专利名称：一种基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱的半胱氨酸快速检测法的制作方法
技术领域：
本发明属于半胱氨酸检测方法技术领域，特别涉及基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱的 半胱氨酸快速检测方法。
背景技术：
据《氨基酸》(吴显荣编著，北京农业大学出版社，1988年出版，第3页)记载， 半胱氨酸是一种含硫氨基酸，在有机体代谢的氧化还原过程中起着重要的作用。据《人 体生物之源——氨基酸》(邹忠梅、喻长远主编，中国医药科技出版社，2000年出版，第 63-67页)记载，半胱氨酸及其衍生物也是潜在的神经性毒素和多种生理学环境的生物标 记，其在生物体中的含量直接关系着心血管功能。据美国《新英格兰医学杂志》(7T7eA^vv 五"g/flwiJowmo/o/Afe&c/恥338:1042-1050， 1998)报道，半胱氨酸及其同系物——同型半 胱氨酸在临床应用上可以作为动脉粥样硬化等心脑血管疾病的独立危险指标，空腹情况 下其在人体内的正常浓度为5-15pM。目前检测半胱氨酸及其衍生物的主要方法有荧光偏 振免疫检测法、高效液相色谱法、电化学伏安法等，但是这些检测方法都依赖于复杂昂 贵的仪器设备，且操作步骤繁琐、耗时长，又不能在临床上实现大流量自动化分析。近 日，美国《纳米快报》(Mmo8(2): 529-533. 2008.)报道了用表面修饰有DNA分子 的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸的方法，该方法利用半胱氨酸与汞离子(Hg^)结合能力强 的特点，通过检测偶联金纳米颗粒溶胶的双链DNA分子解螺旋温度的变化来实现半胱氨 酸定量检测的目的。然而，上述方法需要使用精确控温的仪器，操作仍比较繁琐，且耗 时多于2小时，对于临床应用仍有较大限制。到目前为止，尚未见文献报道可以在十分 钟以内检测半胱氨酸的方法。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱的半胱氨酸的快速检测方 法，以克服现有检测技术中仪器设备复杂昂贵、操作过程繁琐、耗时长的缺点。
本发明基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱的半胱氨酸快速检测法，其特征在于将去离
子水和pH值在3.8至5.7的缓冲溶液以及金纳米颗粒溶胶原液混合配制成检测液，使得 该检测液中的缓冲物质和金元素的浓度分别为10ilmM和0.9±0.1mM;将含半胱氨酸的 待检测液加入到上述检测液中，使得形成的检测体系中半胱氨酸的浓度为0.5 1(^M，将 其混合均匀后在十分钟内测量其吸收光谱；根据检测体系的吸收光谱中波长为700纳米 和525纳米的吸光度的比值ri的不同，即定量检测出半胱氨酸的浓度。
本发明方法中使用的检测液为水溶性金纳米颗粒溶胶，当溶胶的pH值处于3.8 5.7 范围内时，检测液为红色；在加入含有半胱氨酸的待检测液后，半胱氨酸分子中的巯基 (-SH)能迅速地连接在金纳米颗粒表面，半胱氨酸另一端的羧基(-COOH)和氨基(-NH2)则 向外伸展，而不同金纳米颗粒之间的羧基(-C00H)和氨基(-NH2)相互作用较强，导致表面 连接有半胱氨酸的金纳米颗粒聚集；由于金纳米颗粒表面等离子共振吸收特性受到聚集程度的影响，整个体系的颜色随之发生改变并在吸收光谱中反映出定量关系，利用吸收 光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值ri的不同，即可定量检测出半胱氨酸的 浓度；由于除半胱氨酸以外的其他19种氨基酸分子中都不具有巯基(-SH)集团，因此都无 法直接连接在金纳米颗粒溶胶表面，也无法借助上述的吸收光谱检测方法来定量检测其 浓度。这种根据金纳米颗粒溶胶的吸收光谱对20种天然氨基酸的不同响应，区分半胱氨 酸与其他氨基酸，并根据金纳米颗粒溶胶吸收光谱的变化来定量检测半胱氨酸浓度的方 法，尚未见文献报道。有别于美国《纳米快报》(A^mo&股M， 8(2): 529-533. 2008.)中报道 的通过测量偶联金纳米颗粒溶胶的双链DNA分子解螺旋温度的变化实现半胱氨酸的定 量检测方法，本发明方法是通过测量金纳米颗粒溶胶吸收光谱的变化实现半胱氨酸的定 量检测目的。与现有技术相比，采用本发明方法可在十分钟之内检测出体系中半胱氨酸 的浓度，大大縮减了检测半胱氨酸所需的时间，并具有设备简单、操作简易、且能批量 检测的优点。
