专利名称：Aβ寡聚物的测定方法
技术领域：
本发明涉及到Αβ寡聚物的测定方法。
背景技术：
阿尔茨海默氏病(AD)是一种神经变性疾病，其具有认知能力的进行性缺失、脑中 淀粉状蛋白沉淀、神经原纤维变性和神经细胞的缺失等神经病理学特征。近年来，淀粉样蛋白β (Α β)肽的寡聚物在神经性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、 轻微认知障碍MCI (mild cognitive impairment)、唐氏综合征)中的作用备受关注，有文 献报道Αβ (1-42)寡聚物是致病性结构基础，其形成是阿尔茨海默氏病的初期病理学事件 (Journal of Neurochemistry，2005，95，834-847)。此外，有文献报道具有相对较高分子量的寡聚物，特别是12聚物对记忆损伤有更 大影响(Vo 1440, Number 7082，2006，p. 352-357，nature)。所以，期待Αβ寡聚物测定方法的开发对于阿尔茨海默氏病的初期诊断和Αβ寡 聚物治疗药物的开发有效。可以通过Wfestern印迹法测定A β寡聚物，但是，由于^iestern印迹法难以分析多 个试样，所以希望开发出通过ELISA法测定Αβ寡聚物的方法。作为通过ELISA法测定A β寡聚物的方法例，非专利文献1中公开了使用4G8抗 体的夹心EIA法来测定A β寡聚物O 3聚物)的例子。此外，非专利文献2中公开了使用6Ε10抗体的夹心EIA法来检测A β寡聚物的例子。此外，非专利文献3中公开了使用2F12抗体或者6Ε10抗体的夹心EIA法来检测 Aβ寡聚物的例子。此外，非专利文献4中公开了使用2F12抗体的夹心EIA法来检测寡聚物的例子。此外，非专利文献5中公开了使用2F12抗体的夹心EIA法来检测寡聚物的例子。专利文献1 国际公开第94/17197号册子非专利文献1 =LeVine 等，Analytical Biochemistry, 335 (2004) p. 81-90非专利文献2 =Yang 等，The Journal of Biological Chemistry, 2005 年， Vol. 280，No. 7，p. 5892-5901非专利文献3 =HOffLETT 等，Biochem. J.，1999 年，340，p. 283-289非专利文献4 :WARD 等，Biochem. J.，2000 年，348，ρ· 137-144非专利文献5 =Howlett 等，FEBS Letters, 1997 年，417，p. 249-25
发明内容
发明要解决的问题尽管如此，有文献报道，Αβ寡聚物中的高分子量寡聚物呈现强毒性，因此希望开 发出基于ELISA法测定A β寡聚物的方法，特别是选择性测定较高分子量的A β寡聚物的方法。解决问题的方法本发明者等经过深入研究，结果发现通过使用识别由序列号1所示氨基酸序列 组成的部分肽的单克隆抗体作为第1抗体，并使用经标记的该第1抗体作为第2抗体，可以 检出Αβ寡聚物，特别是可以选择性地测定分子量较高的Αβ寡聚物，并更加深入地研究， 完成了本发明。S卩，本发明提供了下述内容(1) 一种A β寡聚物的测定方法，其包括下述步骤步骤(a)使可能含有Αβ寡聚物的试样与结合于不溶性载体的、识别由序列号 1所示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第1抗体)接触，从而使Aβ寡聚物与第1 抗体结合的步骤，步骤(b)使步骤(a)中结合了第1抗体的Αβ寡聚物与经标记的、识别由序列号 1所示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第2抗体)反应的步骤。(2)上述⑴中所述的方法，其中，识别由序列号1所示氨基酸序列组成的部分肽 的单克隆抗体是BAN50a。(3)上述(1)中所述的方法，其中，Aβ寡聚物为至少9聚物。