专利名称：：乙醇含量的测量装置及其方法
技术领域：
：本发明涉及一种乙醇含量的测量装置及其方法，特别涉及利用氧化酶系统检测乙醇含量的装置及其使用方法。现有技术由于酒类商品销售量大，销售金额庞大，以掺水提高产量的劣质酒流入市面的欺骗事件时有所闻。此外，政府及社会对酒后驾车的行为日益重视，并提高酒后驾车的刑责和罚金。因此，对于掺水假酒的筛检或用于酒后驾车的检测方法很有市场潜力。气相层析法虽可对酒类样本各成份提供精确的检测，然而由于其前处理及分析步骤极为冗长；加之仪器本身价格昂贵、体积庞大，且需要经过专业训练的人员才能操作，导致检测成本过高，基本上并不符合销售商与一般大众实时筛检的需求。生物传感器(biosensor)主要是由生物辨认组件及信号传输组件所构成。由传统酶电极的概念加以放大，目前凡是涉及到生物催化与生物亲和力的都在生物传感器的应用范围内。生物传感器还具有下列多项优点，可克服传统分析方法的缺陷，因此很有发展潜力。生物传感器的优点包括(l)通过应用固定化技术，生物辨认组件可重复使用，降低成本；(2)生物辨认组件专一性高，可避免非标的物干扰；(3)操作简易；(4)灵敏度高，所需样本量低；(5)应答快速，降低分析时间；(6)数字信号输出，达到微小化，易携带，可用于现场探测。因此，本发明将分子生物技术与电化学式酶生物传感器的概念相结合，开发生物微传感器来检测液态或酒类样本中乙醇的含量。本发明与其它传统分析方法相比，除了有便利、快速、灵敏且体积小等优点，还具备实时输出的特性。本发明的装置可供检验单位、酒类销售商乃至于一般家庭民众直接用于市面上掺水假酒的筛检，及饮酒人上路前自行对酒测值快速检
发明内容发明摘述本发明的一个目的在于提供一种乙醇含量的检测方法，其包括(1)利用氧化酶将溶液中的乙醇氧化并产生H202;(2)用电子媒介物与所述&02反应，并产生还原电流；并(3)测量所述还原电流，并将所测量的电流代入预先以乙醇标准溶液与相对电流所建立的线性方程式中，以测定溶液中的乙醇含量。本发明的另一目的在于提供一种乙醇含量的检测装置，其包含基板；参考电极，其位于所述基板上；及工作电极，其位于所述基板上且不接触参考电极，而该工作电极包括一个工作区域，其中该工作区域中至少包含氧化酶和电子媒介物。本发明的另一目的在于提供一种利用乙醇含量检测装置的乙醇浓度检测方法，其中所述乙醇含量测量装置包含基板；参考电极，其位于所述基板上；及工作电极，其位于所述基板上且不接触参考电极，而该工作电极包括一个工作区域，其中该工作区域中至少包含氧化酶和电子媒介物，而所述方法包括(1)将所述装置与起始电解质溶液接触适当时间，并测量起始电流值(Ii);(2)将所述装置与待测乙醇溶液样本接触适当时间，并测量最终电流值(If);并(3)将所述起始电流值(Ii)和最终电流值(If)的差值(AI)与乙醇标准溶液及其相对电流信号差值比较，测定样本中乙醇的浓度。6本发明的乙醇含量检测装置及其检测方法不仅可降低检测成本，还能大幅提高使用方便性，兼具灵敏度高、操作简易、应答快速及体积微小化等诸多优点。发明详述本发明的一个目的在于提供一种乙醇含量的检测方法，其包括(1)利用氧化酶将溶液中的乙醇氧化并产生H202;(2)用电子媒介物与所述11202反应，并产生还原电流；并(3)测量所述还原电流，并将所测量的电流代入预先以乙醇标准溶液与相对电流所建立的线性方程式中，以测定溶液中的乙醇含量。在本发明中，所述氧化酶只要能将乙醇氧化产生H202即可，并无特别限制。在一个具体实施例中，所述氧化酶为醇类氧化酶(alcoholoxidase;AOX)。在本发明中，对于所使用的电子媒介物并无特别限制，只要能与&02反应并产生还原电流即可，其适当的实例例如有麦尔多拉蓝(MeldolaBlue,MB，8-dimethylamino-2,3-benzophenoxazine)、普鲁士蓝(PrussianBlue,potassiumhexacyanoferrate)、二氯酚青定基酚(dichlorophenolindophenol)、X寸苯二酮(p-benzoquinone)、邻苯二胺(o-phenylenediamine)、3,4-二羟苯甲醛(3，4-dihydroxybenzaldehyde)及其混合物等。