图1是pH值为3.8的金纳米颗粒溶胶在加入不同浓度半胱氨酸后的吸收光谱图； 图2是由图1中pH值为3.8的吸收光谱得到的波长为700纳米和525纳米吸光度的 比值Ti与半胱氨酸浓度之间的关系曲线图。
图3是pH值为5.0的金纳米颗粒溶胶在加入不同浓度半胱氨酸后的吸收光谱图； 图4是由图3中pH值为5.0的吸收光谱得到的波长为700纳米和525纳米吸光度的
比值T1与半胱氨酸浓度之间的关系曲线图。
图5是pH值为5.7的金纳米颗粒溶胶在加入不同浓度半胱氨酸后的吸收光谱图； 图6是由图5中pH值为5.7的吸收光谱得到的波长为700纳米和525纳米吸光度的
比值T1与半胱氨酸浓度之间的关系曲线图。
图7是当半胱氨酸浓度为3^M时，不同pH值条件下，波长为700纳米和525纳米 吸光度的比值T1与体系pH值之间的关系曲线图。
图8是pH值为8.0的金纳米颗粒溶胶在加入不同浓度半胱氨酸后的吸收光谱图； 图9是由图8中pH值为8.0的吸收光谱得到的波长为700纳米和525纳米吸光度的
比值T1与半胱氨酸浓度之间的关系曲线图。
图10是pH值为5.0的金纳米颗粒溶胶中加入浓度均为3nM的20种不同天然氨基 酸后的吸光度比值变化即h-riol的柱形图。
具体实施例方式
实施例1:用pH值为3.8的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸浓度
步骤一、金纳米颗粒溶胶的准备
金纳米颗粒溶胶可直接采用商用产品，也可以自制而得。
自制金纳米颗粒溶胶的具体歩骤为在100 mL圆底烧瓶中加入48 mL去离子水和2 mL浓度为25mM的氯金酸溶液，置于90-95'C水浴中回流5分钟，然后迅速加入5 mL 浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，并在剧烈搅拌下继续在上述水浴中回流20分钟，得 到深红色溶胶液体。撤去水浴并继续搅拌，冷却到室温，即得到金纳米颗粒溶胶。步骤二、 pH值为3.8的缓冲溶液A的准备
pH值为3.8的缓冲溶液可直接采用商用产品，也可以自制而得。 自制pH值为3.8的缓冲溶液的具体歩骤为称取0.4102克醋酸钠晶体，溶解在20 mL 去离子水中，并在该浓醋酸钠溶液中准确加入2576pL冰醋酸，得到母液，将该母液转移 到lOOmL容量瓶中并用去离子水稀释到刻度，即得到100mL500mM缓冲溶液A。 歩骤三、半胱氨酸检测液的制备
按照去离子水、缓冲溶液A、金纳米颗粒溶胶原液的先后顺序，以及按去离子水-
缓冲溶液A:金纳米颗粒溶胶原液=39: 1: IO的体积比，将上述三种液体混合以保持体
系的pH值为3.8，此时缓冲物质醋酸/醋酸钠的总浓度为10mM,而金元素的浓度为 0.91mM，将该溶液记为B。需要注意的是，当检测液中的缓冲物质和金元素的浓度分别 为10ilmM和0.9i0.1mM时，其对半胱氨酸的检测效果最佳，灵敏度最高，在超出这个 范围之后，受离子当量以及金纳米颗粒间相互作用的影响，该检测液对半胱氨酸的检测 灵敏度会明显降低。
歩骤四、准确称取0.0121克半胱氨酸晶体，用去离子水溶解并稀释到100mL，得到 浓度为lmM的半胱氨酸溶液C。
歩骤五、半胱氨酸浓度的检测