(4)上述(1)中所述的方法，其中，Aβ寡聚物为至少12聚物。(5)上述(1)中所述的方法，其中，经标记的单克隆抗体(第2抗体)是经Fab片 段化的(或称为Fab片段)。(6)上述(1)中所述的方法，其中，Αβ寡聚物是Αβ (1-40)、Αβ (1-42)、 A β (1-43)、或它们的N末端截短产物、它们的修饰物或者它们的混合物的寡聚物。(7) 一种Αβ寡聚物的测定试剂盒，所述Aβ寡聚物包含(a)结合于不溶性载体的单克隆抗体BAN50a (第1抗体)，和(b)经标记的单克隆抗体BAN50a (第2抗体)。(8)上述(7)中所述的测定试剂盒，其是涉及A β寡聚物的神经性疾病的诊断剂。(9) 一种筛选抑制Αβ寡聚物形成的化合物的方法，其包括采用上述(7)中所述的 测定试剂盒来测定Aβ寡聚物。(10) 一种涉及Αβ寡聚物的神经性疾病的诊断方法，其包括采用上述(7)中所述 的测定试剂盒来测定Aβ寡聚物。(11) 一种涉及Αβ寡聚物的神经性疾病的治疗方法，其包括采用上述(7)中所述 的测定试剂盒来测定Aβ寡聚物。发明效果按照本发明的Αβ寡聚物的测定方法，可以选择性地测定分子量较高的Αβ寡聚 物。附图简要说明
图1所示为凝胶过滤后的Αβ 42溶液中的蛋白质浓度。图2所示为凝胶过滤后的A β 42溶液中各级分的分析结果。图3所示为姜黄素抑制A β寡聚物形成的分析结果。图4所示为基于A β 42单体换算的A β寡聚物的校正曲线。
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图5所示为阿尔茨海默氏病患者和健康人各自的Αβ寡聚物分析结果。发明的实施方式本说明书中所述“测定”，不仅表示对量的测定，也包括仅对存在的检出。本发明的Αβ寡聚物的测定方法中，使用识别由序列号1所示氨基酸序列组成的 部分肽的单克隆抗体。序列号1为Αβ (1-16)的氨基酸序列。[序列号1]Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys作为该单克隆抗体，特别优选单克隆抗体BAN50a。单克隆抗体BAN50a为国际公开W094-17197号小册子中所述的公知的抗体，可以 按照该专利文献所述方法制造。此外，单克隆抗体BAN50a，可以按照公知的方法，通过使用 保存在专利生物保藏中心(原通商产业省工业技术院生命工学技术研究所)的保藏号为 FERM BP4163杂交瘤制造。本发明的Αβ寡聚物的测定方法包括下述步骤(a)和步骤(b)。其操作步骤可以 按照常用的ELISA法进行。步骤(a):使含有Αβ寡聚物的试样与结合于不溶性载体的、识别由序列号1所 示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第1抗体)接触，从而使Aβ寡聚物结合于第 1抗体上的步骤。步骤(b)使步骤(a)中结合了第1抗体的A β寡聚物与经标记的识别由序列号 1所示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第2抗体)反应的步骤。步骤(a)中所用的“结合于不溶性载体的、识别由序列号1所示氨基酸序列组成 的部分肽的单克隆抗体(第1抗体)”，可以按照常用的蛋白质不溶化(固定化)方法制造。该不溶化(固定化)可以使用物理吸附，此外，也可以采用通常蛋白质或者酶等不 溶、固定化所用的化学结合的方法。例如，优选使用生物素_(链霉)抗生物素蛋白系统。作 为本发明所用的载体，可以列举琼脂糖、葡聚糖和纤维素等不溶性多糖，聚苯乙烯、聚丙烯 酰胺和硅橡胶等合成树脂，以及玻璃，但是并不限定于上述内容。上述“识别由序列号1所示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第1抗体)” 结合不溶性载体后，可以视情况而定，使用市售的封闭剂，进行封闭处理。步骤(b)中所用的“经标记的识别由序列号1所示氨基酸序列组成的部分肽的单 克隆抗体(第2抗体)”，可以按照常用的蛋白质标记方法制造。