专利名称：：可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法
技术领域：
：本发明涉及or淀粉酶活力的检测方法，具体是可溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀粉酶活力的方法。技术背景-a-淀粉酶(a-Amylase,AMS)的全称为1，4-a_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，是一种不均一性的钙依赖金属蛋白质酶，它作用于淀粉的a-1,4葡萄糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖。它己经广泛用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药、轻化工业、石油开采等各个领域。在临床上有很高的应用价值，根据体内酶活力的变化诊断疾病，如胰脏疾病和肾脏疾病导致淀粉酶活力升高；肝脏疾病可导致酶活力下降。因此对a-淀粉酶的研究具有重要的意义。目前对于or淀粉酶的检测，有流动注射光度法、微量量热法、粘度测定法、碘量法、凝胶扩散法3.5二硝基水杨酸法等。其中流动注射光度法的线性范围为0.1-3mmol七—'，灵敏度较低。粘度测定法因精确性差，底物不稳定很少采用。微量量热法虽然相对较简单，但不够准确。检测cr淀粉酶活力的方法虽然很多，但可溶性淀粉共振散射光谱法检测or淀粉酶活力的方法，尚未见报道。
发明内容本发明的目的是要公开一种灵敏度高，简便快速的可溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀粉酶活力的方法。溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀粉酶活力的方法包括如下步骤一、制备已知a-淀粉酶活力的测试体系1、在5mL具塞刻度试管中，分别加入0.65ml10mg/mL可溶性淀粉和pH5.3Na異-K跳溶液，然后再加入0.lOmL0.27。CaAcv溶液和0.lml0.9%Nacl溶液，将试管置水浴锅中，5(TC预热，放置5min;2、然后再加入适量5Mg/mLa-淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回5(TC水浴锅中温浴，放置85min;3、然后再依次加入0.40mol/L0.2mlNaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀；4、用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在264nm和423nm处有两个较宽的散射峰，在423nm处测定体系的共振散射强度I423nm;二、制备试剂空白体系用步骤一的方法制备试剂空白体系，但不加入a-淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试剂空白体系共振散射强度Io;三、计算Ai42h-l423訓-I()的值；四、以加入的or淀粉酶浓度为横坐标，以A^^为纵坐标，绘制工作曲线；五、依据步骤一的方法，制备检测体系，加入的a-淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得3被测样品的A/;六、根据工作曲线，求得被测样品中a-淀粉酶的浓度。实验表明，在未加入a-淀粉酶之前，可溶性淀粉体系的同步散射光谱较强(图1)，当有or淀粉酶存在时，体系的同步散射有所减弱，随着浓度的增加，共振散射强度也逐渐降低，并且，a-淀粉酶的浓度在0.00835—0.50lPg/ml范围内，a-淀粉酶的浓度与共振散射强度呈良好的线性关系，线性方程为1=4.96C+3.8。检测限为0.0069Pg/ml。本发明的原理可溶性淀粉具有很强共振散射效应，a-淀粉酶水解可溶性淀粉成小颗粒的淀粉微粒，共振散射强度降低。共振散射强度降低的大小与a-淀粉酶的浓度呈正比关系，将可溶性淀粉微粒的共振散射光谱检测与a-淀粉酶的催化反应相结合，建立起可溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀粉酶活力的方法。本发明的优点(1)设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；(2)试剂易得，成本低廉；(3)底物可溶性淀粉无毒。图1为本发明实施过可溶性淀粉体系的共振散射光谱图；图中a:pH5.3-2.6mg/mlstarch-0.36mg/mlNacl-O.08mg/ralCaAc2-0.04mol/LNaOHb:pH5.3-2.6mg/mlstarch-O.36mg/mlNacl-O.08mg/mlCaAc厂O.04lVmlAMS-0.04mol/LNaOHc:pH5.3-2.6mg/mlstarch-0.36rag/mlNacl-0.08mg/mlCaAc厂O.16Pg/mlAMS-0.04mol/LNaOHd:pH5.3-2.6mg/mlstarch-0.36mg/mlNacl-0.08mg/mlCaAc厂O.48^g/mlAMS-0.04mol/LNaOH具体实施例方式用本发明的方法检测20个人的唾液的a-淀粉酶的含量1、所用试剂的仪器CaryEclipse分光光度计(VarianCompany,PaloAlto,CA)、HH-S2电热恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)、TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；可溶性淀粉(中国医药集团上海化学试剂公司)，a-淀粉酶(165，OOOU/g丰特斯化学试剂公司)，聚丙烯酰胺(分子量在500万以上，上海化学试剂采购供应站分装厂)；可溶性淀粉溶液取可溶性淀粉0.25g于小烧杯中，加入约5mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒盛有20ml沸水的50ml烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移到50ml的烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2min，冷却至30。