分别按体积OnL、 l|aL、 2pL、 3pL、 3.5pL、 4|iL、 5pL和6pL，取上述配制的浓度 为lmM的半胱氨酸溶液C八份，分别溶于2mL上述步骤三中制备的溶液B中，并迅速 将其混合均匀，此时检测体系中半胱氨酸的浓度分别为OpM、 0.5 pM、 lpM、 1.5(aM、 1.75nM、2(iM、2.5^M和3pM，在混合后十分钟之内分别测量其吸收光谱，所得谱线al a8 被依次绘制在图1中。此处需要注意的是在检测液和半胱氨酸溶液混合十分钟以后， 由于受半胱氨酸中活性官能团的影响，表面吸附了半胱氨酸的金纳米颗粒溶胶会部分吸 附到玻璃或石英器皿内壁上，对光谱测量产生干扰，会造成测量结果的不准确，因此需 要在十分钟之内测量其吸收光谱。随着半胱氨酸浓度的增加，检测体系的吸收光谱曲线 从al到a8发生显著变化波长为525纳米的吸收峰强度下降，而波长在650纳米以上 的部分吸光度上升。
步骤六、数据处理
将吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值记为r)，按r)值随半胱氨酸 浓度的变化作图，得到吸光度的比值Ti与半胱氨酸浓度之间的关系曲线如图2中所示，图 中的曲线b表明检测体系的ti值与半胱氨酸浓度呈单调关系，该曲线b即可作为借助pH 值在3.8下的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸浓度的标准曲线；可见在pH值为3.8时的检 测体系能有效检测出半胱氨酸的浓度范围为0.5~3pM。
实施例2:用pH值为5.0的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸浓度
步骤一、同实施例1中的步骤一。
步骤二、 pH值为5.0的缓冲溶液D的准备
pH值为5.0的缓冲溶液可直接采用商用产品，也可以自制而得。自制pH值为5.0 的缓冲溶液的具体歩骤为称取2.7343克醋酸钠晶体溶解在20mL去离子水中，并在该浓醋酸钠溶液中加入954 冰醋酸得到母液。将母液转移到容量瓶中并用去离子水稀释 到100 mL，得到500 mM缓冲溶液D。
步骤三、半胱氨酸检测液的制备
具体操作步骤同实施例1中的歩骤三，仅需用缓冲溶液D替代实施例1中的缓冲溶 液A，使得三种液体混合后金纳米颗粒溶胶的pH值为5.0。将该溶液记为E。 歩骤四、同实施例l中的步骤三，配制浓度为lmM的半胱氨酸溶液C。 歩骤五、半胱氨酸浓度的检测
分另帳体积0pL、 2pL、 4pL、 4半、5pL、 5.5pL、 6(^L、 7pL、 8pL、 10pL、 14jaL 和2(VL取上述配制的浓度为lmM的半胱氨酸溶液C十二份，分别溶于2 mL的溶液E 中，并迅速将其混合均匀，使检测体系中半胱氨酸的浓度分别为0hM、 lpM、2jaM、2.25^M、 2.5pM， 2.75faM、 3|aM、 3.5pM、 4jaM、 5pM、 7faM和10pM,在十分钟内分别测量吸收 光谱，所得谱线cl cl2依次绘制在图3中。随着半胱氨酸浓度的增加，检测体系的吸收 光谱曲线从cl到cl2发生显著变化波长为525纳米的吸收峰强度下降，而波长在650 纳米以上的部分吸光度上升。
歩骤六、数据处理
将吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值记为ti，按ii值随半胱氨酸 浓度的变化作图，得到吸光度的比值T1与半胱氨酸浓度之间的关系曲线如图4所示，图中 的曲线d表明检测体系的T!值与半胱氨酸浓度呈单调关系，该曲线d即可作为借助pH值 在5.0下的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸浓度的标准曲线；可见在pH值为5.0时的检测 体系能有效检测出半胱氨酸的浓度范围为1 10pM。
实施例3:用pH值为5.7的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸浓度
步骤一、同实施例l中的步骤一。
步骤二、 pH值为5.7的缓冲溶液F的准备
pH值为5.7的缓冲溶液可直接采用商用产品，也可以自制而得。自制pH值为5.7 的缓冲溶液的具体歩骤为称取3.6914克醋酸钠晶体溶解在20mL去离子水中，并在该 浓醋酸钠溶液中加入286pL冰醋酸得到母液。将母液转移到容量瓶中并用去离子水稀释 到100 mL，得到500 mM缓冲溶液F。
