专利名称：快速检测膝沟藻毒素gtx2/3的酶联免疫试剂盒及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测赤潮毒素的检测器具，一种麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)的快速检测试剂盒。特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的单克隆抗体，并涉及利用单克隆抗体与GTX2/3抗原结合，而分析检测生物样品中的麻痹性毒素含量的快速方便检测试剂盒的制法。
背景技术：
赤潮灾害日益严重，已成为一种全球性的海洋生态灾害。赤潮是目前我国海洋环境中最严重的生态灾害之一。我国赤潮海域逐年扩大，灾害逐年加重，每年因赤潮造成的经济损失非常巨大。赤潮生物通过分泌毒素，危害海洋动物及人类健康，不但可导致海水增养殖鱼虾贝大量死亡；而且由于食用含有贝毒的鱼虾贝等海产品，可导致人体发生中毒，甚至死亡，从上世纪60年代至今，我国已发生赤潮毒素中毒人数650多人，死亡40多人。麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)是我国近岸海域最常见的赤潮生物毒素或贝毒之一，在近岸海域贝类体内经常检出。Alexandrium tamarense等多种藻可以产生麻痹性贝毒。麻痹性贝毒(PSP)是一类具有四氢嘌呤结构的化合物，呈碱性，易溶于水，在弱酸和低温条件下比较稳定，碱性条件下发生氧化。现已发现此类化合物有20多种，根据R4基团的不同可以分为四类，分别是①氨基甲酸脂类毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)，新石房蛤毒素(neosaxiton，neoSTX)，膝沟藻毒素 GTX1、GTX2、GTX3、 GTX4 ；② N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括 GTX5 (Bi)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3 和 C4 ；③脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，包括 dcSTX、deneoSTX、 dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 ；④脱氧氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoyl toxins)，包括 doSTX、doGTXldoGTX2。在这些化合物中，STX、neoSTX、GTXU GTX2、GTX3、GTX4 的毒性较大；dcSTX、deneoSTX、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 毒性较小；GTX5(B1)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3和C4毒性最小。麻痹性贝毒在全世界沿海都有分布，因赤潮生物种类及其地理分布不同，主要成分也不同，在温带海域最常见的毒素是GTX2、GTX3和STX，我国南方海域麻痹性赤潮毒素组份与此相似。麻痹性贝毒可在滤食性贝类体内大量积累，贝类被人类食用后，会导致中毒，使人四肢面部肌肉麻痹、头痛恶心，甚至窒息死亡。这类毒素主要作用于神经细胞和肌肉细胞的钠离子通道，阻断钠离子内流，妨碍动作电位的形成，因此表现出神经中毒的特征。目前国际上普遍使用的麻痹性贝毒分析方法是生物小鼠法，用盐酸在高温下提取藻类或贝体中的麻痹性毒素，然后对小鼠进行腹腔注射，根据小鼠的死亡时间判断毒性大小。但是在提取过程中有可能导致贝毒化合物的结构转化而改变毒性，同时用小鼠法测定贝毒含量存在误差大、重现性差，可比性低的缺点。高效液相色谱技术(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是目前分析鉴定麻痹性贝毒的准确有效方法，其原理是PSP毒素在碱性条件下氧化生成荧光物质，进行荧光检测。但其缺点是仪器及分析试剂昂贵、标准物质缺乏，样品前期处理麻烦，操作复杂，难以现场应用。目前国际普遍流行的简单快速准确的贝毒检测方法是酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbantassay, ELISA)，其优点是样品前处理简便，操作简单，灵敏度较高，方便迅速，能大批量检测样品，可应用于现场监测。其原理是抗体高度特异地与抗原分子结合，通过抗原-抗体的特异性识别反应来进行检测，既能定性又能定量，具有灵敏、简单和专一的特点。在多肽激素、 肿瘤标记、细胞因子、药物监控化合物、传播抗原等领域，得到了广泛的应用。