专利名称：荧光团化合物的制作方法
荧光团化合物相关在先申请本申请要求2008年4月3日提交的序列号为61/041923的美国临时专利申请的 优先权。就美国专利实践而言，通过引用将该临时申请整体并入本文。领域本文提供荧光团化合物。具体地，本文提供包括对甲氨基酚和若丹明、可用作荧光 标记(fluorescent label)和/或荧光探针(fluorogenic probe)的荧光团化合物。本文 还提供制备本文所公开的荧光团化合物的新颖而通用的方法。本文还提供示踪、测量、检测 或筛选生物物质(biological species)的方法。背景在包括化学和生物学的许多领域，荧光技术受到的关注日益增多。在某些情况中， 荧光分子可用于检测食品和环境样品中是否存在分析物或化学品。在离体生化分析(如 DNA测序和血糖定量)中，需要一些灵敏的荧光定量检测设备。在一些情况中，具有合适的 光化学性质的荧光探针可用于示踪活细胞中的分子和生理学事件，以及用于高通量筛选。 一般地，荧光技术比其他类型的光学测量更简单，并可提供更高的灵敏度和更多的分子信 息。荧光测量一般是高度灵敏的，因为大多数化学和生物样品中发现的荧光背景一般处于 低水平。随着荧光仪器(如共焦和多光子荧光显微镜)领域最近取得的进展，细胞事件的 实时三维成像和生物物质的实时动力学研究已经变得可能。尽管有以上提及的优点，但将荧光技术用于特定应用的可行性往往可受到适当荧 光分子的可利用性的限制。荧光分子一般包括荧光标记(或荧光示踪剂)分子和荧光探针 (或荧光传感器(fluorogenic sensor))分子，二者在其荧光性质上有所不同。一般地，荧 光标记分子的荧光总是处于“开启”状态。荧光标记分子可用于示踪生物物质。相反，可通 过与某些分析物或化学品键合或反应来改变荧光探针分子的荧光性质。因此，荧光探针分 子可用于示踪、测量、检测或筛选与荧光探针分子键合或反应的各种分析物或化学品。当用作荧光标记或荧光染料时，荧光标记分子需要与生物活性靶标(如蛋白质、 DNA、酶、抗体、细胞器、细胞、组织、药物、激素、核苷酸、核酸、多糖、脂质或其他生物分子) 反应，得到所述靶标的荧光衍生物。可与生物活性靶标反应的可利用荧光标记分子的数目 一般是有限的。活性荧光素和若丹明衍生物是迄今为止最广泛使用的荧光标记分子，因为 可通过常用光源(如氩激光(488nm和514nm线)和汞弧光灯(546nm线))将它们适当激 发。然而，它们具有一些可能使它们无法用于一些有用应用的不利性质。例如，荧光素衍生 物可相对快速地被光漂白，而且可显示依赖于PH的吸收性，这在等于或小于7的生理pH值 下导致荧光显著减弱。另一方面，虽然相比于荧光素衍生物，若丹明衍生物对光相对稳定， 且表现出发荧光对PH不敏感，但它们在水溶液中的量子产率低得多，而且与蛋白质缀合时 进一步降低量子产率。此外，若丹明衍生物及其缀合物(conjugates)的低水溶性对包含若 丹明衍生物的荧光标记分子的制备和使用带来困难。鉴于以上提及的荧光素和若丹明衍生物的不利性质，对新的荧光标记分子存在需 求，所述新的荧光标记分子相对于荧光素和若丹明衍生物具有改进的性质。一些对甲氨
9基酚或荧光素衍生物(如 Ioffe 等，J. Org. Chem. USSR 1965，1，326-336 ；Reynolds G. Α.， 美国专利第 3932415 号；Lee 等，Cytometry 1989，10，151-164 ；Haugland 等，美国专利第 5227487 号；Whitaker 等，Anal. Biochem. 1992，207，267-279 中所描述的那些)可用作另选 的(alternative)荧光标记分子，因为它们一般具有荧光素和若丹明的合意性质。例如，它 们具有合意的吸收性质，其荧光对生理范围内的PH和溶剂极性的敏感度低，具有高消光系 数、高量子产率、高光稳定性，在各种溶剂中具有高溶解性。虽然对甲氨基酚荧光染料具有合意的性质，但文献很少报道它们作为荧光标记或 荧光探针的应用，这可能是因为对甲氨基酚化合物难以合成。一般地，制备对甲氨基酚荧光 团的关键合成步骤是在路易斯酸催化剂(如氯化锌)或脱水酸的存在下，使取代或未取代 的间苯二酚与取代或未取代的6-酰基-3-氨基苯酚缩合。或者，可通过以下方式制备对甲 氨基酚荧光团在路易斯酸催化剂的存在下，使取代或未取代的氨基苯酚与取代或未取代 的4-酰基-间苯二酚缩合。以上提及的一般合成方法一般具有产率低、纯化工作繁琐的缺 点。因此，需要开发更有效的合成方法，用于制备荧光团化合物，如对甲氨基酚荧光团。最近，用于不同靶标的荧光探针的开发遭遇瓶颈。这可能是因为大多数目前可利 用的荧光探针是根据经验而不是理性地开发，这可妨碍新的荧光探针的设计。尽管已经报 道了 一些将理论方法应用于荧光探针设计的方法，但这些还远远不够。另一种有效的方法 涉及荧光探针分子库的组合合成。对甲氨基酚荧光团适合用作荧光探针库，因为它们具有 以上所述的有利的光物理性质。因此，还需要包括对甲氨基酚荧光团在内的荧光团化合物 库，它可通过新的有效合成方法容易地开发出来，用于制备本文所公开的荧光团化合物。概述本文提供荧光团化合物(如对甲氨基酚和若丹明荧光团)及其制备方法，所述荧 光团化合物可用作荧光标记和/或荧光探针，用于示踪、测量、检测或筛选生物物质。一方面，本文提供制备式(III)或(VI)的荧光团化合物或其盐的方法
(ΠΙ)或所述方法包含以下步骤(a)使式(I)或(IV)的化合物 分别与式B-X
的羟基活化剂反应，分别得到中间体(II)或(V)
权利要求