步骤三、半胱氨酸检测液的制备
具体操作歩骤同实施例1中的步骤三，仅需用缓冲溶液F替代实施例1中的缓冲溶 液A，使得三种液体混合后金纳米颗粒溶胶的pH值为5.7。将该溶液记为G。 步骤四、同实施例l中步骤三，配制浓度为lmM的半胱氨酸溶液C。 步骤五、半胱氨酸浓度的检测
取半胱氨酸溶液C OpL， 4|iL， 5pL， 6pL， 8pL， 12pL， 16pL， 20pL，分别溶于2 mL 的溶液G，并迅速将其混合均匀，使检测体系中半胱氨酸的浓度分别为0pM、2nM、2.5nM、 3pM、 5|iM、 6pM、 8pM和10|iM，在十分钟内分别测吸收光谱，所得谱线el e8依次绘 制在图5中。随着半胱氮酸浓度的增加，检测体系的吸收光谱曲线从el到e8发生显著 变化波长为525纳米的吸收峰强度下降，而波长在650纳米以上的部分吸光度上升。步骤六、数据处理
将吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值记为ri，按ri值随半胱氨酸 浓度的变化作图，得到吸光度的比值T1与半胱氨酸浓度之间的关系曲线如图6所示，图中 的曲线f表明检测体系的il值与半胱氨酸浓度呈单调关系，该曲线f即可作为借助pH值 在5.7下的金纳米颗粒溶胶检测半胱氨酸浓度的标准曲线；可见在pH值为5.7时的检测 体系能有效检测出半胱氨酸的浓度范围为2 10pM。
综合本发明的以上三个实施例可以说明，pH值在3.8 5.7范围内的金纳米颗粒溶胶 能够定量检测半胱氨酸的浓度，且半胱氨酸能够被定量检测出的浓度范围为0.5 10)LiM， 检测过程耗时小于十分钟；检测的灵敏度随着pH的升高而下降。
下面通过一组比较例来说明，当金纳米颗粒溶胶的pH值超出上述范围而处于弱碱 性条件下，本发明方法中的检测体系不再具有检测半胱氨酸浓度的能力。
比较例1: pH值为8.0的金纳米颗粒溶胶与半胱氨酸的作用
步骤一、同实施例l中的步骤一。
步骤二、将pH值为8.0的浓度为1M的三乙醇胺(Tris)缓冲溶液记为J。按照去
离子水、缓冲溶液J、金纳米颗粒溶胶原液的先后顺序，以及去离子水缓冲溶液J:金
纳米颗粒溶胶原液=79: 1: 20的体积比将上述三种液体混合，并使金纳米颗粒溶胶的pH 值为8.0。此时缓冲物质的总浓度为10mM。将该溶液记为K。
歩骤三、同实施例l中歩骤三，配制浓度为lmM的半胱氨酸溶液C。 步骤四、取半胱氨酸溶液C(VL、 4pL、 8)uL、 12|iL、 16pL和20iiL，分别溶于2mL 的溶液K，并迅速将其混合均匀，使检测体系中半胱氨酸的浓度分别为0pM、 2pM、 4[aM、 6pM、 8laM和10iiM，在混合均匀后十分钟内分别测吸收光谱，所得谱线gl g6依次绘 制在图7中。在该pH条件下，随着半胱氨酸浓度的增加，检测体系的吸收光谱曲线gl 到g6只有小幅度变化波长为525纳米的吸收峰强度仅下降了 0.05，波长为700纳米的 吸光度也仅上升了 0.03;且这种变化在半胱氨酸浓度为2pM的时候就已经达到饱和状态。 歩骤五、数据处理
将吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值记为"，按ri值随半胱氨酸 浓度的变化作图，如图8所示。图8中的曲线h表明在pH-8.0条件下，通过测量检测 体系的"H值，无法精确地得到体系中半胱氨酸的浓度信息。
下面通过另一组比较例说明本发明方法对半胱氨酸的检测具有高度选择性，即在 能够有效检测出半胱氨酸浓度的条件下，金纳米颗粒溶胶对于其他19种天然氨基酸的光 谱响应极低，因此可排除其他氨基酸的干扰而有效区分出半胱氨酸。
比较例2:用pH值为5.0的金纳米颗粒溶胶检测20种天然氨基酸的比较
步骤一、同实施例1中的步骤一。
步骤二、同实施例2中的步骤二。
步骤三、同实施例2中的步骤三。
