专利名称：一种用于评价中药复方治疗脓毒症药效的新方法
技术领域：
本发明涉及中药复方的药效评价方法。
背景技术：
脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，是创伤、烧伤等危重患者重要的死亡原因之一，也是I⑶病房病人死亡的第一大原因[1]。流行病学调查显示，美国 1995年有75万例脓毒症发生，其中有21万例死亡；法国2001年有6万例脓毒症患者死亡。我国每年患各种感染病人达2亿人次，发热病人达3亿人次，全身炎症反应综合征病人达3000万人次。每年脓毒症病人超过300万人，因此造成多脏衰的死亡人数高达50万人以上。尽管对其治疗给予巨大的投资，严重脓毒症的病死率仍居高不下，病死率始终徘徊在 28%到50%之间。更为严重的是，在最近20年中，严重脓毒症的发生率增加了 75%，其发病率增高的原因尚不十分清楚，可能与免疫抑制病人增多、侵入性治疗检查的增加、微生物耐药、老年人人口的增长有关。有关专家预计，随着人口老龄化的进程，到2020年，仅在美国每年就会有100万例以上脓毒症病例发生[2_1(|]。因为脓毒症可以形成脓毒性休克液可以造成多个功能衰竭而引起死亡。脓毒症问题具有全球性的威胁和挑战，其平均治疗费用很高，美国约为2. 2万美元/例，年耗资近200 个亿，欧洲年耗资近100亿，随着发病率的激增，对国民经济的发展也是一个沉重负担。脓毒症的临床治疗一直主要依靠液体复苏、广谱抗生素、低剂量糖皮质激素、血糖控制、活化蛋白C等支持疗法。对于脓毒症的治疗，国际脓毒症联席会虽然推出了 “2004 严重脓毒症和脓毒症休克治疗指南”，但其实际上并没有创新的治疗方法，只是对现行的一些治疗方法的总结或重新评估，旨在为临床医生提供治疗严重脓毒症或脓毒性休克的指南，有助于改善患者预后，但要真正实现2002年巴塞罗那宣言中“降低25 %死亡率”的目标尚有距离。总的来说，目前对脓毒症的治疗效果还非常差。由于过度炎症反应是脓毒症的重要特征，一直以来，现代医学的治疗策略一直针对促炎因子。人们曾试用抗内毒素抗体、抗TNF-α抗体、IL- 1受体拮抗剂、磷脂酶A2拮抗剂、PAF拮抗剂、抗氧化剂、凝血酶抑制剂、皮质激素、Y-干扰素、粒细胞集落刺激因子 (GM-CSF)等治疗，尽管某些治疗在实验动物中取得良好效果，但在病人中未能提高治愈率及生存率。中医没有脓毒症的概念，但自春秋战国时的《黄帝内经》至汉代张仲景的《伤寒论》 与六经辨证，清代叶天士的《温热论》与卫气营血辨证，都是以急性感染性疾病而论著，且几千年来治疗了大量病人，积累了丰富的经验。根据其临床特点，中医学可将其归属于伤寒、 温病的范畴。可以说几千年的中医学发展历史中始终贯穿着对“脓毒症”的研究，即中医学在治疗脓毒症方面积累了丰富的经验。自上个世纪70年代，国内以王今达教授、王宝恩教授等为代表开展的中西医结合治疗本病的临床与基础研究，国内北京友谊医院、北京中医药大学东直门医院、天津市第一中心医院、天津市中西医结合急腹症研究所等单位，对脓毒症的中西医结合诊治进行了深入研究，取得了由单纯西医治疗的效果，并总结出了对脓毒症的病机和中医治法的认识、制订出了中西医结合诊疗标准及规范，总结筛选出多个具有良好疗效的中药复方，显示出中医药治疗脓毒症具有潜在的优势[11_22]。虽然，目前临床上所采用的中药复方显示了良好的治疗效果，但由于目前却没有客观有效的中药复方药效学评价方法，故无法知道所用复方是否是最佳的，也无法进行进一步的药物开发研究。因此，从中医药理论及其用药原则出发，结合现代科学技术，重新建立一种与中药复方的多成分、多途径、多靶点的特征相适应的新的药效评价模式是本发明的出发点。在此处键入技术领域描述段落。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的中药复方治疗脓毒症的药效评价方法。本发明所指的动物模型是大鼠脓毒症模型。本发明所指的评价指标是血浆内源性总代谢产物的变化规律。本发明所用的测定技术是氢核磁共振。本发明所指的数据处理方法是主成分分析和最小偏二乘法
本发明涉及大鼠脓毒症模型，样品采集、处理，氢核磁共振测定、数据处理和分析以及结果判断方式由下述方式完成。1.大鼠脓毒症模型的制作
模型组以健康Wistar大鼠9只，雌雄各半，体重210 230g。实验前1 禁食、不限水，实验时以10%水合氯醛按lml/kg剂量进行腹腔注射麻醉，无菌条件下开腹，分离盲肠， 在距其末端2cm处以1号丝线结扎，再用18号针头在盲肠末端穿孔2处，将盲肠放回腹腔后逐层关腹造模。正常组以健康Wistar大鼠9只，雌雄各半，体重210 230g。实验前12h禁食、 不限水，实验时以10%水合氯醛按lml/kg剂量进行腹腔注射麻醉，无菌条件下开腹，逐层关腹。治疗组以健康Wistar大鼠9只，雌雄各半，体重210 230g。在造模后，分别给予方剂流浸膏的蒸馏水稀释药液灌胃，剂量为24g生药/kg、12g生药/kg、6g生药/kg，每日 1次，连续72h。2.样品的采集处理