优选地，所述电子媒介物为普鱼+蓝日丄J&Lo本文中所述的乙醇标准溶液与相对电流所预先建立的线性方程式，是标准参考的乙醇浓度与电流的方程式，其用本发明的方法测量不同已知浓度的乙醇溶液，并将这些乙醇浓度与所测得的相对电流建立线性方程式而获得。本发明的另一目的在于提供一种乙醇含量的检测装置，其包含基板；参考电极，其位于所述基板上；及工作电极，其位于所述基板上且不接触参考电极，而该工作电极包括一个工作区域，其中该工作区域中至少包含氧化酶及电子媒介物。在本发明中，用作本发明电极的材料并无特别限制，只要能够达到本发明的目的而没有不良效果的均可用于本发明，其可包括例如氧化铟、玻璃、金、白金、钯、石墨及碳黑等材料。在电极结构方面，无论是平板电极、网印电极(screenprintingelectrode)、实心针状电极或镂空针状电极等结构均可应用于本发明。在本发明的一个具体实施例中，所述电极为网印电在本发明中，对于所使用的电子媒介物并无特别限制，只要能与&02反应并产生还原电流即可，其适当实例例如有麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3，4二羟苯甲醛及其之混合物等。优选地，所述电子媒介物为普鲁士蓝。在本发明中，所述工作电极上的工作区域中所固定的氧化酶只要能将乙醇氧化产生H202即可，并无特别限制。在一个具体实施例中，所述氧化酶为醇类氧化酶。而氧化酶的固定量约为62.9至约314.6吗/cm2。本发明的另一目的在于提供利用乙醇含量检测装置的乙醇浓度检测方法，其中所述乙醇含量测量装置包含基板；参考电极，其位于所述基板上；及工作电极，其位于所述基板上且不接触参考电极，而该工作电极包括一个工作区域，其中该工作区域中至少包含氧化酶和电子媒介物，而所述方法包括(1)将所述装置与起始电解质溶液接触适当时间，并测量起始电流值(Ii);(2)将所述装置与待测乙醇溶液样本接触适当时间，并测量最终电流值(If);及(3)将所述起始电流值(Ii)与最终电流值(If)的差值(AI)与乙醇标准溶液及其相对电流信号差值比较，测定该样本中乙醇之浓度。在本发明中，用作本发明电极的材料并无特别限制，只要能够达到本发明的目的而没有不良效果的均可应用于本发明，其可包括例如氧化铟、玻璃、白金、金、钯、石墨及碳黑等材料。在电极结构方面，无论是平板电极、网印电极、实心针状电极或镂空针状电极等结构均可应用于本发明。在本发明的一个具体实施例中，所述电极为网印电极。8在本发明中，对于所使用的电子媒介物并无特别限制，只要能与&02反应并产生还原电流即可，其适当的实例例如有麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3,4二羟苯甲醛等。优选地，所述电子媒介物为普鲁士蓝。在本发明中，所述工作电极上的工作区域中所固定的氧化酶只要能将乙醇氧化产生H202即可，并无特别限制。在一个具体实施例中，所述氧化酶为醇类氧化酶。而氧化酶的固定量约为62.9至约314.6昭/cm2。上述乙醇标准溶液及其相对应电流信号差值可预先建立成乙醇浓度与电流的线性方程式，它是标准参考乙醇浓度与电流的方程式，用本发明的方法测量不同已知乙醇浓度的溶液，并将这些乙醇浓度与所测量的电流关系建立线性方程式而获得。本发明的优点在于提供结合分子生物技术、酶固定与电化学相关技术，应用于以酶反应为基础的电化学乙醇探测用生物微传感器，并可针对真实酒类样本中乙醇的含量进行快速且灵敏的探测，可达到实时且低成本传感器的目的，并大幅提高使用方便性。本发明的探测装置可直接用于掺水假酒的筛检，并可供检验单位、酒类销售商，乃至于一般民众进行酒类质量的管控，达到维护人体健康的目的。此外，本发明还可提供饮酒人于上路前自行对酒测值的快速检测，以提供饮酒人驾驶安全信息。在本发明说明书中，除另行定义之外，本文中所使用的所有技术和科学用语的意义本领域技术人员通常都知道。本领域技术人员也能体会任何相似或相同于这里所描述的方法和材料，也可用于实施或测试本发明。下面实施例参照相关图式说明本发明。