C以下，加入10mg/mLPAM，用蒸馏水定容至50ml。缓冲溶液取0.2387gNa2HP(V12H20，加水溶解后定容至100ml。取0.0908gKH2P04加水溶解后定容至lOOml。将此二者按体积比配制成pHNa2HP04_1(}^04缓冲溶液，置冰箱保存。所用试剂为分析纯，所用水均为二次蒸馏水；2、制备已知cr淀粉酶浓度的测试体系-在5ral具塞试管中，依次加入0.65mllOmg/mL可溶性淀粉，0.70mLpH5.3Na2HP04-KH2P04溶液，0.10mL0.27。CaA(V溶液和0.lml0.9%NaCl溶液，将试管置水浴锅中，50。C预热，5min后取出，加入适量5^/mLa-淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回5(TC水浴锅中温浴，85min后取出，依次加入0.40mol/L0.2mlNaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀。取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上。电压400V，狭缝为5nm，同步扫描激发波长"x和发射波长人》(入。x=、J得到体系的RS光谱。在423ran处测定体系的散射光强度/,2"3、用上述2的方法制备试剂空白体系，测的共振散射强度Io;4、计算A厶23^l4^-Io的值，并做标准曲线在最佳实验条件下,取不同浓度AMS标准液，按实验方法进行测定，并以其共振散射强度A;与AMS浓度C作图。AMS在0.00835—0.501^g/ral(0.00138-0.0827U/ml)范围内与A厶^之间呈现良好的线性关系。其线性回归方程为A/=155C+13，相关系数R-0.9857，检测限为0.0069l^g/ml;5、分别取20个人的唾液各lml，10000rps离心30rain，收集上清液，加蒸馏水稀释100倍，分别制成测试体系，求20个样品的A/，依据工作曲线，求得被测的20个人的唾液的a-淀粉酶浓度，见表l。表1样品分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2AMS测定方法比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*1FAU定义为每1小时酶水解5.26g淀粉为1单位权利要求1、可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法，其特征是测定方法包括如下步骤1)制备已知α-淀粉酶活力的测试体系(1)在5mL具塞刻度试管中，分别加入0.65ml10mg/mL可溶性淀粉和pH5.3Na2HPO4-KH2PO4溶液，然后再加入0.10mL0.2％CaAc2溶液和0.1ml0.9％Nacl溶液，将试管置水浴锅中，50℃预热，放置5min；(2)然后再加入适量5μg/mLα-淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回50℃水浴锅中温浴，放置85min；(3)然后再依次加入0.40mol/L0.2mlNaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀；(4)用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在264nm和423nm处有两个较宽的散射峰，在423nm处测定体系的共振散射强度I423nm2)制备试剂空白体系用步骤一的方法制备试剂空白体系，但不加入α-淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试剂空白体系共振散射强度I0；3)计算ΔI423nm＝I423nm-I0的值；4)以加入的α-淀粉酶浓度为横坐标，以ΔI423nm为纵坐标，绘制工作曲线；5)依据步骤(1)的方法，制备检测体系，加入的α-淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得被测样品的ΔI；6)根据工作曲线，求得被测样品中α-淀粉酶的浓度。2、如权利要求1所述的测定方法，其特征是a-淀粉酶在0.00835-0.50w/mL范围内，a-淀粉酶的浓度与共振散射强度呈良好的线性关系，线性方程I=4.96C+3.8，检出限为0.0069^g/mL。3、如权利要求1所述的测定方法，其特征是酶反映时间为5(TC水浴条件反应85min。全文摘要本发明公开了可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法，它是利用已知酶活力的α-淀粉酶的共振散射强度I<sub>423nm</sub>和试剂空白的共振散射强度I<sub>0</sub>，求出ΔI<sub>423nm</sub>＝I<sub>423nm</sub>-I<sub>0</sub>做标准曲线，然后测定未知浓度的α-淀粉酶的ΔI，依据工作曲线求得被测物的α-淀粉酶的浓度，本发明的优点是设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；试剂易得，成本低廉；底物可溶性淀粉无毒。文档编号G01N21/25GK101320000SQ200810073669公开日2008年12月10日申请日期2008年7月3日优先权日2008年7月3日发明者刘庆业,蒋治良,纪马申请人:广西师范大学