专利名称：一种夹心式单面孵育方法及其免疫印迹方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，是蛋白检测方法和技术的运用，特别涉 及免疫印迹中一种节约型、夹心式的单面孵育抗体或检测试剂的方法及应用该孵育方法的 免疫印迹方法。
背景技术：
免疫印迹法(Western blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技 术相结合的杂交技术，该技术主要用于检测特定的组织或细胞提取物中特定蛋白。其基本 原理为利用SDS-PAGE电泳分离蛋白质混合物，随后将凝胶上分散开的蛋白质转移到固相 载体(如聚乙二烯二氟化物膜，又称PVDF膜；硝酸纤维素膜)上，非共价键形式吸附蛋白质 的固相载体能够保持电泳分离的多肽类型和蛋白质的生物学活性不变。随后，以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原，与特异性的初级抗体发生免疫反应，再与酶或同位素标记的 次级抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性蛋白的表达。运用此项技术，可以检测一种蛋白的大致的分子量和不同样本中某种蛋白的相对 含量(Renart et al. , 1979 ；Towbin et al.，1979)。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度 高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法；该方法被广泛 应用于分子生物学，生物化学，免疫遗传学等生物学领域。在标准的免疫印迹实验中，抗体 能够特异性地与成百上千种的蛋白混合物中的一种蛋白即靶蛋白结合达到特异识别抗原 的目的。因此，抗体特异性的强弱和其质量的高低是免疫印迹实验成功与否的决定性因素。 目前，很多的抗体已经商品化生产，易于获得；但是商品化的抗体价格相对昂贵，其购买费 用不菲。基于此，任何节约抗体的使用但不影响免疫印迹的实验结果的方法对于解决抗体 的费用问题都是非常有用的。目前，已有研究者利用热密封袋或者密封的塑料袋，在袋子中将膜与抗体进行孵 育，或者直接将抗体添加到转移有蛋白印迹的膜的那一侧等方法来降低免疫印迹实验中对 抗体等试剂的消耗。然而，第一种节约试剂的方法需要特殊的密封袋，而且在放置膜的时 候，需要格外小心以防止膜的折叠。而添加抗体至膜的一侧的孵育方法中，抗体极易从膜上 流出，从而使得转移有蛋白印迹点的膜干燥，影响免疫印迹的实验结果。Canzler等研发了 只需100 μ 1或更少量的稀释后的抗血清的微小印迹方法(Canzler et al.，2009a ；CanzIer et al., 2009b) 0该方法对使用有限的样品利用不同的抗体同时检测不同的蛋白表达时非 常有用，但是操作过程更为复杂，对于常规的免疫印迹检测而言，该方法既不经济也不简 便。虽然不同实验中未与抗原结合的剩余抗体可以反复利用，但是重复使用的抗体中有效 抗体的数量和质量却很难度量和控制，在实验中应用这些抗体降低了对免疫印迹的结果的 预测和控制。参考文献Canzler, U. , Bartsch, H. , Grossmann, K. , Lehmann, W. , Conrad, K. , Kurien, B. Τ. , Dorri, Y. , Scofield, R. H. , Bachmann, Μ. , 2009a. A miniaturized blotting system
3for simultaneous detecting of different autoantibodies. Methods Mol. Biol. 536, 129-137.Canzler, U. , Bartsch, H. , Ulitzsch, S. , Kurien, B. Τ. , Dorri, Y. , Scofield, R. H., Grossmann, K. , Lehmann, W. , Pilarsky, C. , Denz, A. , Grutzmann, R. , Conrad, K. , Schmitz, Μ. , Rieber, E. P. , Distler, W. , Bachmann, M. P. , 2009b. Detection of autoantibodies to tumour-associated antigens in sera of patients with systemic autoimmunity using a novel protein microblot array. Scand. J. Immunol. 69,563-569.Renart, J. ,Rei ser, J. , Stark, GR. , 1979. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethy 1-paper and detection with antisera -.a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad.Sci.U.S.A.76, 3116-3120.Towbin, H. , Staehelin, Τ. , Gordon, J. ,1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets :procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76,4350-4354.