近年来，我国每年均有在贝中检测出麻痹性贝毒的报道，时有中毒及死亡的事件发生，已严重的影响了贝类进出口贸易发展，引起各级政府及消费者的极大关注。建立麻痹性贝毒的快速灵敏准确的检测技术和产品，对确保海产品食用安全及维持贝类养殖的健康发展具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述麻痹性贝毒检测技术的不足，提供一种特异、敏感和简便的快速检测麻痹性贝毒的酶联免疫检测试剂盒；提供一种抗麻痹性贝毒单克隆抗体的制备，并利用抗麻痹性贝毒单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析膝沟藻毒素GTX2/3的试剂盒，简单易操作，适于现场、快速、大批量样品的分析检测。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种快速检测麻痹性贝毒的快速酶联免疫试剂盒，包括使用甲醛连接法，按一定反应比例将石房蛤毒素STX偶联到血蓝蛋白 (KLH)上，经透析提纯偶联物，用150μ g加佐剂充分乳化，腹腔注射免疫BALB/C鼠，加强免疫数次后，取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，阳性检测、克隆筛选、扩大培养及诱生腹水制得抗麻痹性贝毒主要组分膝沟藻毒素GTX2/3和石房蛤毒素STX的单克隆抗体； 用合成的STX-卵清蛋白(STX-OVA)包被96孔酶标板，加入GTX2/3标准品或样品，再加入稀释的单克隆抗体Mab-PSP，包被抗原中的GTX2/3与自由的GTX2/3竞争抗体Mab-PSP，自由的GTX2/3和抗体复合物被洗去，与包被抗原STX结合的抗体STX-Mab-PSP再与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，经底物显色，终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，样品中自由的GTX2/3含量越少，对照标准品回归的方程或曲线，计算样品中GTX2/3的含量。本技术发明的有益效果是利用制得的含特异性抗GTX2/3或STX的单克隆抗体， 所研制的酶联免疫检测试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒的检出限小于15ng/ml。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点本发明的检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫检测试剂盒，具有特异性强，检测灵敏度高(可达15ng/ml)，检测快速，前处理简单，检测成本低，操作简单易掌握等优点。麻痹性贝毒的酶联免疫检测试剂盒，包括已包被有包被抗原的可拆96孔酶标板 (8孔X 12条)、洗液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、底物溶液、抗麻痹性贝毒的单克隆抗体；96孔可拆酶标板板条上预先包被有合成的包被抗原(麻痹性贝毒半抗原与蛋白偶联物)。所述抗麻痹性贝毒的单克隆抗体为用石房蛤毒素-血蓝蛋白偶联物免疫Balb/c 小鼠，经细胞融合，筛选得到抗麻痹性贝毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系分泌的。所述试剂盒为检测麻痹性贝毒的主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的试剂盒。所述快速检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫试剂盒的制法，其步骤包括
1、将石房蛤毒素与载体蛋白偶联，制备得到石房蛤毒素-载体蛋白偶联物；2、用石房蛤毒素-血蓝蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到分泌抗膝沟藻毒素GTX2/3和石房蛤毒素STX的单克隆抗体的杂交瘤细胞系；3、制备抗膝沟藻毒素GTX2/3单克隆抗体；4、将步骤1制得的石房蛤毒素STX与卵清蛋白偶联的抗原包被在96孔酶标板上；5、将抗膝沟藻毒素GTX2/3单克隆抗体、待测样品及标准品加入步骤4制得的孔中反应；6、再加入酶标二抗、底物及终止液，得到检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素 GTX2/3的酶联免疫试剂盒。所述快速检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫试剂盒在检测膝沟藻毒素GTX2/3中的应用。