实施例仅为示范性的，且不应理解为对本发明的限制。实施方式实施例1PBSPE电极与H202的电化学反应本实施例采用网印电极(购自泰博(巧莹)科技股份有限公司)制备本发明的检测装置，该检测装置100的结构如图1所示，包含PVC材质的基板102;参考电极104，其位于基板102上；工作电极106，其位于基板102上且不与参考电极104接触；工作区域108，其位于工作电极106上；及PVC绝缘层llO。SPE电极的基材为PVC材质，网印碳胶共分三道程序，首先在工作区域108以外的区域刷上银胶，而后在工作区域108第一与二层以纯碳胶进行网印，第三层则视需要用适当比例的碳胶与普鲁士蓝(PB)(比例可随所需而调整，普鲁士蓝比例越高电流值越大)进行印刷，最后再覆盖上PVC绝缘层，这种含普鲁士蓝的网印电极简称为PBSPE电极。由图1可明显看出，放大工作区域108的面积目的在于增加酶与电子媒介物的固定量，以增大电流输出信号，同时降低探测极限的下限。在PBSPE电极与H202的电化学反应方面，首先用桌上型电化学仪检验H202对PBSPE电极的电化学影响。在电化学仪施加固定还原电位-0.2伏特的条件下，当电极上的电子媒介物PB与H202作用而被氧化时，此电位可立即将其还原并产生还原电流，在电流计上即测量到电流输出信号的变化，电流信号与H202浓度正相关，如图2所示。每luMH202产生电流约30nA。由此可知，在提供特定还原电位的情况下，PBSPE电极可用于检测样品中的H202浓度。实施例2网印电极上含明胶的氧化酶的固定在氧化酶固定方面，以PBS缓冲液配制8M明胶(购自Difco)溶液，并置于42'C加热盘中融化后备用。取0.5ul醇类氧化酶(AOX;购自Sigma;lu/ul)与2.5ul明胶溶液(8%)混合后，均匀涂布于网印电极的工作区域108表面，放置在4"C干燥，之后保存在防潮罐中待试验时取用。实施例3乙醇浓度的测定利用实施例2所完成的固定化氧化酶的电极测定乙醇浓度，首先，取5mlPBS作为电解液，工作电压设为-0.2伏特，在不断搅拌的情况下进行计时电流法实验。酵素电极置于电解液时先进行预平衡若干秒以获得稳定的背景电流，然后再依次滴加不同浓度的乙醇溶液，探测并记录其电流值。图3即为固定化氧化酶电极探测不同浓度乙醇的结果。探测乙醇浓度时，溶液中乙醇与包埋在明胶内的AOX酵素反应产生H202，随后扩散至电极表面，再经由电子媒介物PB转化为电流输出信号。因此，由图3可知，前50秒电极于PBS缓冲液中进行预平衡，此时尚未添加乙醇，故没有上升电流信号。在第50秒加入乙醇，电流值即迅速上升，这是因试片上的AOX与乙醇反应产生H202所致。由图3的斜率决定电流差值的截取时间。截取第60秒至第80秒的电流差值，以乙醇浓度对电流差值作图，所得的乙醇浓度校正曲线如图4。由浓度校正曲线可知，本装置的固定化酵素电极对乙醇浓度的线性探测范围约为0-200ppm，乙醇浓度在此范围时其浓度与电流信号成正相关；若乙醇浓度高于200ppm时，其电流差值斜率则渐趋平缓，实际原因是乙醇受质过饱和，故电流信号无法再增大。实施例4网印电极上不含明胶的氧化酶的固定用含有0.05%Tween20的PBS缓冲溶液配制不含明胶的氧化酶溶液。将0.5ulAOX(lu/ul)、2.5ulPBS(0.05%Tween20)及适量酵素保存剂混合后，均匀涂布于网印电极的工作区域108表面，放置在4"C晾干，之后保存在防潮罐中待实验时取用。适当的酵素保存剂包括DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)、NEOPROTEINSAVOR、高分子电解质(ployelectrolyte)、多元醇(polyalcohol;PVA)、市售安定剂(主要成份为BSA)等，其中优选为DEAE-葡聚糖。酵素保存剂添加的浓度，换算成AOX:PBS:酵素保存剂的比例约为4/20/1、4/20/10、8/20/1或8/20/10。最适合使用浓度为AOX:PBS:5%DEAE-葡聚糖8/20/10。将本实施例所制备的电极试片室温风干保存，每隔一段时间测试电极试片的电流，表现将其与原始电流值相比较测试保存一段时间后的电流稳定度，其结果如图5所示。