作为所述标记所用的标记剂，可以使用如放射性同位素、酶(例如辣根过氧化酶 (horse-radish peroxidase ；HRP))、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素，可以列举 125I、131I、3H、WC等。作为酶，优选稳定且比活性大的酶，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、 碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。作为荧光物质，可以列举荧光胺和异硫氰酸荧光 素。作为发光物质，可以列举鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、硝酸双-N-甲基吖啶。作为待 标记的单克隆抗体，可以使用单克隆抗体的IgG、Fab片段、Fab，片段或者F(ab’)2片段(优 选Fab片段或者Fab’片段)。例如，使用辣根过氧化酶标记时，可以按照常规方法，将单克 隆抗体的IgG或者Fab片段结合于辣根过氧化酶上。含有(或者可能含有)Αβ寡聚物的试样，可以按照例如下述方法制备。
[方法1]将Αβ 1-42(例如可以从PEPTIDE INSTITUTE INC.得到)溶解于HFIP，使其浓度 为ImM，以IOyL的量分别注入到微量离心管中，使用蒸发器干燥。随后，在_30°C以下冷冻 保存。使用DMSO(二甲基亚砜)溶解经冷冻保存的合成Αβ肽至10yL，再用生理学缓冲液 (磷酸缓冲液、PBS、DMEM (Dulbecco改良培养基)、F12培养基等)调节最终浓度为10 μ Μ, 在冰冷却室等保温一定时间(例如一昼夜)。[方法2]将来源于患有(或者可能患有)涉及Αβ寡聚物的神经性疾病(例如阿尔茨海 默氏病、MCI、唐氏综合征)的受试者、老年人、或者阿尔茨海默氏病病因基因过表达的转基 因小鼠等的生物体试样(例如，脑的一部分、生物血液、脑脊液)，在冰冷却条件下，使用含 有例如蛋白酶抑制剂混合物的Tris缓冲液提取上述试样，作为测定用试样。本发明的方法优选用于分析含有(或者可能含有)9聚物以上的高分子(例如约 40kd 200kd)寡聚物(特别优选12聚物以上(例如12聚物 32聚物)的寡聚物)的试 样。步骤(a)和步骤(b)可以逐次进行，也可以同时进行，优选在步骤(a)之后实施步 骤(b)。步骤(b)结束后，洗去未结合A β寡聚物的第2抗体。然后根据标记剂的种类，通 过测定标记剂的信号来测定试样中的Aβ寡聚物。进一步具体来讲，本发明可以基于例如下述实施例1的方法进行。按照本发明的Αβ寡聚物的测定方法，可以测定含有Αβ (1-16)或其一部分(例 如Αβ (3-16))的Αβ或其修饰物或者它们的混合物的寡聚物。作为这样的Αβ，可以列举 A β (1-40) ,A β (1-42) ,A β (1-43)和它们的 N 末端截短体(例如 A β (3-42) ,A β (3-42)和 A β (3-43))。Aβ (1-40) ,Aβ (1-42)、Αβ (1-43)、Αβ (3-40)、Αβ (3-42)和 Αβ (3-43)的氨基酸 序列如下所示。〔Αβ (1-40)〕序列号2Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val〔Αβ (1-42)〕序列号3Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala〔Αβ (1-43)〕序列号4Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr〔Αβ (3-40)〕序列号5Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val〔Αβ (3-42)〕序列号6Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala〔Αβ (3-43)〕序列号7Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr作为上述修饰物，可以列举焦谷氨酸化物等N末端修饰物以及氨基酸取代物等。 