正常组、模型组、中药复方治疗组分别进行腹主动脉取血。血液经高速低温离心(转速15, OOOrpm ；时间10分钟；温度:4°C )。取上清400 1，添加200 1 0. 05%TSP重水溶液？ 5mm核磁共振样品管中，混勻，于4 °C冰箱保存，备用。3.氢核磁共振测定
上述样品在27°C的条件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振谱仪上，调用CPMG驰豫编辑脉冲序列。采用预饱和方式抑制水峰，饱和时间为^，谱宽8000Hz，采样点数64k，累加次数1 次，预饱和频率和中心频率都在水峰位置，获得自由衰减信号(FID信号)。FID信号经过傅立叶变换转为一维NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为Oppm。分别从δ 10. 0-0. Oppm以每段0. 04ppm积分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作为积分标准1，将所有数据以表格EXCEL格式储存。4.数据处理和分析
将EXCEL格式储存的数据，先对每组数据进行归一化处理，然后导入SIMPCA-11软件， 启动主成分分析模式进行分析。5.结果判断方式
将获得的各主成分分别为坐标进行二维图形制作。将治疗组的二维分布点区域与正常组的二维分布点区域和模型组二维分布点区域比较，如治疗组回归正常组局域，则判断该中药复方为有效；如治疗组没有回归正常组局域，仍处于模型组局域，则判定该中药复方为无效；如治疗组没有回归正常组局域，也不同于模型组局域，则判定该中药复方为有毒副作用。
图1是实施例1正常组和模型组的大鼠血浆总代谢物的PCA分析结果图示。图2是实施例1正常组、模型组与清热解毒方治疗组血清总代谢物的模式识别分析结果图示。图3是实施例2正常组和模型组的大鼠血浆总代谢物的PCA分析结果图示。图4是实施例2正常组、模型组与清热解毒方治疗组血清总代谢物的模式识别分析结果图示。
具体实施方式
实施方式1:
实验以健康Wistar大鼠27只，雌雄各半，体重210 230g，分为正常组、模型组、清热解毒方治疗组，每组9只。模型组实验前1 禁食、不限水，实验时以10%水合氯醛按Iml/ kg剂量进行腹腔注射麻醉，无菌条件下开腹，分离盲肠，在距其末端2cm处以1号丝线结扎， 再用18号针头在盲肠末端穿孔2处，将盲肠放回腹腔后逐层关腹造模。清热解毒方治疗组在造模后，分别给予方剂流浸膏的蒸馏水稀释药液灌胃，剂量为24g生药/kg、12g生药/kg、 6g生药/kg，每日1次，连续72h。然后正常组、模型组、清热解毒方治疗组治疗组分别进行腹主动脉取血。血液经高速低温离心(转速15，OOOrpm ；时间10分钟；温度4°C )。取上清400ml，添加200ml 0. 05%TSP重水溶液f5mm核磁共振样品管中，混勻，于4 °C冰箱保存，上述样品在27°C的条件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振谱仪上，调用CPMG 驰豫编辑脉冲序列。采用预饱和方式抑制水峰，饱和时间为^，谱宽8000Hz，采样点数64k， 累加次数1 次，预饱和频率和中心频率都在水峰位置。FID信号经过傅立叶变换转为一维NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为Oppm。分别从δ 10. 0-0. Oppm以每段 0. 04ppm积分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作为积分标准1，将所有数据以表格EXCEL格式储存，用于模式识别分析。模式识别采用主成分分析(principal component analysis, PCA)。分析结果如下(分别用二维图形直观表示)。1.正常组和模型组的大鼠血浆总代谢物的PCA分析结果(见图1)
图1中的每个点都代表一个样本(Δ正常组；+模型组)。可以看出，每个样本并不重叠，说明样本之间存在个体差异，与实际状况一致。但正常组和模型组内的样本分别相对集中，且样本的组与组间有明显的差异，说明样本个体差异小于组间差异。实验结果证明不同生理状态下的总代谢物谱确实是不同的。2.正常组、模型组与清热解毒方治疗组血清总代谢物的模式识别分析结果(图2): 从图2中( 正常组；Δ模型组；+清热方治疗组)可以看出，模型大鼠经清热解毒方
治疗7 后，其中7个样本的血浆总代谢物确实已基本回归正常组区域，但尚未完全与正常组的样本重合，说明该方在给药7 后显示了非常良好的治疗效果，但尚未完全治愈。另一个样本则处于既不同于正常组，也不同于模型组的第三方，说明该方对个别模型动物有毒副作用。可判断清热解毒方对脓毒症的有效率约为87. 5%的治疗，至完全治愈尚需要延长治疗时间。但该方有一定的毒副作用，需要进一步确定。
实施方式2:
