专利名称：一种表面等离子共振芯片的制备方法
技术领域：
本发明属于表面等离子共振传感技术领域，特别涉及表面等离子共振芯片的制备方法。
背景技术：
基于表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance, SPR)的生物传感器因其 能实时监测生物分子间相互作用，且具有无需标记、分析快捷、灵敏度高、前处理简单、 样品用量少等优点，已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境 监测等领域，且显示出广阔的应用前景。在众多的SPR生物传感器中，瑞典比艾可(BIAC0RE ) 系列仪器占有最大的市场份额，相应地，其传感芯片的使用也最为广泛。目前最常用的芯 片为长链的羧化葡聚糖基质(CM5)芯片，适用于偶联带有氨基、巯基、醛基、羟基或羧基 的分子，但由于该芯片只能从Biacore公司购买，价格昂贵，实验成本过高，致使很多单 位的Biacore仪器处于闲置状态。《英国化学会志化学通讯》(Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1990, 116 .1 : 1526—1528 )才艮道过CM5芯片的制 备方法，不但操作繁瑣、耗时长，所使用的葡聚糖价格昂贵，而且其中的环氧氯丙烷是有 毒试剂。鉴于芯片成本已成为该技术普遍应用的瓶颈，因此开发成本低廉、操作简单、耗 时短且安全无害的芯片制备方法，制备出具有CM5芯片相同功能的芯片，对促进表面等离 子共振传感技术的发展有着重要意义。目前通过偶联生物蛋白分子来制备表面等离子共振 传感芯片的只有美国德州仪器(TI)公司的传感芯片，它是将预先交联过的牛血清白蛋白 直接浸泡连接于芯片表面，然后用琥珀酸酐对表面牛血清白蛋白分子进行羧基化。但是， 由于蛋白分子体积较大，金膜表面难免还存在棵露的地方；而预先交联则会影响芯片表面 基质的平整度；且直接偶联的强度不够高，蛋白分子容易在使用过程中发生脱落；这些都 会影响芯片的使用效果、稳定性以及实验结果的可重复性。除上述方法外，至今未见有其 它制备表面等离子共振芯片方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种表面等离子共振芯片的制备方法，以更简便的方式制备出具 有CM5芯片相同功能的芯片，增加芯片类型的可选择性。
本发明表面等离子共振芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)生物蛋白质的预处理
向生物蛋白质溶液中加入二硫键还原剂至混合溶液中生物蛋白质与二硫键还原剂的 终浓度分别为0. 01 nM-lmM和1 u M-1M,反应不少于1分钟；
所述生物蛋白质选自分子内含有巯基和/或二硫键的蛋白质，包括牛血清白蛋白、卵 清白蛋白、血红蛋白、核糖核酸酶和/或溶菌酶；
所述二硫键还原剂选自三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、2-巯 基乙醇和/或2-巯基乙酸；(2)芯片表面基质的构建
a) 将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入上述经预处理的生物蛋白质溶液 中浸泡不少于5分钟，得到连有生物蛋白质分子的芯片；
b) 将上述得到的连有生物蛋白质分子的芯片放入含有0. 01-10M N-羟基丁二酰亚胺 与0. 01-10M乙基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中，浸泡不少于1分钟进行表面交 联；
c) 将表面交联后的芯片放入含有0. 01-1OM溴乙酸与0. 01-1OM的氢氧化钠或氢氧化
钾水溶液中，浸泡不少于5分钟，取出后用水洗净并在4-60 °C干燥，便得到具有羧基表
面的生物蛋白质芯片。
所述干燥包括氮气吹千、空气吹干、烘干或自然晾干。
本发明借助于金属表面分子自组装技术的发展，采用化学方法改性、固定和修饰的手 段，将改性的生物蛋白质分子通过自组装固定于芯片金膜表面，然后再进一步修饰，制备 出了适用于SPR生物传感器的新型传感芯片。
与现有技术相比较，本发明的优点和有益效果为
(1) 与目前已公开的制备CM5芯片的方法相比较，本发明采用简单的化学方法与安 全无害的试剂，通过简易的操作便能在较短时间内制备出具有CM5芯片相同功能的生物蛋 白质芯片，增加了芯片类型的可选择性；
(2) 与目前直接偶联牛血清白蛋白的方法相比较，本发明方法适用于多种蛋白分子， 且制备的芯片具有偶联分子密度更高、基质更均一和更牢固稳定的优点；
(3 )由于本发明制备过程使用的试剂均较易获得且价格不太昂贵，与目前只能从 Biacore公司购买的CM5芯片相比，本发明的生物蛋白质芯片不但具备CM5芯片的功能， 而且制备成本低廉，从而能大幅降低实验成本；为解决目前表面等离子共振芯片种类少、 价格高的问题提供了新的可能性。