可以按照本领域技术人员常用的方法实施上述修饰。此外，上述修饰物也可以从天然样品 中得到。按照本发明的Αβ寡聚物测定方法，可以选择性地测定9聚物以上的高分子(约 40kd 200kd)寡聚物(特别优选12聚物以上(例如12聚物 32聚物)的寡聚物)而不 实质上测定2 6聚物。本发明还提供测定A β寡聚物的试剂盒，其含有(a)结合于不溶性载体的单克隆抗体BAN50a (第1抗体)和(b)经标记的单克隆抗体BAN50a (第2抗体)。这样的试剂盒中，除了(a)结合于不溶性载体的单克隆抗体BAN50a (第1抗体)；和(b)标记的单克隆抗体BAN50a (第2抗体)，之外，还可以包括ELISA法所需要的各种试剂和器材。可以使用该试剂盒实施本发明的测定方法，可以选择性地测定9聚物以上的高分 子(约40kd 200kd)寡聚物(特别优选12聚物以上(例如12聚物 32聚物)的寡聚 物)。通过使用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒测定A β寡聚物，可以筛选 (Screening)抑制Αβ寡聚物形成的化合物。例如，通过(1)向原代神经细胞的培养液中添加被检化合物后，利用本发明的测定方法或者 本发明的测定试剂盒测定其培养上清液中Αβ寡聚物的量，选择具有使该量降低的活性的 化合物，或者(2)利用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒测定给与了被检化合物的动 物脑内的A β寡聚物的量，选择具有使该量降低的活性的化合物，可以筛选(kreening)抑制Αβ寡聚物形成的化合物。进一步具体而言，该方法可以基于例如下述实施例2的方法实施。此外，通过使用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒测定Αβ寡聚物，使 得涉及Αβ寡聚物的神经性疾病(例如阿尔茨海默氏病、轻微认知障碍MCI、唐氏综合征) 的分析成为可能。本发明特别适用于阿尔茨海默氏病。
例如，通过使用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒测定Αβ寡聚物，可 以诊断涉及Αβ寡聚物的神经性疾病。即，本发明的测定试剂盒可以作为涉及Αβ寡聚物 的神经性疾病的诊断剂使用。具体而言，例如，通过使用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒测定受试 者脑脊液中的Αβ寡聚物的量，可以诊断涉及Αβ寡聚物的神经性疾病的有无以及病情进
展程度。此外，通过使用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒，测定患有相关疾 病的患者在接受了涉及Αβ寡聚物的神经性疾病的预防或者治疗剂后脑脊液等中的Αβ 寡聚物含量，从而可以评价该药物的药效。这样的药物可以列举Αβ聚集抑制剂(例如 Alzhemed)、Α β产生降低剂(例如Flurizan、LY_450139)和抗A β (包含寡聚物型)抗体。即，本发明的测定方法及本发明的测定试剂盒可以用于涉及Αβ寡聚物的神经性 疾病的预防或者治疗剂治疗效果的监测，也可以用于临床试验药物的评价。阿尔茨海默氏病患者中，脑内的Αβ寡聚物量也有很大差异。在此推测脑脊液中 Αβ寡聚物量较多的患者脑内的Αβ寡聚物量也较多，通过使用本发明的测定方法或者本 发明的测定试剂盒测定受试者脑脊液中的Αβ寡聚物量，可以为涉及Αβ寡聚物的神经性 疾病的预防或者治疗药品(例如Αβ寡聚物形成抑制剂)的临床试验选择更加合适的患 者ο进一步地，通过使用本发明的测定方法或者本发明的测定试剂盒测定涉及Αβ寡 聚物的神经性疾病患者的脑脊液等中的Αβ寡聚物含量，可以为患者选择更加适当的治疗 方法，即因人制宜的治疗。通过将本发明的方法及测定试剂盒与测定tau、磷酸化tau、sAPP α或者APP β等 的方法，或者测定其他的Αβ (Αβ1-40、Αβ1-42或它们N末端截短物)的方法结合使用，可 以诊断神经性疾病(例如阿尔茨海默氏病、MCI、唐氏综合征)的有无以及病情进行程度。