发明内容
本发明旨在解决常规的免疫印迹实验中利用浸泡式孵育方法检测目的蛋白表达 的时候所用抗体和检测试剂较多，实验成本较高等问题。本发明所公布的夹心式单面孵育 的方法在节省抗体和检测试剂的同时并不影响免疫印迹实验的结果，验证其可以作为一种 新的孵育方法应用于免疫印迹实验。本发明是通过以下技术方案来实现一种免疫印迹分析中夹心式单面孵育方法，利用石蜡膜-抗体或检测试剂-固相 载体膜组成三明治式的夹心孵育，将所述固相载体膜上转移有蛋白质印迹的一面朝向所述 抗体或所述检测试剂进行单面孵育，以此代替常规的浸泡式孵育。所述的夹心式单面孵育方法，所述固相载体为PVDF膜和纤维素膜之一。所述的夹心式单面孵育方法，所述抗体为初级抗体或次级抗体。一种应用上述任一所述单面孵育方法的免疫印迹分析方法，利用石蜡膜_抗体或 检测试剂_固相载体膜组成三明治式的夹心孵育，将所述固相载体膜上转移有蛋白质印迹 的一面朝向所述抗体或所述检测试剂进行单面孵育，以此代替常规的浸泡式孵育。所述的免疫印迹分析方法，所述固相载体为PVDF膜和纤维素膜之一。所述的免疫印迹分析方法，其特征在于，所述抗体为初级抗体或次级抗体。本发明公布了一种节约型、夹心式单面孵育抗体和检测试剂的免疫印迹的方法， 此方法能节省80 %的抗体的使用。这种单面孵育的新方法的操作步骤与常规的孵育方法的 比较见图1。本发明从检测内源性和外源性的不同表达水平的蛋白的表达，以及新的孵育方法 和传统的孵育方法的检测结果的比较等，验证了新的孵育方法的可靠性；结果表明该方法 能够作为一种有效的节约抗体和检测试剂的免疫印迹方法。
图1为采用夹心式、单面孵育法(抗体和检测试剂)和浸泡式孵育法(抗体和检 测试剂)的免疫印迹方法的操作步骤比较；图2为准备石蜡膜；图3为滴加稀释后的抗体形成微阵列；图4为Iml稀释抗体在石蜡膜上形成的微阵列与在容器中形成的大液体的比较；图5为PVDF膜的最左端与抗体液滴呈线性接触；图6为PVDF膜、抗体、石蜡膜形成夹心，实现单面孵育；图7为免疫印迹检测HEK-293细胞内源性β -肌动蛋白的表达；左图为采用夹心 式单面孵育抗体和检测试剂的方法的免疫印迹实验结果，右图为采用浸泡式孵育抗体和检 测试剂的方法的免疫印迹实验结果。所用初级抗体为抗-β-肌动蛋白的鼠单克隆抗体(货 号 sc-47778，Santa Cruz 生物公司)；图8为免疫印迹检测外源性融合蛋白的原核诱导表达；利用夹心式单面孵育抗体 和检测试剂的方法，免疫印迹检测外源性融合蛋白在Ε. coli细胞的诱导表达；“_”和“ + ”分 别表示未诱导和IPTG诱导后的融合蛋白的表达。所用的初级抗体为抗His标签抗体(货 号 Sc-803，Santa Cruz 生物公司)；图9为免疫印迹检测原核表达的融合蛋白对IMR90细胞的跨膜转导；利用夹心 式单面孵育抗体和检测试剂的方法，免疫印迹检测图8所得的融合蛋白经纯化后在TAT跨 膜结构域的帮助下穿透IMR90细胞膜，在IMR90细胞内的聚积情况。所用的特异性抗体 购自Santa Cruz生物公司，分别是抗-c-Myc抗体(货号Sc_40)、抗_0ct3/4抗体(货号 Sc-5279)和抗-Sox2 抗体(货号 Sc-20088)。
具体实施例方式本发明首先利用夹心式单面孵育和常规的浸泡式孵育两种方法检测了人胚肾293 细胞(HEK-293)的内源性肌动蛋白的表达；在此结果之上，进一步检测了这种新的孵育 方式是否可以用于检测转染细胞或转化细胞中外源性蛋白的表达。下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I、蛋白样品的获得(1)收集细胞胰酶细胞消化液(含0. 05% Trypsin和0. 02% EDTA的PBS缓冲 液)消化收集293细胞，通过常温1500rpm离心5min去除培养液并收集细胞团；(2)裂解细胞添加有蛋白酶抑制剂的一定量的RIPA缓冲液(150mM的氯化钠， 1% triton X-100，1 %去氧胆酸钠，0. 1 % 的 SDS，50mM 的 Tris-HCl，pH值 7. 5，2mM EDTA)重 悬细胞团，于冰上孵育30min以裂解细胞；(3)收集裂解液细胞裂解液经4°C 14，OOOrpm离心5min，将裂解液上清转移至洁 净的1. 5ml离心管；(4)测定蛋白含量=Bio-Rad蛋白分析仪测量上清液中总蛋白的含量；11、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)煮样含40yg总蛋白的细胞裂解液与等体积的含有5.0%的β-巯基乙 醇的Laemmli上样缓冲液(货号161-0737，Bio-Rad生物公司)混勻后，95°C加热5min，
