专利名称：一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒及其用途，属于生物医学诊断领域。
背景技术：
脓毒症(Sepsis)是严重创(烧、战)伤、休克、感染、外科大手术患者常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，是多发伤最主要死亡原因之一。目前，脓毒症已成为临床医学面临的突出难题，全世界每年大约1000人中就有3人发生脓毒症和感染性休克，同时这一数字还以每年1. 5% 8. 0%的速度上升。近年来抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但重症患者病死率仍高达30% 70%。我们前期的研究发现重症脓毒症病死率为31%，而一旦出现休克，病死率则高达75%。在保健医学领域因保健对象普遍年龄较大，多合并有各种慢性疾病，机体贮备能力下降，一旦感染则很容易继发多器官功能衰竭而危及生命。国内的一组保健对象资料回顾性分析发现感染致脓毒症(73. 1%，主要是下呼吸道感染)是导致保健对象继发多器官功能不全的最主要因素，而我们的研究发现一旦合并四个脏器以上衰竭，老年患者的病死率高达80%以上， 而且我们研究证实现有的感染监测指标C-反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)在动态评价脓毒症病情严重程度方面结果令人沮丧(S印sis/revere Sepsis/Septic Shock =CRP :p = 0. 711，PCT :p = 0. 075)。近年来研究表明，微小RNA (microRNA, miRNA)作为一类新型调节因子在肿瘤的发生发展中起重要作用。应用基因芯片或是实时定量聚合酶链式反应(PCR) 技术对miRNA表达谱研究发现，miRNA可助于多种疾病的诊断和预后评估。脓毒症患者病情发展迅速，病情凶险，对脓毒症患者的早期病情评估，并采取适当的干预治疗将十分有利用改善其预后生存。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于早期预测脓毒症患者的病死率的试剂盒。本发明的另一个目的是提供一种将上述试剂盒用于预测脓毒症患者的观天病死率的方法。为达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒，该试剂盒由反转录系统和扩增系统组成。其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP mix,hsa-miR-16茎环结构弓|物和消化后的RNA提取液组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液和TOsnRNA扩增引物与TOsnRNA荧光标记探针混合液组成。所述反转录系统包括反转录酶0.5 μ 1、反转录缓冲液0.75 μ 1、RNA酶抑制剂 0. 095 μ 1,hsa-miR-16 莲环结构引物 1. 5 μ 1、去离子水 2. 08 μ l.dNTP mix 0. 075 μ 1、及消化后RNA样品2. 5 μ 1，共计7. 5 μ 1。所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液IOul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液Iul和TOsnRNA扩增引物与TOsnRNA荧光标记探针混合液Iul。本发明还提供了一种利用上述试剂盒预测脓毒症患者病死率的的方法，包括以下步骤(1)病例血清样本处理及RNA提取以促凝管采集促凝血，临床常规血清标本以带分离胶的菲可替管采集，抽取入住 I⑶脓毒症患者M小时内的血样以及正常人血样，在4°C下以3000rpm离心15min，将上层血清转移至洁净Ep管，再在4°C下以15，OOOrpm离心30min以去除细胞碎片，吸取上层血清于洁净离心管，-80°C冻存备用；按照mirVana PARIS试剂盒使用说明书从血清中提取总 RNA,使用kandrop测定RNA提取液的A260吸光度值和A260/A280的比值(1. 9-2. 1)，以评估其浓度；变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后参照DNase I使用说明书，于37°C 对RNA提取液消化30min，于_80°C保存备用； (2) Hsa-miR-16cDNA 的合成 反转录体系包括反转录酶0.5μ 1、反转录缓冲液0.75μ 1、RNA酶抑制剂 0. 095 μ 1,hsa-miR-16 莲环结构引物 1. 5 μ 1、去离子水 2. 08 μ l.dNTP mix 0. 075 μ 1、及消化后RNA样品2. 5 μ 1，共计7. 5 μ 1 ；将以上成分充分混勻、离心后进行反转录(RT)，RT参数设置为16°C 30min,42°C 30min，再以85°C 5min灭活反转录酶，合成的cDNA置_20°C冻存(3) hsa-miR-16实时荧光定量PCR的检测扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液IOul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液(该混合液包含20 X扩增引物和Taqman MGB (MinorGroove Binder, 一种非荧光淬灭基因)标记的探针)Iul (上述两种试剂均购于美国ABI公司，USA)和TOsnRNA扩增引物与TOsnRNA荧光标记探针混合液Iul和TOsnRNA 扩增引物与U6snRNA荧光标记探针混合液lul。