实施例下文将通过实施例和试验例更加详细地对本发明加以说明，但本发明并不限定于 这些例子。下述实施例中的缩略号如下所示。HRP 辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)下述实施例中使用的各种ELISA使用如下缓冲液实施。[缓冲液]包被缓冲液A (0. IM碳酸缓冲液，pH9. 6)封闭缓冲液B(25% Block Ace，溶于 PBS)缓冲液C(pH7. 0、20mM 磷酸缓冲液，10 % Block Ace、0. 2 % BSA、0. 05 % Merthiolate (TM) Na (硫柳汞钠)、400mM NaCl、0. 076% CHAPS、2mMNa2EDTA，56°C条件下加热 处理30分后，冷藏室保存)实施例1通过使用BAN50a和HRP标记的BAN50a的ELISA法(寡聚物A β的定量)实施以 下步骤。
(1)将BAN50a抗体溶解于包被缓冲液A至浓度为10 μ g/ml (75 μ 1/孔)，添加至 EIA96 孔平板(high maximum binding clear plate，Greiner 公司)后，在冷藏室(约 4°C )
保温一昼夜。(2)使用PBS (不含钙、镁；以下亦简称为PBS (_))洗涤3次，再添加100 μ L/孔的 封闭缓冲液B，并保存。(3)实验当天，弃去封闭缓冲液B，使用PBS (_)洗涤2次，再添加25 μ 1缓冲液C。(4)将含有标准单体 A β 1-42 [Α β 1-42 TFA 盐(PEPTIDE INSTITUTE INC.)溶解于 DMSO中至浓度为ImM，进一步使用F12培养基(GIBCO)稀释为10 μ M，并以Iml分装，在冷藏 室(约_4°C)中静置一昼夜，使用缓冲液C将上述静置后的溶液(该溶液中形成了寡聚物) 稀释至以标准单体浓度换算值计为1 μ M的溶液，分装后在-80°C保存。使用时，采用试样缓 冲液将分装后的1 μ M溶液稀释成2倍稀释系列(以A β 1-42换算浓度为10 0. 0097ηΜ)， 作为标准。]的溶液制备成以相当的Αβ单体浓度计从IOOnM浓度至0. 390625ηΜ的2倍稀 释系列。将试样稀释至适宜浓度，确认其落入标准曲线，以IOOyL/孔的量添加至平板。(5)试样放置在冷藏室(约4°C )保温一昼夜。(6)使用PBS㈠洗涤平板4次。(7)使用缓冲液D将HRP标记的BAN50a(测定生物体内试样时(即体内的情况下) 为Fab' -HRP)稀释5000倍，将其作为第2抗体以75yL/孔的量添加。上述第2抗体委托 专业技术人员(和光纯药)制造。(8)室温条件下保温3小时以上。(9)使用PBS㈠洗涤平板6次。(10)将TMB底物(Kirkegaard&Perry公司)以75 μ 1/孔的量添加至各平板，并在
室温条件下培养。(11)然后，向反应后的底物溶液中添力IM磷酸溶液(75 μ 1/孔)，停止反应，使用 multi-label counter (PerkinElmer 公司)测定 OD450。实施例2按照下述方法，研究被测化合物对寡聚物形成的影响。(1)使用DMSO溶解A β 1-42，使其浓度为300 μ Μ。(2)制备具有适当组成的反应液，加入试管中。[反应液的组成例(Αβ1-42的最终反应溶液中，A β 1-42浓度为3 μ Μ，化合物为