图1为使用本发明方法制备的牛血清白蛋白芯片测量含不同浓度磺胺曱噁唑的标准溶 液的典型共振信号曲线；
图2为使用本发明方法制备的牛血清白蛋白芯片测量磺胺曱噁唑，根据标准溶液的共 振信号所作的磺胺甲噁唑浓度与共振信号的标准曲线；
图3为使用Biacore公司的CM5芯片测量含不同浓度磺胺曱噁唑的标准溶液的典型共 振信号曲线；
图4为使用Biacore公司的CM5芯片测量磺胺曱噁唑，根据标准溶液的共振信号所作 的磺胺甲噁唑浓度与共振信号的标准曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明方法作进一 步具体说明。 实施例1:
(1)生物蛋白质的预处理
4向牛血清白蛋白溶液中加入三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐，使混合溶液中牛血清白蛋白与 三(2-曱酰乙基)膦盐酸盐的终浓度分别为0. 5pM和lOOpM，反应30分钟，使牛血清白蛋 白分子中的二硫键被还原；
(2 )进行芯片表面基质的构建
a) 将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入经上述预处理的牛血清白蛋白溶 液中浸泡60分钟，即得到连有牛血清白蛋白分子的芯片；
b) 将上述得到的连有牛血清白蛋白分子的芯片放入含有0. 4M N-羟基丁二酰亚胺与 0. 5M乙基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡12分钟进行表面交联；
c) 将表面交联后的芯片放入含有0. 05M溴乙酸与0. 1M氢氧化钠的水溶液中浸泡60
分钟，使表面分子羧曱基化，取出后用水洗净并在30 。C的温度用氮气吹干，便得到具
有羧基表面的牛血清白蛋白芯片。
图2为使用本发明方法制备的牛血清白蛋白芯片测量磺胺曱噁唑，根据标准溶液的共 振信号所作的磺胺曱噁唑浓度与共振信号的标准曲线；图4为使用Biacore公司的CM5芯 片测量磺胺甲噁唑，根据标准溶液的共振信号所作的磺胺曱噁唑浓度与共振信号的标准曲 线。
通过将牛血清白蛋白芯片和CM5芯片在相同仪器条件下检测磺胺甲噁唑所分别得到的 抑制标准曲线图2与图4相比较，可见两者的曲线形状十分相似，各浓度标准溶液均具有 很好的稳定性，表明牛血清白蛋白芯片完全可以替代CM5芯片用于磺胺甲噁唑的定量分析。 不仅如此，牛血清白蛋白芯片还具有再生更容易，分析时间更短的优势。
图3为使用Biacore公司的CM5芯片测量含不同浓度磺胺曱噁唑的标准溶液的典型共 振信号曲线；图1为使用本发明方法制备的牛血清白蛋白芯片测量含不同浓度磺胺曱噁唑 的标准溶液的典型共振信号曲线。
如图3和图1中所显示的，相对于CM5芯片所使用的进样1分钟的再生条件和400秒 的单个样品分析时间，牛血清白蛋白芯片只需进样半分钟作为再生条件便能得到很彻底的 再生效果，而其单个样品的分析时间仅需大约300秒。此外，牛血清白蛋白芯片进样前后 的基线信号非常平稳，反映了芯片表面基质具有良好的均一性和稳定性。
实施例2:
(1) 生物蛋白质的预处理
向卵清白蛋白溶液中加入2-巯基乙醇，使混合溶液中卵清白蛋白与2-巯基乙醇的终 浓度分别为2 0 ju M和2mM,反应6 0分钟，使卵清白蛋白分子中的二硫键被还原；
(2) 进行芯片表面基质的构建
a) 将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入经上述预处理的卵清白蛋白溶液 中浸泡4 0分钟，即得到连有卵清白蛋白分子的芯片；
b) 将上述得到的连有卵清白蛋白分子的芯片放入含有0. 01M N-羟基丁二酰亚胺与 0. 01M乙基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡30分钟进行表面交联；
c) 将表面交联后的芯片放入含有0. OIM溴乙酸与0. OIM氢氧化钾的水溶液中浸泡300分钟，使表面分子羧曱基化，取出后用水洗净并在25 °C的温度用空气吹干，便得到具
有羧基表面的卵清白蛋白芯片。 实施例3:
(1) 生物蛋白质的预处理
向牛血红蛋白溶液中加入2-巯基乙酸与二硫苏糖醇，使混合溶液中牛血红蛋白、2-巯基乙酸与二硫苏糖醇的终浓度分别为lmM、 0. 8M和0，5M,反应15分钟，使牛血红蛋白 分子中的二硫键被还原；
(2) 进行芯片表面基质的构建
a) 将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入经上述预处理的牛血红蛋白溶液 中浸泡5分钟，即得到连有牛血红蛋白分子的芯片；