混合以上成分，加入1.33ul的反转录产物和 7. 67ul的去离子水；利用ABI 7300系统进行miRNA定量检测，循环参数设定为95°C IOmin 活化Taq酶，然后95°C 15sec，60°C lmin，共40个循环；选用TOsnRNA为内参，U6snRNA的检测使用与hsa-miR-16相同的反转录和荧光定量PCR反应体系以及TOsnRNA的引物与探针混合液；(4)hsa-miR-16脓毒症患者中表达情况分析通过与内参TOsnRNA和正常人的血清含量标准化后计算的2_ΔΔ"水平来计算血清中hsa-miR-16的表达水平，凡是表达水平< 1的患者在28内病死几率大，而表达水平> 1的患者观天病死几率小。本发明通过以下的方法证明确定了 hsa-miR-16为早期预测脓毒症病死率的分子标志物。研究对象的选择本研究选用的研究对象来自于解放军总医院SI⑶、RI⑶和EI⑶病房的脓毒症患者，采血时间为入住ICUM小时内。同时记录每位患者入院时生病体征及各项化验资料。按照入住ICU的28天病死率分为生存组与死亡组，生存组42例，死亡组34例。1.病例血清样本处理及RNA提取
以促凝管采集促凝血，临床常规血清标本以带分离胶的菲可替管采集。参考相关文献获得无细胞血清或血浆，简言之在4°C下以3000rpm离心15min，将上层血清转移至洁净Ep管，再在4°C下以15，OOOrpm离心30min，以去除细胞碎片，吸取上层血清于洁净离心管，-80°C冻存备用。按照mirVana PARIS试剂盒使用说明书从血清中提取总RNA，使用 Scandrop测定RNA提取液的A260吸光度值和A260/A^0的比值(1. 9-2. 1)。变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。然后参照DNase I使用说明书，于37°C对RNA提取液消化 30min。于_80°C保存备用。2. Hsa-miR-16cDNA 的合成反转录系统包括反转录酶0.5μ 1、反转录缓冲液0.75μ 1、RNA酶抑制剂 0. 095 μ l、hsa-miR-16 莲环结构引物 1. 5 μ 1、去离子水 2. 08 μ l.dNTP mix 0. 075 μ 1、及消化后RNA样品2. 5 μ 1，共计7. 5 μ 1。上述所有试剂均来源于Taqman microRNA反转录试剂盒(Applied Biosytems 公司，USA)。将以上成分充分混勻，离心后进行反转录(RT)。RT参数设置为16°C 30min, 42°C 30min，再以85°C 5min灭活反转录酶，合成的cDNA产物置_20°C冻存备用。3. Hsa-miR-16实时荧光定量PCR的检测扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液IOul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液(该混合液包含20 X扩增引物和Taqman MGB (MinorGroove Binder，一种非荧光淬灭基因)标记的探针)Iul (上述两种试剂均购于美国ABI公司，USA)和TOsnRNA扩增引物与TOsnRNA荧光标记探针混合液Iul和TOsnRNA 扩增引物与U6snRNA荧光标记探针混合液Iul。将以上成分混勻，再加入1. 33ul的cDNA产物和7. 67ul的去离子水，充分混勻。 利用ABI7300系统进行miRNA定量检测。循环参数设定为95°C lOmin，然后95°C 15sec, 60°C lmin，共40个循环。实验选用TOsnRNA为内参，U6snRNA的检测使用与hsa-miR-16相同的反转录和扩增体系，仅引物与探针使用TOsnRNA的。反应后记录初始的Ct值。4. hsa-miR-16预测早期脓毒症患者病死率的情况分析通过与内参TOsnRNA和正常人的血清含量标准化后计算的2_ΔΔ"水平来计算血清中hsa-miR-16的表达水平，凡是表达水平< 1的患者在28内病死几率大，而表达水平> 1的患者观天病死几率小。
图1为hsa-miR-16在正常组(NC)，脓毒症患者生存组(S)和死亡组(D)血清中表达水平比较。图中生存组表达水平高于正常组，而死亡组表达水平低于正常组。图2为hsa-miR-16，hsa_miR-15b，hsa-miR-223同已有的评价脓毒症预后指标 CRP (C-反应蛋白)，PCT (降钙素原)，APECHE II评分(急性生理与慢性健康评分)和SOFA 评分(感染相关的器官衰竭评分)预测预后价值比较的ROC(受试者工作曲线)曲线，具体数值见表1所示。参见附图，hsa-miR-16的表达水平以2_ΔΔα表示，-AACt = (Ct脓毒症患 ^-CtJ-(Ct ^a-CtJ0图中显示的表达量是经过与U6snRNA标准化后的表达量。由图1 可以看出，死亡组的hsa-miR-16表达水平低于正常组，而生存组hsa-miR-16表达水平高于正常组。而生存组与死亡组之间通过t检验，ρ = 0.009，差异有统计学意义。通过One-way ANOVA分析后ρ = 0.017，说明三组之间总体均值是有差异的。上述数据说明hsa-miR-16的表达水平可以用来预测早期脓毒症患者的28天病死率。为进一步分析，我们选取的同脓毒症相关的miRNAs和常用于脓毒症预后评价的指标绘制ROC曲线，并且比较它们的曲线下面积(AUC)，结果显示hsa-miR-16有最大的曲线下面积0. 847,ρ < 0. 001，说明其预测脓毒症患者病死率的价值最大，如表1和图2中所不。表1. miRNAs, CRP, PCT, SOFA评分和APECHE II评分的曲线下面积