本发明借助酶标记的二抗标记显色的抗体抗原免疫反应，用以制备快速检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的竞争抑制酶联免疫试剂盒，结构更加合理，应用合成的半抗原与血蓝蛋白偶联物免疫小鼠，经细胞融合制备抗麻痹性贝毒单克隆抗体，选用石房蛤毒素STX与卵清蛋白偶联的抗原作为包被抗原，利用抗体与包被抗原、以及样品或标准品中的自由半抗原的竞争反应，建立竞争抑制酶联免疫技术快速检测待测样品中是否含有麻痹性贝毒。通过待检样品中的麻痹性贝毒半抗原与包被在96孔酶标板上的毒素半抗原共同竞争抗麻痹性贝毒单克隆抗体，经酶标二抗及底物的显色反应后，出现深浅不同的蓝色，加入终止液后变为深浅不同的黄色。若待测样品颜色极浅或无色，则判断为强阳性样品，即待测样品中膝沟藻毒素GTX2/3浓度很高；若待测样品颜色极深(深黄色)与空白对照接近，则判断为阴性样品，即待测样品中软海绵酸的浓度小于15ng/mL ；各孔颜色经酶标仪测定吸光度值，与标准品浓度和吸光度值绘制的曲线对照，可定量计算样品中的膝沟藻毒素GTX2/3含量。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点本发明的检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫试剂盒，具有特异性强，检测灵敏度高(可达15ng/mL)，检测快速(同时检测96个样本只需ao，前处理简单，检测成本低，操作简单易掌握等优点。
具体实施例方式实施例1(制备实施例)检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的竞争抑制酶联免疫试剂盒制备方法1、石房蛤毒素-载体蛋白偶联物的制备将石房蛤毒素(STX)溶于0.002M的乙酸钠缓冲液中，加入溶于磷酸盐缓冲液 (ρΗ7. 0)的血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(0VA)，25°C反应72小时，再4°C过夜。将反应混合物透析3d，40C，每1 换液1次。制备得到STX-KLH和STX-OVA偶联物备用。2、抗麻痹性贝毒单克隆抗体的制备利用制备的石房蛤毒素-血蓝蛋白偶联物(STX-KLH)作为免疫原，免疫6 8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用150 μ g STX-KLH与等体积完全弗氏佐剂，充分乳化后， 腹腔注射小鼠，第3、5、7、9、11周取同量STX-KLH与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化，腹腔注射。取尾血测定小鼠血清效价，待效价大于要求值后，用同量STX-KLH的PBS溶液腹腔注射进行加强免疫，三天后取脾细胞融合。取生长状态良好的骨髓瘤SP2/0细胞与免疫的小鼠脾细胞按1 8的比例混合， 加入PEG进行细胞融合。融合后接种于96孔细胞培养板中，在20%血清的HAT培养基中选择培养，7天后换HT培养液，取细胞培养液上清ELISA检测。选取阳性细胞孔，用有限稀释法克隆，筛选可稳定分泌抗麻痹性贝毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。取8周龄健康BALB/c 雌性小鼠或杂交一代鼠，腹腔注射液体石蜡0. 5mL/每只，待用。1500r/min离心收集对数生长期的阳性杂交瘤细胞，悬浮于生理盐水中，浓度为106/mL。在石蜡油处理的小鼠腹腔内注射0. 5mL杂交瘤细胞悬液诱生腹水，收集腹水，3000r/min离心lOmin，收集上清液即为含单克隆抗体腹水。腹水用辛酸硫酸氨方法得到粗制抗体蛋白，再用0. OlM的PBS缓冲液 (ρΗ7· 4)透析3天。3、检测膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫试剂盒组装及制备用步骤1中合成的STX-OVA偶联物按一定比例用碳酸盐缓冲液(pH = 9. 6)稀释后包被96孔酶标板，过夜后，用的聚乙烯醇封闭后，4°C保存待用；同时将麻痹性贝毒标准品(已知浓度)、洗液、底物溶液和终止液分装于小瓶中，组装的试剂盒保存在4°C至少3 个月。实施例2 (应用实施例)检测膝沟藻毒素GTX2/3的竞争抑制酶联免疫试剂盒的使用方法1、贝类样品处理称取贝类勻浆3g，加;3ml(0. 00125M HCL 稀 16 倍，pH = 4. 16)，搅勻，煮沸 5min， 3000r/min离心lOmin，取上清液进行分析。2、检测将STX-OVA偶联物作为包被抗原，用碳酸盐缓冲液(pH 9. 6)稀释后加入96孔酶标版(ΙΟΟμ ν孔)，湿盒中4°C过夜；弃去残液，经洗液(PBS-Tween20)清洗3次，拍干后， 每孔加入含有PVA的PBS溶液300μ L于37°C下孵育封闭3h，封闭完后置于4°C冰箱中备用(可保存至少3个月)。测定时，弃去封闭液，洗板3次，拍干，加入50 μ L系列稀释的GTX2/3标准物质溶液或贝类样品萃取液，再加入50 μ L适当稀释的特异性抗麻痹性贝毒单克隆抗体，振摇混勻，37°C孵育Ih ；洗板、拍干，加入适当稀释的HRP标记的羊抗兔第二抗体，每孔10(^。