b) 将上述得到的连有牛血红蛋白分子的芯片放入含有2M N-羟基丁二酰亚胺与1M乙 基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡8分钟进行表面交联；
c) 将表 面交联后的芯片放入含有2M溴乙酸与4M氢氧化钠的水溶液中浸泡15分钟，
使表面分子羧曱基化，取出后用水洗净并在4 °C的温度用氮气吹干，便得到具有羧基表
面的牛血红蛋白芯片。 实施例4:
(1)生物蛋白质的预处理
向核糖核酸酶溶液中加入二^e克苏糖醇，使混合溶液中核糖核酸酶与二^e克苏糖醇的终浓 度分别为0. 01 m m和1 (j m，反应40分钟，使核糖核酸酶分子中的二硫键被还原； (2 )进行芯片表面基质的构建
a) 将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入经上述预处理的核糖核酸酶溶液 中浸泡90分钟，即得到连有核糖核酸酶分子的芯片；
b) 将上述得到的连有核糖核酸酶分子的芯片放入含有5M N-羟基丁二酰亚胺与4M乙 基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡5分钟进行表面交联；
c) 将表面交联后的芯片放入含有10M溴乙酸、1M氢氧化钠和7M氢氧化钾的水溶液中
浸泡5分钟，使表面分子羧甲基化，取出后用水洗净并在60 °C的温度烘干，便得到具
有羧基表面的核糖核酸酶芯片。 实施例5:
(1)生物蛋白质的预处理
向溶菌酶和牛血清白蛋白混合溶液中加入二硫赤藓糖醇，使混合溶液中溶菌酶、牛血 清白蛋白与二硫赤藓糖醇的终浓度分别为40pM、 60pM和100mM,反应1分钟，使溶菌酶 和牛血清白蛋白分子中的二硫键被还原； (2 )进行芯片表面基质的构建
a)将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入经上述预处理的溶菌酶和牛血清 白蛋白混合溶液中浸泡25分钟，即得到连有溶菌酶和牛血清白蛋白分子的芯片；b) 将上述得到的连有溶菌酶和牛血清白蛋白分子的芯片放入含有10M N-羟基丁二酰亚胺与10M乙基-二曱氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中浸泡1分钟进行表面交联；
c) 将表面交联后的芯片放入含有0. 6M溴乙酸与0. 5M氢氧化钠的水溶液中浸泡40分钟，使表面分子羧甲基化，取出后用水洗净并在室温下自然晾干，便得到具有羧基表面的溶菌酶-牛血清白蛋白芯片。
权利要求
1、一种表面等离子共振芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)生物蛋白质的预处理向生物蛋白质溶液中加入二硫键还原剂至混合溶液中生物蛋白质与二硫键还原剂的终浓度分别为0.01μM-1mM和1μM-1M；所述生物蛋白质为分子内含有巯基和/或二硫键的蛋白质；(2)芯片表面基质的构建a)将表面为纯金膜的表面等离子共振传感芯片放入上述经预处理的生物蛋白质溶液中浸泡不少于5分钟，得到连有生物蛋白质分子的芯片；b)将上述得到的连有生物蛋白质分子的芯片放入含有0.01-10M N-羟基丁二酰亚胺与0.01-10M乙基-二甲氨基丙基-碳二亚胺的混合水溶液中，浸泡不少于1分钟进行表面交联；c)将表面交联后的芯片放入含有0.01-10M溴乙酸与0.01-10M的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中，浸泡不少于5分钟，取出后用水洗净并在4-60℃干燥，便得到具有羧基表面的生物蛋白质芯片。
2、 如权利要求1所述表面等离子共振芯片的制备方法，特征在于所述二硫键还原剂选 自三(2-曱酰乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、2-巯基乙醇和/或2-巯基乙酸。
3、 如权利要求1所述表面等离子共振芯片的制备方法，特征在于所述干燥采用氮气吹 干、空气吹干、烘干或自然晾干。
全文摘要
本发明公开了一种表面等离子共振芯片的制备方法，特征是采用二硫键还原剂对分子内含有巯基和/或二硫键的生物蛋白质分子进行改性，然后借助金属表面分子自组装技术在芯片表面构建蛋白基质，并进一步修饰，从而实现适用于SPR生物传感器的新型传感芯片的制备；本发明具有制备成本低、操作简易、耗时短且安全无害的优点，所制备的芯片具备商业化CM5芯片的功能，为解决目前表面等离子共振芯片种类少、价格高的问题提供了新的可能性。
文档编号G01N33/48GK101477114SQ20091011611
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者周宏敏, 浩 姜, 宋存先, 欧惠超, 江海峰, 罗昭锋 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所