实验以健康Wistar大鼠27只，雌雄各半，体重210 230g，分为正常组、模型组、凉血活血方治疗组，每组9只。模型组实验前1 禁食、不限水，实验时以10%水合氯醛按Iml/ kg剂量进行腹腔注射麻醉，无菌条件下开腹，分离盲肠，在距其末端2cm处以1号丝线结扎， 再用18号针头在盲肠末端穿孔2处，将盲肠放回腹腔后逐层关腹造模。凉血活血方治疗组在造模后，分别给予方剂流浸膏的蒸馏水稀释药液灌胃，剂量为24g生药/kg、12g生药/kg、 6g生药/kg，每日1次，连续72h。然后正常组、模型组、清热凉血活血方治疗组治疗组分别进行腹主动脉取血。血液经高速低温离心(转速15，OOOrpm ；时间10分钟；温度4°C )。 取上清400ml，添加200ml 0. 05%TSP重水溶液f5mm核磁共振样品管中，混勻，于4°C冰箱保存，备用。上述样品在27°C的条件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振谱仪上，调用CPMG 驰豫编辑脉冲序列。采用预饱和方式抑制水峰，饱和时间为^，谱宽8000Hz，采样点数64k， 累加次数1 次，预饱和频率和中心频率都在水峰位置。FID信号经过傅立叶变换转为一维NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为Oppm。分别从δ 10. 0-0. Oppm以每段 0. 04ppm积分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作为积分标准1，将所有数据以表格EXCEL格式储存，用于模式识别分析。模式识别采用主成分分析(principal component analysis, PCA)。分析结果如下(分别用二维图形直观表示)。1.正常组和模型组的大鼠血浆总代谢物的PCA分析结果(见图3)
图3中的每个点都代表一个样本(Δ正常组；+模型组)。可以看出，每个样本并不重叠，说明样本之间存在个体差异，与实际状况一致。但正常组和模型组内的样本分别相对集中，且样本的组与组间有明显的差异，说明样本个体差异小于组间差异。2.正常组、模型组与凉血活血方治疗组血清总代谢物的模式识别分析结果(图4): 从图4中可看出( 正常组；Δ模型组；+凉血方治疗组)，模型大鼠经凉血活血方治疗
7 后，8个治疗样本中有4个样本，即50%样本的血清浆总代谢物确实已回归正常组，显示了良好的治疗效果，而另4个样本(50%)样本还处于模型组区域附近，但也显示了向正常组区域回归的趋势，说明该方在给药7 后，对脓毒症有50%的治疗效果。在此处键入技术领域描述段落。
权利要求
1.一种中药复方治疗脓毒症的药效评价方法，其内容包括(1)动物模型；(2)样品采集；(3)测定方法；(4)数据处理和分析；(5)药效判断等部分。
2.如权利要求1中所述的(1)动物模型，动物可以为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴等；造模方法可以是本发明中的盲肠结扎穿孔法等手术法，也可以是药物致模法；权利要求1中所述的(2)样品采集，可以是本发明中的采集血浆，也可以是采集尿液、 粪便、唾液、或组织勻浆液。
3.如权利要求1中所述的(3)测定方法，可以是本发明中的氢核磁共振法，也可以是高速液相层析法、超高速液相层析法、毛细管电泳法，质谱法、以及以上技术的联用方法， 如高速液相层析-氢核磁共振连用法，超高速液相层析-氢核磁共振连用法，高速液相层析-质谱连用法，超高速液相层析-质谱连用法，质谱-质谱连用法等。
4.如权利要求1中所述的(4)数据处理和分析，可以是本发明中的主成分分析法，也可以是PLS法，PLS-DA法，或者是采用各种数据过滤后的分析法。
5.如权利要求1中所述的(5)药效判断方法，主要是以治疗后的内源性总代谢产物在以各种提取的主成分为坐标所作的二维或三维中样品点分布区域，以正常和模型样品点分布区域为基准进行比较，如治疗后的样品点分布区域回归正常样品点分布区域，可判定该药为有效；如治疗后的样品点分布区域没有回归正常样品点分布区域，仍处于模型样品点分布区域，可判定该药为无效；如治疗后的样品点分布区域既没有回归正常样品点分布区域，又与模型样品点分布区域不同，可判定该药为有毒副作用。
全文摘要
本发明涉及中药复方治疗脓毒症的药效评价方法。以脓毒症模型大鼠为对象，以其血浆中的总代谢产物为分析对象，以1H-NMR为检测手段，采用主成分分析或最小偏二乘法为数据处理方法，以正常组、模型组和治疗组的血浆中总代谢产物的变化规律为指标，以治疗后的血浆中总代谢产物是否回归正常判断中药复方是否具有药效的方法。
文档编号G01N33/15GK102183618SQ20111005214
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者刘洪斌, 吴咸中, 李云志, 李文华, 罗乔奇, 黄连, 黄静 申请人:四川大学