由该图可知，测试结果显示室温风干保存半个月其电流稳定度仍高达93%。实施例5乙醇浓度的测定用实施例4所制备的电极试片测定乙醇浓度，用含0.05%Tween20的PBS缓冲溶液配制待测乙醇样本，以便增加溶液与电极表面的亲和能力，使乙醇样本可均匀扩散，故完全覆盖电极表面所需的样本体积可减少至20ul。检测乙醇浓度时，先将电极试片与缓冲液接触而预平衡，之后，取待测乙醇样本20ul滴在电极表面，当液面与电极接触时可产生电流，探测并纪录该电流值，电极对不同浓度乙醇的电流与时间的关系如图6所示。由图6可知，样本中乙醇浓度越高，第21秒的电流平衡值越高。将乙醇浓度与第21秒电流读数作图，所得结果如图7所示，本实施例方法的乙醇浓度线性探测范围约为0-100ppm。实施例6本发明在市售酒类上的应用以市售40%威士忌做一系列稀释(1600、5333、8000倍稀释)，利用本发明的乙醇含量检测装置测量酒精含量浓度，其结果如图8所示。由该图可看出随着稀释倍数增加，电流变化值将越小，经由所建立的浓度与电流变化值相关式换算测量所得的乙醇浓度，与理论值(即40%/稀释倍数)及气相层析仪(GC)确认后的浓度相比较如下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表1可知，用本发明的乙醇含量检测装置测得的乙醇浓度与气相层析仪确认后的浓度值相当接近，两者误差可小于13%，且稀释倍数越低准确度越高。本发明的乙醇含量检测装置的乙醇探测范围(即相关式线性范围)可为0-200ppm，针对不同酒类可调整不同稀释倍率，使待测乙醇浓度落在此线性范围内。实施例7本发明在酒测上的应用经由人体试验受测者先喝5cc三多利威士忌(SUNTORYWHISKY;40%)，5分钟后将唾液取出并稀释IO倍，以本发明的乙醇含量检测装置重复进行三次乙醇浓度测量，其结果如图9所示。取80至j120秒的电流变化量套入已建立的浓度与电流变化值关系式中，换算出唾液中乙醇残留浓度如下表2所示。所测得的乙醇平均残留浓度为48.3ppm，且变异系数仅6.32%o表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>为进一步确认本发明的乙醇含量检测装置对唾液中乙醇残留测量的适用性，针对人体饮用10cc三多利威士忌，漱口后，每隔10分钟采集唾液稀释IO倍后进行残留乙醇浓度定量，结果如图10所示。由该图可知，随着延迟采样时间延长，电流信号将渐次变小，仅在前30分钟所采集的唾液样品中可测到乙醇残留。因此，若以本发明的装置进行酒测，只需将唾液进行10倍稀释，若检测结果超过50ppm，则相当于超过吐气检验法所规定的酒精浓度每公升0.25毫克以上。唾液和血液中酒精浓度比值约为1.20，即驾驶人可在道路驾驶前，以本发明的乙醇含量检测装置先行判别酒测值是否已超出法规规氾。上述实施例仅为示范性且不应视为对本发明的限制。上述教示可应用在其它类型装置。说明书内容旨在更详尽说明本发明，并不应以此限制本发明的申请专利范围。图1说明本发明网印电极的结构。图2说明不同H202浓度所产生的相对PBSPE电极的电流信号。图3说明以固定化氧化酶电极探测不同浓度乙醇的电流-时间图。图4说明乙醇浓度校正曲线图。图5说明本发明的电极试片在室温风干保存后，电极试片的电流表现与原始电流值的比较图。图6说明以未固定化氧化酶电极探测不同浓度乙醇的电流-时间图。图7说明以未固定化氧化酶电极探测不同浓度乙醇的乙醇浓度与第21秒电流读数图。图8说明利用本发明的乙醇含量检测装置测量市售40%威士忌稀释后的酒精浓度中，电流与时间的关系图。图9说明以本发明的乙醇含量检测装置重复进行三次唾液中乙醇的浓图10说明以本发明的乙醇含量检测装置进行唾液中乙醇的浓度测量中，电流与时间的关系图。主要组件符号说明100检测装置102基板104参考电极106工作电极108工作区域110绝缘层权利要求1、一种乙醇含量的检测方法，其包括(1)利用氧化酶将溶液中的乙醇氧化并产生H2O2；(2)以电子媒介物与所述H2O2反应，并产生还原电流；并(3)测量所述还原电流，并将测量的电流代入预先以乙醇标准溶液与相对电流所建立的线性方程式中，以测定溶液中的乙醇含量。