制备式(III)或(VI)的荧光团化合物或其盐的方法所述方法包含以下步骤(a)使式(I)或(IV)的化合物分别与式B X’的羟基活化剂反应，分别得到中间体(II)或(V)以及(b)在钯催化剂的存在下，使中间体(II)或(V)与式HXR1的亲核试剂偶联，分别形成式(III)或(VI)的荧光团化合物，其中OB是羟基活化基团；W1是O或S；W2是O A、S A或NR3R4；X是NR2、O或S；Y是O、S、Se、NR5或CR6R7；Z1是CR8或N；Z2是CR9R10或NR11；A是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、酰基、氨基羰基、羟基保护基或反应性官能团；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10和R11各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺酰基芳基、酰基或反应性官能团；或者CR9R10是式(VII)或(VUIa)的取代2 羧基苯基 C基团R8是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺酰基芳基、酰基或反应性官能团，或者具有式(VIIb)或(VIIc)K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和K10各自独立地为H、卤素、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟基烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、羟基、硫代、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、氰基、硝基、巯基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、磺酰基、膦酰基、磺酸酯、磷酸酯、 C(＝O) P1或 C(＝O) Q P2；P1和P2各自独立地为氢、卤素、烷氧基、羟基、硫代、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、氨基甲酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、杂烷基或具有3 7个环原子的杂环基；以及Q是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳烷基或亚烷芳基。FPA00001234536400011.tif,FPA00001234536400012.tif,FPA00001234536400013.tif,FPA00001234536400021.tif,FPA00001234536400022.tif
2.权利要求1所述方法，其中所述荧光团化合物具有式(VIII)
3.权利要求1所述方法，其中所述荧光团化合物具有式(IX)
4.权利要求1所述方法，其中所述荧光团化合物具有式(XIII)
5.权利要求1所述方法，其中R1与R3相同，且R2与R4相同。
6.权利要求1-5中任一项所述方法，其中K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和K10各自独立 地为H。
7.权利要求1-5中任一项所述方法，其中KH4HH和K10各自独立地为H； 且K2和K5各自独立地为氯或氟。
8.权利要求1-7中任一项所述方法，其中R1和R2是烷基。
9.权利要求1-7中任一项所述方法，其中R1和R2各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基。
10.权利要求1-7中任一项所述方法，其中R1是氢，R2是烷基。
11.权利要求1-10中任一项所述方法，其中所述羟基活化基团是甲磺酰氧基、对甲苯 磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、九氟丁磺酰氧基、对硝基苯甲酰氧基或膦酰氧基。
12.权利要求1-10中任一项所述方法，其中所述羟基活化剂是甲磺酰卤、三氟甲磺酰 卤、甲苯磺酰卤、九氟丁磺酰卤、甲磺酸酐、三氟甲磺酸酐、甲苯磺酸酐、九氟丁磺酸酐或其 组合。
13.权利要求1-10中任一项所述方法，其中B是磺酰基、羧基或膦酰基。
14.权利要求13所述方法，其中B是磺酰基，其选自甲磺酰基、三氟甲磺酰基、甲苯磺酰 基或九氟丁磺酰基。
15.权利要求1-14中任一项所述方法，其中所述亲核试剂中的X是NR2，其中R1和R2各 自独立地是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基 烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺酰基芳基、酰 基或反应性官能团。
16.权利要求1-15中任一项所述方法，其中所述钯催化剂包含至少一种钯源。
17.权利要求16所述方法，其中所述钯源是乙酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯或其组口 O
18.权利要求1-16中任一项所述方法，其中所述钯催化剂包含至少一种膦配体或卡宾 配体。
19.权利要求18所述方法，其中所述膦配体是外消旋_2，2’-双(二苯基膦基)-1， 1，-联二萘(BINAP)、1，1，_双(二苯基膦基)二茂铁((1 0、2-(二环己基膦基)联苯、三 环己基膦、三苯基膦、三-叔丁基膦、9，9-二甲基-4，5-双(二苯基膦基)咕吨(Xantphos)、 2- ( 二-叔丁基膦基)联苯或外消旋-2- ( 二叔丁基膦基)-1，1’ _联萘。
20.权利要求1-19中任一项所述方法，其中所述羟基保护基是苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、异丙氧 基羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2_三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、 2-糠基氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙酰基、甲酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苄 氧基乙酰基、苯甲酰基、甲基、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1，1-二甲 基-2-丙烯基、3-甲基-3- 丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯基甲基、三苯基甲基 (三苯甲基)、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2，2，2_三氯乙氧基甲 基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基 甲硅烷基或三异丙基甲硅烷基。
