相和步骤(2)中的上清液分别进行或合并在一起后再进行反相固相萃取得微囊藻毒素和非极性杂质的洗脱液、再将该洗脱液正相固相萃取得微囊藻毒素洗脱液；(4)测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素的种类和数量。
2. 根据权利要求1所述的蓝藻污染水微囊藻毒素检测方法，其特征 在于所述歩骤(2)中藻类冻融采用液氮冻融，酸解采用乙酸酸 解，所述步骤(3)中反相固相萃取采用C18反相柱，所述的正相 固相萃取采用硅胶正相柱。
3. 根据权利要求1或2所述的蓝藻污染水微囊藻毒素检测方法，其 特征在于所述步骤(4)通过酶联免疫法测定步骤(3)所得微 囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素总量，通过高效液相色谱法测定步 骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素种类和含量。
全文摘要
本发明公开了一种蓝藻污染水微囊藻毒素检测方法，本发明包括以下步骤(1)水样过滤，分离出藻类，胞外微囊藻毒素留在水相中；(2)获取含胞内微囊藻毒素的上清液；(3)将步骤(1)中的水相和步骤(2)中的上清液进行反相固相萃取得微囊藻毒素和非极性杂质的洗脱液、再将该洗脱液正相固相萃取得微囊藻毒素洗脱液；(4)测定步骤(3)所得微囊藻毒素洗脱液中微囊藻毒素的种类和数量。本发明可方便检测胞内微囊藻毒素和胞外微囊藻毒素，也可一次测定总的微囊藻毒素，本发明高效、简便、灵活，本发明方法的使用能提高饮用水中微囊藻毒素的监测控制的准确性。
文档编号G01N33/48GK101285824SQ20081001535
公开日2008年10月15日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者吕玲玲, 孙韶华, 贾瑞宝, 陈家全 申请人:济南市供排水监测中心