2、权利要求1的检测方法，其中所述氧化酶为醇类氧化酶。3、权利要求1的检测方法，其中所述电子媒介物为麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3，4二羟苯甲醛及其混合物等。4、权利要求1的检测方法，其中所述电子媒介物为普鲁士蓝。5、一种乙醇含量的检测装置，其包含基板；参考电极，其位于所述基板上；及工作电极，其位于所述基板上且不接触参考电极，而该工作电极包括一个工作区域，其中该工作区域中至少包含氧化酶及电子媒介物。6、权利要求5的检测装置，其中所述氧化酶为醇类氧化酶。7、权利要求5的检测装置，其中所述工作电极的工作区域中所固定的醇类氧化酶量约为62.9至约314.6吗/cm2。8、权利要求5的检测装置，其中所述电子媒介物为麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3,4二羟苯甲醛及其混合物。9、权利要求5的检测装置，其中所述电子媒介物为普鲁士蓝。10、权利要求5的检测装置，其中所述工作电极的工作区域中进一步包含明胶。11、权利要求5的检测装置，其中所述工作电极的工作区域中进一步包含酵素保存剂。12、权利要求11的检测装置，其中所述酵素保存剂为DEAE-葡聚糖、NEOPROTEINSAVOR、高分子电解质、多元醇及安定剂。13、权利要求5的检测装置，其使用于检测酒类中乙醇的含量。14、权利要求5的检测装置，其使用于检测唾液中乙醇的含量。15、一种利用乙醇含量检测装置的乙醇浓度的检测方法，其中所述乙醇含量测量装置包含基板；参考电极，其位于所述基板上；及工作电极，其位于所述基板上且不接触参考电极，而该工作电极包括一个工作区域，其中该工作区域中至少包含氧化酶及电子媒介物，而所述方法包括(1)将所述装置与起始电解质溶液接触适当时间，并测量起始电流值(Ii);(2)将所述装置与待测乙醇溶液样本接触适当时间，并用所述装置测量最终电流值(Ifh及(3)将所述起始电流值(Ii)与最终电流值(H)的差值(AI)与乙醇标准溶液及其相对应电流信号差值比较，测定该样本中乙醇的浓度。16、权利要求15的检测方法，其中所述氧化酶为醇类氧化酶。17、权利要求15的检测方法，其中所述工作电极的工作区域中所固定的氧化酶量约为62.9至约314.6pg/cm2。18、权利要求15的检测方法，其中所述电子媒介物为麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3,4二羟苯甲醛及其混合物。19、权利要求15的检测方法，其中所述电子媒介物为普鲁士蓝。20、权利要求15的检测方法，其中所述工作电极的工作区域中进一步包含明胶。21、权利要求15的检测方法，其中所述工作电极的工作区域中进一步包含酵素保存剂。22、权利要求21的检测方法，其中所述酵素保存剂为DEAE-葡聚糖、NEOPROTEINSAVOR、高分子电解质、多元醇及安定剂。23、权利要求15的检测方法，其中所述乙醇标准溶液及其相对应电流信号差值可预先建立成乙醇浓度与相对电流的线性方程式。24、权利要求15的检测方法，其中所述待测样本的乙醇含量范围介于0至200ppm之间。25、权利要求15的检测方法，其用于检测酒类中乙醇的含量。26、权利要求15的检测方法，其用于检测唾液中乙醇的含量。全文摘要本发明涉及一种乙醇含量的检测装置及其方法。本发明以氧化酶反应为基础研发出电化学乙醇探测用生物微传感器，并可针对真实酒类样本或人类唾液中乙醇的含量，进行快速且灵敏的探测，可直接用于市面上掺水假酒的筛检，及饮酒人上路前自行对酒测值的快速检测。本发明的乙醇含量检测装置及其检测方法不仅可降低检测成本，还能大幅提高使用方便性，兼具灵敏度高、操作简易、应答快速及体积微小化等诸多优点。文档编号G01N33/98GK101587087SQ20081010053公开日2009年11月25日申请日期2008年5月20日优先权日2008年5月20日发明者巫鸿章,林毕修平,钱瑞龙,陈建孝申请人:财团法人生物技术开发中心