权利要求
1.一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反转录系统和扩增系统组成，其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP mix、 hsa-miR-16茎环结构引物和消化后的RNA提取液组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液和TOsnRNA扩增引物与TOsnRNA荧光标记探针混合液组成。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反转录系统包括反转录酶0.5μ 1、反转录缓冲液0. 75μ 1、RNA酶抑制剂0. 095μ l、hsa-miR-16茎环结构引物1. 5 μ 1、去离子水 2. 08 μ l.dNTP mix 0. 075 μ 1、及消化后 RNA 样品 2. 5 μ 1，共计 7. 5 μ 1。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液IOul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液Iul和 TOsnRNA扩增引物与TOsnRNA荧光标记探针混合液Iul。
4.一种利用上述权利要求中任意一项所述的试剂盒预测脓毒症患者病死率的方法，包括以下步骤(1)病例血清样本处理及RNA提取以促凝管采集促凝血，临床常规血清标本以带分离胶的菲可替管采集，抽取入住ICU 脓毒症患者M小时内的血样以及正常人血样，在4°C下以3000rpm离心15min，将上层血清转移至洁净Ep管，再在4°C下以15，OOOrpm离心30min以去除细胞碎片，吸取上层血清于洁净离心管，_80°C冻存备用；按照mirVana PARIS试剂盒使用说明书从血清中提取总RNA，使用kandrop测定RNA提取液的A260吸光度值和A260/A280的比值，以评估其浓度；变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后参照DNase I使用说明书，于37°C对RNA提取液消化 30min，于-80°C保存备用；(2)Hsa-miR-16cDNA的合成反转录体系包括反转录酶0. 5 μ 1、反转录缓冲液0. 75 μ 1、RNA酶抑制剂0. 095 μ 1, hsa-miR-16莲环结构引物1. 5 μ 1、去离子水2. 08 μ 1、dNTP mix 0. 075 μ 1、及消化后RNA 样品2. 5μ1，共计7. 5μ1 ；将以上成分充分混勻、离心后进行反转录，反转录参数设置为 160C 30min,42°C 30min，再以85°C 5min灭活反转录酶，合成的cDNA置_20°C冻存备用；(3)hsa-miR-16实时荧光定量PCR的检测扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液IOul、hsa-miR-16扩增引物与 hsa-miR-16荧光标记探针混合液Iul ；向其中加入1. 33ul的反转录产物和7. 67ul的去离子水；利用ABI7300系统进行miRNA定量检测，循环参数设定为95°C IOmin活化Taq酶， 然后95°C 15sec，60°C lmin，共40个循环；选用TOsnRNA为内参，TOsnRNA的检测使用与 hsa-miR-16相同的反转录和荧光定量PCR反应体系以及TOsnRNA的引物与探针混合液；(4)hsa-miR-16脓毒症患者中表达情况分析通过与内参TOsnRNA和正常人的血清含量标准化后计算的2_δδ"水平来计算血清中 hsa-miR-16的表达水平，凡是表达水平< 1的患者在28内病死几率大，而表达水平> 1的患者28天病死几率小。
5.如权利要求4所述的方法，其特在在于使用kandrop测定的RNA提取液的A260吸光度值和A260/A280的比值为1. 9-2. 1
6.如权利要求1所述试剂盒用于预测脓毒症患者病死率的用途
全文摘要
本发明提供了一种预测脓毒症患者病死率的试剂盒，该试剂盒包括反转录系统和扩增系统。反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液、RNA酶抑制剂、hsa-miR-16茎环结构引物和消化后的RNA提取液组成。扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针和U6snRNA扩增引物与U6snRNA荧光标记探针组成。本发明还提供了一种利用上述试剂盒预测脓毒症患者病死率的方法。本发明的方法检测定量准确，简便、快速且经济实用。可进一步同其他分子指标与评分系统相结合，为脓毒症患者预后预测提供综合性分子标记试剂盒，方便于临床应用。
文档编号G01N21/64GK102191327SQ201110096219
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者王慧娟, 解立新 申请人:中国人民解放军总医院