专利名称：高效定量分析小鼠耳蜗听觉神经元和毛细胞的体视学方法
技术领域：
本实用新技术属于基础医学实验研究技术，该技术发明采用生物医学实验室常规的组织样品制备术，结合体视学软件控制的显微镜观察和成像技术，用厚度为40微米的树脂包埋的耳蜗连续切片，对耳蜗的听觉神经元和毛细胞进行定量的形态学分析，该技术属于耳蜗细胞病理分析实验技术。
背景技术：
小鼠内耳的听觉感受器-柯迪氏器是一个非常精细和娇嫩的器官，小鼠的柯迪氏器长度仅约6毫米。鉴于小鼠在听力研究中的重要地位，建立高效的小鼠耳蜗组织学切片法和定量分析柯迪氏器的听觉神经元、内毛细胞和外毛细胞的技术非常必要。柯迪氏器的感受器细胞和耳蜗听觉神经元的数量是判断听力功能正常与病理变化的重要基础指标。用传统的耳蜗组织平面制备技术获得的平铺蜗管片段可用相差显微镜和扫描电镜对听觉细胞进行细胞病理分析[1_3]，这种耳蜗平铺制备法对于观察和分析整个耳蜗的听觉细胞形态变化非常有效。但这个技术有缺陷，在显微解剖切割螺旋窝管时螺旋神经元 (SGN)容易丢失，并有将螺旋窝管纽曲展平的嫌疑。该技术经改进尽管克服了 SGN丢失的缺陷，但用该技术制备的耳蜗片段不适用于无偏见的体视学方法估算耳蜗的SGN的总数M。为了定量分析耳蜗的毛细胞和SGN，研究者采用不同的耳蜗制备法定量毛细胞和 SGN，例如用左耳蜗定量SGN的密度，而用右耳蜗定量毛细胞[5_6]。以上的耳蜗制备技术都需要很高的解剖技巧和熟悉耳蜗的组织结构，并且要花费大量的时间。计算机辅助的三维图象重建用于毛细胞损伤丢失和位置测量方法的建立，克服了传统耳蜗制备方法的一些缺点，但大量图象的比较和拼接仍需花费很多时间。最近几年，有研究者采用激光共聚焦显微镜技术和三维图象重建术对树脂包埋经免疫细胞化学染色的耳蜗组织进行细胞形态学和立体学研究[7]，这种方法能特异性标记听觉毛细胞和SGN，并在耳蜗细胞频率图上定位损伤和丢失的毛细胞，尽管这一方法样品制备较容易，制备好的样本可用多种途径进行研究，但其缺点是荧光素与树脂的相容性较差，标记抗体不易穿透整体包埋的耳蜗，因此要获得清晰的图象也非易事。我们采用实验室常规的制备电镜观察标本的树脂包埋法制备耳蜗材料，将包埋的耳蜗组织切成厚的连续切片，用体视学分析软件和计算机精确控制的电动三维显微镜平台在显示器上示踪细胞的形态、损伤丢失和频率位置，用体视学分析软件对耳蜗总的SGN的数量进行无偏见的定量分析[8]，用一个耳蜗组织就能进行听觉毛细胞和SGN的定量分析， 这一方法大大缩短了从样品制备到分析数据获得的时间，另外样品制备不需要很高的解剖技术。参考文献1. Engstrom, H. , Ades, H. W. and Andersson, A. (The Williams and Wilins Co., Baltimore,1966).2. Bohne, B. A. Location of small cochlear lesions by phase contrastmicroscopy prior to thinsectioning. Laryngoscope 82,1-16 (1972).3. Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hear Res 24,179-187(1986).4. Bohne, B. A. & Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identifygross, cellular and subcellular pathology. Hear Res 109, 34-45(1997).5. Keithley, E. M. & Feldman, M. L. The spiral ganglion and hair cells of Bronx waltzer mice. HearRes 12,381-391(1983).6.Spoendlin, H. & Schrott, A. The block surface method for evaluation of human inner ears. ActaOtolaryngol Suppl 436, 25-36(1987).7. Hardie, N. A. , MacDonald, G. & Rubel,E.W.A new method for imaging and 3D reconstructionof mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res 1000,200-210(2004).8. Ishiyama, A. , Agena, J. , Lopez, I. &Tang, Y. Unbiased stereological quantification ofneurons inthe human spiral ganglion.Neurosci Lett 304, 93-96(2001).