540C 14，OOOrpm离心5min，收集上清液；(2)上样取40yg蛋白样品和10μ 1 BenchMark 预染蛋白分子量标准(货 号10748-010，Invitrogen生物公司)上样至15-孔4-20. O % Tris-HCl预制胶(货号 161-1123，Bio-Rad 生物公司)；(3)蛋白电泳利用 PowerPac Universal 电泳仪(货号 IM-5O7O, Bio-Rad 生物 公司)，在IOOV的电压下电泳30min，然后再调整为120V的电压下电泳90min ；III、转膜(半干式转移)(1)准备聚乙二烯二氟化物膜(PVDF膜)剪裁适量大小的PVDF膜，于甲醇中浸泡 15min，去离子水漂洗2次，随后将膜平衡于Ix转移缓冲液(25mMTris，192mM甘氨酸，10% 甲醇)中直至使用；(2)转膜聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，按从上至下顺序为“滤纸-凝胶-PVDF 膜-滤纸”放置PVDF膜和凝胶，形成“三明治夹心”模式。最后，利用Trans-Blot SD半干 转膜仪(货号170-3940，Bio-Rad生物公司)，在20v的电压下转膜Ih ；IV、酶联免疫定位(1)封闭蛋白转膜完成后，标记转移有蛋白印迹的PVDF膜的那一侧，将PVDF膜 浸泡在30ml的含有5. 0%脱脂奶粉的TBST缓冲液组成的封闭液中(TBST缓冲液为含有 0. 1% Tween-20的TBS缓冲液)，于4°C过夜孵育或者室温孵育60min ；(2)与初级抗体孵育利用含有的脱脂奶粉的封闭液稀释抗-β-肌动蛋白的 鼠单克隆抗体(货号sc-47778，Santa Cruz生物公司)至终浓度为0. 1 μ g/ml。封闭后的 PVDF膜经IxTBST缓冲液漂洗3次，每次5min后，分别用如下两种方法与初级抗体孵育。①传统的浸泡式孵育方法将初级抗体放在一个小的容器中，将PVDF膜浸泡于稀 释的抗体液中。以85mmX60mm的PVDF膜为例，使用传统的浸泡式孵育抗体方法，至少需要 5ml的稀释后的抗体。②夹心式单面孵育抗体的方法a、裁减1. 5倍于PVDF膜大小的石蜡膜，并将洁净的石蜡膜平铺于一个洁净的开放 容器中(如图2所示)。b、利用20 μ 1的移液器，将Iml稀释后的初级抗体以每滴10_15 μ 1的量，均勻地 滴加于石蜡膜上，最后形成每平方厘米2滴稀释抗体的微阵列，如图3、图4所示。c、用平头镊子将PVDF膜的一边固定，并使转移有蛋白的PVDF膜的那一侧面向抗 体微阵列。d、将PVDF膜的最左端与抗体液滴接触(图5)，随后从左至右慢慢地、轻柔地(大 约10S)让PVDF膜与石蜡膜上的抗体液滴充分接触，并注意不要产生气泡(如图6左图所 示)°e、PVDF膜与抗体夹心式单面孵育上后，盖上容器的盖子以防止抗体溶液的挥发， 将PVDF膜置于4°C过夜孵育。(3)与次级抗体孵育lx TBST缓冲液漂洗与抗体过夜孵育的PVDF膜，每次漂洗 5min;漂洗3次后再按此前的各自不同的孵育方法与1 2000稀释后的辣根过氧化物酶标 记的山羊抗鼠的次级抗体(货号1858413，PIERCE生物公司)室温孵育lh。(4)目的蛋白检测与抗原结合的抗体，可以通过增强的化学发光检测得到(ECL)(货号sc-2048，Santa Cruz生物公司)；同时与发光底物的孵育也再次使用两种不同的孵