3 μ M)]A β 1-42 (300 μ Μ)1 μ L姜黄素溶液(300μ Μ)IuLF12 培养基98 μ L共计IOOyL(3)在4°C条件下培养试管1昼夜。(4)使用缓冲液C(上述)将反应液稀释100倍，按照上述的ELISA法测定。(5)以溶媒(vehicle)组作为100%，计算抑制率。试验例1鉴定了实施例1的ELISA体系所识别的寡聚物A β的分子种类。将A β 1-42 TFA盐(PEPTIDE INSTITUTE INC.)溶解在DMSO中，使其浓度为ImM，进一步使用F-12培养基溶 解，使其浓度为ΙΟμΜ，在4°C条件下，培养处理一昼夜。然后，使用滤膜(0.45μπι)对本试 样进行前处理，随后，向凝胶过滤柱中注入300 μ L0凝胶过滤采用Waters公司的Alliance 系统，联用Biosuite 450、125两个柱子，以PBS (-)作为洗脱缓冲液，选用lmL/min的流速， 在冰冷却室中将其洗脱。此外，采用Amersham公司的低分子量、高分子量两种标记物系列 进行分子量校正。在Excel (微软公司)中，以Log(分子量)作为Y轴，以洗脱时间作为X 轴，作图进行校正。在0D = 280nm条件下监测蛋白质的量(图1)。此外，使用缓冲液C将 经洗脱分级的试样液稀释10倍以上，采用实施例1的ELISA体系进行分析。其结果，采用 实施例1的ELISA体系。未检测到单体和分子量较低的寡聚物O聚物 6聚物)，而以高 敏感度检测到了 17分钟至19分钟洗脱的高分子寡聚物(12聚物 32聚物)(图2)。试验例2按照实施例2，分析公知可抑制寡聚物A β的形成的姜黄素(Curcumin)对高分子 寡聚物A β形成的抑制作用。向Αβ 42溶液中添加不同浓度的姜黄素后，采用实施例1的 ELISA，研究姜黄素对寡聚物Aβ形成的影响。结果发现，寡聚物Αβ的信号特异性地降低。 结果如图2所示。为了对照，采用ELISA对识别单体的BAN50a-HRP标记BCOfe和BNT77a_HRP 标记 BC05a 进行了相同的分析(基于 Asami-Odaka A, Ishibashi Y, Kikuchi T, KitadaC, Suzuki N. ，Long amyloid beta-protein secreted from wild-type humanneuroblastoma IMR-32 cells. Biochemistry. 1995 Aug 15 ；34(32) : 10272-8所述方法进行。)的结果一并 示于图3。试验例3将BAN50a抗体以10 μ g/ml的浓度溶解于0. IM碳酸缓冲液(pH9. 6)，将其添加 (75 μ 1/孔)至96-孔聚苯乙烯平板(FLU0TRAC(商标)600、GreinerBio-One公司)后， 在4°C条件下培养M小时。使用PBS(-)(不含Ca、Mg的PBS、DULBECC0' S PBS,大日本 住友制药试验产品部)洗涤平板3次，以100μ 1/孔的量添加封闭缓冲液(PBS(-)/0. 8% BlockAce (大日本住友制药试验产品部)/0.01% Merthiolate Na (硫柳汞钠))，并在4°C 条件下保存。实验当天弃去封闭缓冲液，用PBS(-)洗涤2次，并向各孔中加入25μ1的试 样缓冲液(0. 02Μ 磷酸缓冲液 /0. 4% BlockAce/0. 2% BSA/0. 05% Merthiolate Na(硫柳 汞钠)/0. 4MNaCl/0. 076% CHAPS/2mM Na2EDTA)。使用加入(1 片 /5ml) 了 蛋白酶抑制剂 (complete,Mini, Roche Diagnostics公司)的2倍浓度的试样缓冲液将阿尔茨海默氏病患 者脑脊液(对照组为健康受试者脑脊液)稀释2倍，以100 μ 1的量加入至各孔中。此外， 将Αβ 1-42TFA盐(PEPTIDE INSTITUTE INC.)