371孵育401^11 ；洗板、拍干，每孔加底物溶液100yL，37°C显色13min,以 2mol/LH2S04中止反应(50 μ L/每孔)，450nm波长测量吸光度值(OD)。以GTX2/3标准品的浓度对吸光度值绘制标准曲线，样品的吸光度值与标准孔和空白对照孔的吸光度值比较得出GTX2/3的含量。实施例3 (应用实施例)检测麻痹性贝毒GTX2/3的间接竞争酶联免疫技术的应用1、GTX2/3特异性抗体效价及最适工作浓度实验免疫开始后，于第五、七周分别取免疫鼠尾血，采用直接ELISA方法测定血清滴度 (效价)。免疫5次后，效价可达1.1万以上。细胞融合后制得的单克隆抗体腹水效价达 1. 8万以上。经方阵滴定试验，在直接ELISA法中，根据不同倍数稀释的单抗腹水吸光度值， 取吸光度值1.2 1.7范围，得出包被抗原的最适稀释比为1 800 ；羊抗兔酶标二抗的最适稀释比为1 20000，通过直接ELISA方法测定腹水最适稀释比为1 800，工作稀释比为 1 550。2、回收率试验向样品中分别添加GTX2/3标准，使其最终提取后的浓度为0. 87ng/y 1,0. 22ng/ μ 1、0. 1，每个浓度做3个平行测定，用建立的GTX2/3间接竞争酶联免疫方法进行 GTX2/3含量测定，与添加的GTX2/3量比较，计算得到回收率。在174 870ng/ml浓度范围内，GTX2/3的回收率为75% 90%。可以满足定量分析检测方法的要求。
权利要求
1.一种分泌特异性单克隆抗体的融合细胞株。
2.一种专门识别麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的单克隆抗体，它是由权利要求1所述的细胞株产生的。
3.含权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是检测膝沟藻毒素GTX2/3 的试剂盒。
4.一种快速检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆板条、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，其特征是在96孔酶标板可拆板条上已包被有合成的蛋白偶联物的包被抗原。
5.权利要求4所述的一种快速检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的间接竞争酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其步骤包括(1)将麻痹性贝毒石房蛤毒素(& it0Xin，STX)与载体蛋白偶联，制备得到STX-载体蛋白偶联物；(2)用石房蛤毒素STX-血蓝蛋白偶联物免疫BALB/C鼠，经细胞融合、筛选得到抗麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3单克隆抗体；(3)将石房蛤毒素STX-卵清蛋白偶联物，包被在96孔酶标板上，封闭液封闭；(4)将生物样品萃取液、空白缓冲液或GTX2/3标准液加入到(3)制得的孔中，再加入 (2)制得的含特异性单克隆抗体腹水；(5)经孵育反应、酶标二抗标记、底物显色反应及终止方应，得到所述的检测检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫试剂盒。
6.权利要求3-4任一项所述的试剂盒在检测检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素 GTX2/3中的应用。
全文摘要
本发明涉及检测麻痹性贝毒的检测技术，特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗麻痹性贝毒的单克隆抗体，并涉及利用单克隆抗体与膝沟藻毒素GTX2/3抗原结合，而分析生物样品中膝沟藻毒素GTX2/3含量的快速检测试剂盒的制法。一种快速检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆板条、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，利用制得的含特异性抗膝沟藻毒素GTX2/3单克隆抗体，在96孔酶标板上包被有合成的蛋白偶联物的包被抗原。本发明试剂盒具有前处理简单、易操作，适于现场、快速、大批量样品的检测等优点，试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒的检出限小于15ng/ml。
文档编号G01N33/543GK102296049SQ201010217448
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者刘仁沿, 刘磊, 梁玉波, 许道艳 申请人:国家海洋环境监测中心