育方式。(5)成像最后，利用LAS-3000成像系统检测目的蛋白。V、检测效果分析如图7所示利用单面孵育抗体(图7左图)和传统的浸泡式孵育抗体(图7右 图)两种方法的免疫印迹实验结果比较。比较结果显示，由单面孵育抗体的方法获得的结 果与传统的孵育方法获得的结果一致。本实验进一步检测了这种新的孵育方式是否可以用于检测转染细胞或转化细胞 中外源性蛋白的表达。首先，利用重组质粒转化大肠杆菌E.coli，在ImM IPTG的诱导下表 达融合蛋白(his-TAT-c-Myc，his-TAT-0ct4和his-TAT-Sox2)。分别来自于未诱导和IPTG 诱导的转化细胞的IOug的细胞裂解液上清经凝胶电泳、蛋白转膜等同前的操作程序进行 免疫印迹分析，利用抗His标签的抗体(货号Sc-803，Santa Cruz生物公司)检测目的蛋 白在E. coli中的诱导表达，结果如图8所示。此外，不同浓度的纯化后的融合蛋白被添加到培养于24孔的组织培养皿中人的 成纤维细胞IMR90的培养液中。融合蛋白与IMR90细胞孵育8h后，收集整孔的IMR90细 胞以检测融合蛋白在IMR90细胞内的积聚情况。原理上，融合蛋白可以在TAT跨膜结构域 的帮助下穿越细胞膜进入到细胞内。同样利用单面抗体孵育的免疫印迹方法和特异性的 抗体(抗-c-Myc抗体货号Sc-40 ；抗_0ct3/4抗体货号Sc_5279 ；抗-Sox2抗体货号 Sc-20088 ；Santa Cruz生物公司)检测IMR90细胞内融合蛋白的聚积情况。所有的初级抗 体均被稀释至0. 1 μ g/ml (此抗体浓度是标准的免疫印迹的最佳浓度)。从图9所示的免疫 印迹的结果可以看出，夹心式单面孵育抗体的方法可以用于检测外源基因的表达。实验数据显示，夹心式单面孵育抗体的方法在节约抗体使用的同时并不影响免疫 印迹的结果，能够给出与传统的浸泡式孵育方法一样的结果。本发明的抗体孵育方式也适用于免疫印迹中检测试剂与PVDF膜上抗原的孵育， 即用石蜡膜-检测试剂-PVDF膜组成三明治式的夹心，将PVDF膜转移上有蛋白质印迹的一 侧面向检测试剂进行单面孵育。如图1所示，本发明的单面孵育方法也可用于检测试剂与 PVDF膜上抗原的孵育，图中化学发光底物即为检测试剂。本发明公布的夹心式单面孵育抗体方法的最主要优点是能节约免疫印迹实验中 大约80%的初级抗体、次级抗体和化学发光试剂等的消耗。由于免疫印迹中利用发光氨底 物检测靶抗原的强的灵敏性，在此试验中仅利用了发光氨检测方法，但是利用DAB或TMB的 比色法分析的免疫印迹试验中，运用此孵育方法，同样可以达到节约抗体和检测试剂的效 果。由此，采用传统的孵育方式做一次免疫印迹实验所用的抗体(初级抗体和次级抗体) 和检测试剂可以完成5次的采用新的单面孵育的免疫印迹实验。本发明提供的新的孵育方 法对解决免疫印迹实验中昂贵的抗体费用和检测试剂费用问题提供了技术支持。
权利要求
一种夹心式单面孵育方法，其特征在于，利用石蜡膜 抗体或检测试剂 固相载体膜组成三明治式的夹心孵育，将所述固相载体膜上转移有蛋白质印迹的一面朝向所述抗体或所述检测试剂进行单面孵育，以此代替常规的浸泡式孵育。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体为PVDF膜和纤维素膜之一。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体为初级抗体或次级抗体。
4.一种应用权利要求1至3任一所述单面孵育方法的免疫印迹方法，其特征在于，利用 石蜡膜-抗体或检测试剂-固相载体膜组成三明治式的夹心孵育，将所述固相载体膜上转 移有蛋白质印迹的一面朝向所述抗体或所述检测试剂进行单面孵育，以此代替常规的浸泡 式孵育。
5.根据权利要求4所述的免疫印迹方法，其特征在于，所述固相载体为PVDF膜和纤维素膜之一。
6.根据权利要求4所述的免疫印迹方法，其特征在于，所述抗体为初级抗体或次级抗体。
全文摘要
本发明公开了一种在免疫印迹实验中节约型、夹心式单面孵育抗体和检测试剂的方法，该方法包括以下内容1)用石蜡膜-抗体-聚乙二烯二氟化物膜(PVDF膜)组成三明治式的夹心，将PVDF膜上转移有蛋白质印迹的一面朝向抗体进行单面孵育；2)用石蜡膜-检测试剂-PVDF膜组成三明治式的夹心，将PVDF膜上转移有蛋白质印迹的一面朝向检测试剂进行单面孵育。单面孵育抗体的方法所得结果不受目标蛋白的表达水平的限制，在节省80％的抗体和检测试剂的同时其检测结果与传统的免疫印迹方法所得结果一致。本发明提供的新的孵育方法对解决免疫印迹实验中昂贵的抗体费用和检测试剂费用问题提供了技术支持。
文档编号G01N33/543GK101893637SQ20101022895
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者潘传英, 蓝贤勇, 陈宏 申请人:西北农林科技大学