溶解于DMSO中使其浓度为ImM，进一步地使 用F12培养基(GIBCO)稀释至浓度为10 μ M，以Iml的量分装，并使用在冷藏室(约_4°C ) 静置了一昼夜的缓冲液C稀释至1 μ Μ,分装后，在-80°C保存。使用时，采用试样缓冲液将 分装后的1 μ M溶液稀释成2倍稀释系列(以A β 1-42单体换算浓度为2. 5 0. 0097ηΜ)， 作为标准。即，将每次试验时，以按照完全相同的程序制成的Αβ 1-42溶液O倍稀释系列， ΙΟΟμΙ/孔)中存在的Αβ 42寡聚物作为标准。将添加了使用缓冲液C稀释的试样和标 准溶液的平板放置在4°C条件下，保存M小时后，使用PBS (-)洗涤4次，以100 μ 1/孔的 量添加HRP标记的BAN50a抗体(1000 5000倍稀释液)，在室温条件下培养3小时。培 养后使用PBS (-)洗涤平板6次，然后以100 μ 1/孔的量添加化学发光底物(SuperSignalELISAFemto, PIERCE 公司)，使用发光检测仪(Iuminometer) (SpectraMax L(商品名)， Molecular Devices公司)定量发光强度。标准曲线的结果如图4所示，脑脊液试样的测定 结果如图5所示。如图5所示，使用该方法，能够显著地区分阿尔茨海默氏病患者和健康受 试者的脑脊液中的Αβ寡聚物浓度。
权利要求
1.一种Αβ寡聚物的测定方法，其包括下述步骤步骤(a)使可能含有Αβ寡聚物的试样与结合于不溶性载体的、识别由序列号1所 示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第1抗体)接触，从而使Aβ寡聚物与第1抗 体结合的步骤，以及步骤(b)使步骤(a)中结合了第1抗体的Αβ寡聚物与经标记的、识别由序列号1所 示氨基酸序列组成的部分肽的单克隆抗体(第2抗体)反应的步骤。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中，识别由序列号1所示氨基酸序列组成的部分 肽的单克隆抗体是BAN50a。
3.根据权利要求1中所述方法，其中，Αβ寡聚物为至少9聚物。
4.根据权利要求1中所述方法，其中，Αβ寡聚物为至少12聚物。
5.根据权利要求1中所述方法，其中，经标记的单克隆抗体(第2抗体)是经Fab片段 化的。
6.根据权利要求1中所述方法，其中，Αβ寡聚物是Aβ (1-40) ,A β (1-42) ,A β (1-43), 或者它们的N末端截短产物、它们的修饰物或它们的混合物的寡聚物。
7.—种Αβ寡聚物的测定试剂盒，其包含(a)结合于不溶性载体的单克隆抗体BAN50a(第1抗体)，和(b)经标记的单克隆抗体BAN50a(第2抗体)。
8.权利要求7中所述的测定试剂盒，其是涉及Aβ寡聚物的神经性疾病的诊断剂。
9.一种筛选抑制Αβ寡聚物形成的化合物的方法，其包括采用权利要求7中所述的测 定试剂盒来测定A β寡聚物。
10.一种涉及Αβ寡聚物的神经性疾病的诊断方法，其包括采用权利要求7中所述的测 定试剂盒来测定A β寡聚物。
11.一种涉及Αβ寡聚物的神经性疾病的治疗方法，其包括采用权利要求7中所述的测 定试剂盒来测定A β寡聚物。
全文摘要
本发明提供一种采用ELISA法测定Aβ寡聚物的方法，特别是选择性测定具有较高分子量的Aβ寡聚物的方法。Aβ寡聚物的测定方法包括如下步骤步骤(a)使可能含有Aβ寡聚物的试样与结合于不溶性载体的单克隆抗体(第1抗体)接触，使Aβ寡聚物结合于第1抗体上的步骤，所述单克隆抗体可以识别由序列号1所示氨基酸序列组成的部分肽；步骤(b)步骤(a)中结合了Aβ寡聚物的第1抗体与标记的单克隆抗体(第2抗体)反应的步骤，所述单克隆抗体可以识别由序列号1所示氨基酸序列组成的部分肽。
文档编号G01N33/543GK102089659SQ200980126298
公开日2011年6月8日 申请日期2009年5月7日 优先权日2008年5月8日
发明者德田隆彦, 福元宏明 申请人:武田药品工业株式会社