21.权利要求1-20中任一项所述方法，其中所述反应性官能团衍生自丙烯酰胺、酰叠 氮、酰卤、腈、醛、酮、烷基卤、烷基磺酸酯、酸酐、芳基卤、炔、醇、胺、羧酸、碳二亚胺、重氮烷、 环氧化物、卤代乙酰胺、羟胺、胼、亚氨酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酸酯或磺酰卤。
22.式(VIII)的荧光团化合物或其盐
23.式(XIII)的荧光团化合物或其盐
24.权利要求23所述荧光团化合物，其中R1与R3相同，且R2与R4相同。
25.权利要求22-24中任一项所述荧光团化合物，其中K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和 Kltl各自独立地为H。
26.权利要求22-25中任一项所述荧光团化合物，其中K1、K3、K4、K6、K7、K8、K9和Kltl各 自独立地为H ；K2和K5各自独立地为氯或氟。
27.权利要求22-26中任一项所述荧光团化合物，其中R1和R2各自为烷基。
28.权利要求22-27中任一项所述荧光团化合物，其中R1和R2各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基。
29.权利要求22-28中任一项所述荧光团化合物，其中R1是氢，R2是烷基。
30.权利要求22-29中任一项所述荧光团化合物，其中所述反应性官能团衍生自丙烯 酰胺、酰叠氮、酰卤、腈、醛、酮、烷基卤、烷基磺酸酯、酸酐、芳基卤、炔、醇、胺、羧酸、碳二亚 胺、重氮烷、环氧化物、商代乙酰胺、羟胺、胼、亚氨酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酸酯或 磺酰卤。
31.权利要求22-30中任一项所述荧光团化合物，其中所述羟基保护基是苄氧基羰基、 4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、 异丙氧基羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2_三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基 羰基、2-糠基氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙酰基、甲酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰 基、苄氧基乙酰基、苯甲酰基、甲基、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1， 1- 二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3- 丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯基甲基、三苯基甲基(三苯甲基)、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2，2，2-三氯乙氧 基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三 乙基甲硅烷基或三异丙基甲硅烷基。
32.示踪、检测、测量或筛选生物物质的方法，其中所述方法包含以下步骤a)使权利要求22-31中任一项所述荧光团化合物与所述生物物质接触，以形成荧光化 合物；以及b)测量所述荧光化合物的荧光性质。
33.如权利要求32所述方法，其中所述生物物质包括来自动物的蛋白质、DNA、酶、抗 体、细胞器、细胞、组织、药物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂质。
34.权利要求32所述方法，其中所述动物是人。
35.示踪或检测样品中的生物物质的高通量荧光筛选方法，其中所述高通量方法包含 以下步骤a)使权利要求22-31中任一项所述荧光团化合物与所述样品接触，以形成一种或多种 荧光化合物；以及b)测量所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述样品中生物物质的量。
36.权利要求35所述方法，其中所述生物物质包括来自动物的蛋白质、DNA、酶、抗体、 细胞器、细胞、组织、药物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂质。
37.权利要求36所述方法，其中所述动物是人。
全文摘要
本文提供包括对甲氨基酚和若丹明化合物的可用作荧光标记和/或荧光探针的荧光团化合物及其制备方法。本文还提供可用来示踪、测量、检测或筛选生物物质的方法，所述生物物质如或有机体中的蛋白质、DNA、酶、抗体、细胞器、细胞、组织、药物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂质。具体而言，所述方法包括以下步骤使本文所公开的荧光团化合物、对甲氨基酚化合物和若丹明化合物中的任何种与生物物质接触，以形成一种或多种荧光化合物，以及测量荧光化合物的荧光性质。本文还提供用于检测或筛选生物物质的高通量荧光筛选方法。
文档编号G01N21/77GK101983194SQ200980112496
公开日2011年3月2日 申请日期2009年4月3日 优先权日2008年4月3日
发明者彭涛, 杨丹 申请人:港大科桥有限公司;晨兴创投有限公司