步骤四、取2 mL溶液E测量其吸收光谱，将其吸收光谱中波长为700纳米和525 纳米的吸光度的比值记为Tlo。步骤五、分别称取丙氨酸(Ala) 89毫克、精氨酸(Arg) 174毫克、天冬酰胺(Asn) 150毫克、天冬氨酸(Asp) 133毫克、半胱氨酸(Cys) 121毫克、谷氨酰胺(Gln) 146 毫克、谷氨酸(Glu) 147毫克、甘氨酸(Gly) 75毫克、组氨酸(His) 155毫克、异亮 氨酸(lie) 131毫克、亮氨酸(Leu) 131毫克、赖氨酸(Lys) 146毫克、蛋氨酸(Met) 149毫克、苯丙氨酸(Phe) 165毫克、脯氨酸(Pro) 115毫克、丝氨酸(Ser) 105毫克、 苏氨酸(Thr) 119毫克、色氨酸(Try) 204毫克、酪氨酸(Tyr) 181毫克和缬氨酸(Val) 117毫克，依次溶于100mL的去离子水中，得到浓度均为lmM的20种氨基酸的溶液， 记为溶液L1 L20。
步骤六、溶液Ll L20各取6pL分别溶于2mL溶液E,并迅速将其混合均匀，使每 种氨基酸在检测体系中的浓度均为3pM。在混合后十分钟内分别测量其吸收光谱。 歩骤七、数据处理
将吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值记为n;加入氨基酸前后， 检测体系的吸光度比值ri的变化即lri-TiGl对应不同的氨基酸作柱形图，如图9所示。由图9 可见在氨基酸浓度同为3pM的情况下，只有含半胱氨酸的检测体系lri-t!ol值发生明显 改变，而19种其他氨基酸的lr)-"ol值相对半胱氨酸均小于2。/。。据此本发明方法可以有效 地区分半胱氨酸和其它19种氨基酸。
综合分析说明
本发明方法基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱来实现半胱氨酸定量检测的目的。根据金 纳米颗粒溶胶对20种天然氨基酸的不同响应，可有效区分半胱氨酸与其他氨基酸；根据 金纳米颗粒溶胶在不同浓度的半胱氨酸的作用下，其吸收光谱中波长为700纳米和525 纳米的吸光度的比值ri的不同，可定量检测出半胱氨酸的浓度；其中金纳米颗粒溶胶的 pH值适用范围为3.8 5.7。本发明的定量检测半胱氨酸浓度的方法具有快速、设备简易、 操作简单、且能批量检测的优点。
权利要求
1、一种基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱的半胱氨酸快速检测法，其特征在于将去离子水和pH值在3.8至5.7的缓冲溶液以及金纳米颗粒溶胶原液混合配制成检测液，使得该检测液中的缓冲物质和金元素的浓度分别为10±1mM和0.9±0.1mM；将含半胱氨酸的待检测液加入到上述检测液中，使得形成的检测体系中半胱氨酸的浓度为0.5～10μM，将其混合均匀后在十分钟内测量其吸收光谱；根据检测体系的吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值η的不同，即定量检测出半胱氨酸的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种基于金纳米颗粒溶胶吸收光谱的半胱氨酸快速检测法，特征是将去离子水和pH值在3.8至5.7的缓冲溶液以及金纳米颗粒溶胶原液混合配制成检测液，使得该检测液中的缓冲物质和金元素的浓度分别为10±1mm和0.9±0.1mm；将含半胱氨酸的待检测液加入到上述检测液中，使得形成的检测体系中半胱氨酸的浓度为0.5～10μm，将其混合均匀后在十分钟内测量其吸收光谱；根据检测体系的吸收光谱中波长为700纳米和525纳米的吸光度的比值η的不同，即定量检测出半胱氨酸的浓度。本发明方法大大缩减了检测半胱氨酸所需的时间，并同时具有设备简易、操作简单、且能批量检测的优点。
文档编号G01N21/31GK101408509SQ20081023460
公开日2009年4月15日 申请日期2008年10月27日 优先权日2008年10月27日
发明者于晓芳, 彬 刘, 吴呈昊, 杰 曾, 王晓平 申请人:中国科学技术大学