发明内容
采用生物医学实验室制备电镜样本的常规树脂包埋法，制备小鼠耳蜗包埋块。用传导均勻的金属加热块紧贴在切片钢刀上，由温度控制仪调节切片钢刀的温度，使切片钢刀能切出厚度均勻的树脂切片。切片时刀韧垂直于耳蜗蜗轴，从耳蜗的顶端开始切片，直到耳蜗管基部。按顺序收集耳蜗连续切片，将系列切片铺展在载玻片上，放在加热的展片台上展平，等切片与室温平衡后用树胶封片。封片后的系列切片在显微镜下镜检，发现盖片下有气泡，要用不锈钢药勺轻压盖片把气泡从切片组织处赶走。将镜检后的切片放在室温中干燥2天，即可用于显微镜下定量分析和测量。本技术发明通过技术的集成和创新，解决了以往用切片机切出的系列厚片，不能用体视学测量分析软件对耳蜗毛细胞进行细胞形态学的定量测量和分析的问题，实现了用体视学测量软件在同一个耳蜗的切片上，对螺旋神经元的无偏见的数量估值，对毛细胞的形态及数量进行定量测试和分析。要解决的技术问题(1)用可调温度的切片钢刀切出厚度均勻的切片。(2)耳蜗系列切片按顺序拼接起来。( 用体视学分析软件测量耳蜗片段的曲线长度、毛细胞的损伤丢失数量。(4)解决相邻的耳蜗片段在显微镜下识别和拼接的问题。技术方案本实验新技术解决其技术问题所采用的技术方案是(1)根据包埋块的硬度调节切片刀的温度，钢刀的温度和切片的角度是获得好切片的关键，将耳蜗轴垂直于切片刀，切片厚度设为40·。(2)用低倍物镜获取耳蜗系列切片的图象，将图象打印在A4纸上，根据图象的拼接处的特点，按从耳蜗顶端到基部的顺序标上序号，在用高倍镜观查时按标记顺序进行测量。( 用体视学分析软件控制的xyz三维可精确移动的显微镜载物台调控切片的移动，用高清晰的数码相机获取图象，在显示器屏幕上画图和对细胞作标记，采用高倍微分干涉相差物镜60x或40x观察测量毛细胞，根据毛细胞顶端stereocilia (听纤毛)的排列形态和缺失判断毛细胞的损伤程度或丢失，毛细胞丢失用两项指标stereocilia和细胞核同时消失。相邻的耳蜗片段的接头处有凹凸相吻的结构特点，有时stereocilia在一个片段上，而毛细胞的核在紧邻的另一个片段上，用Mereoinvestigator软件的标记功能， 用不同的记号标记stereocilia和细胞核，用软件的画轨迹功能边聚焦观察区边用鼠标画出内外柱细胞顶板的交会线，从切片的表面聚焦观察到底面画出耳蜗片段的曲线，标记该曲线的方向。再将毛细胞的损伤丢失位置标记在曲线图的两侧，当一个片段观察完后，把画的图象和标记存入电脑。根据片段接头处的形态特点和标记，可以确定片段的顺序并得到细胞丢失的数目。(4)将整个耳蜗的全部片段观察测量完毕，通过分析处理存储的图象及数据，就能得到毛细胞损伤丢失的数据和相对应的频率位置。( 用同样的耳蜗连续切片，对螺旋神经元作客观的总体数量估值[8]。有益效果本实验新技术的有益效果是，用切片机代替手工制备耳蜗连续切片，用体视学软件对耳蜗切片的听觉螺旋神经元和毛细胞进行定量分析，该新技术极大地提高了实验效率，仅需原有手工平面制备技术十分之一的时间就可完成一个耳蜗的定量分析，并且仅用一个耳蜗材料就能同时对听觉螺旋神经元和毛细胞进行客观定量的细胞病理分析。
权利要求
1.一种高效定量分析小鼠耳蜗听觉神经元和毛细胞的体视学方法，其特征是用体视学软件控制的三维可精确移动的显微镜载物台，对切片机切出的厚度均勻的耳蜗连续切片进行操作，用微分干涉相差法观察切片组织细胞，用数码成象技术在显示器上获取图象，并对组织切片进行曲线测量、细胞标记和片段识别拼接。该方法用一个耳蜗组织就能完成对听觉神经元和毛细胞的定量细胞形态分析。
2.根据权利要求1所述的高效定量分析小鼠耳蜗听觉神经元和毛细胞的体视学方法， 其特征是用常规的电镜样品包埋法对耳蜗组织进行包埋和切片，获得连续厚切片用于对听觉毛细胞进行分析测量和记数。
3.根据权利要求1所述的高效定量分析小鼠耳蜗听觉神经元和毛细胞的体视学方法， 其特征是用体视学软件对耳蜗听觉毛细胞损伤丢失和所处频率位置的定量分析。
全文摘要
“高效定量分析小鼠耳蜗听觉神经元和毛细胞的体视学方法”属于基础医学实验研究技术领域。该项发明要解决的技术问题是如何应用体视学分析软件对耳蜗听觉神经元和毛细胞的形态学作定量分析。解决该问题的技术要点是用切片机获得厚度均匀的切片，用体视学软件控制的三维可精确移动的显微镜载物台，采用微分干涉相差观察法和数码成象技术，在显示器上获取图象，并对耳蜗切片进行曲线测量、细胞标记和片段识别拼接。该技术主要用于对小鼠耳蜗的听觉神经元和毛细胞进行定量细胞病理分析。
文档编号G01N1/06GK102401789SQ20101027873
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者沈海雁 申请人:南京大学