专利名称：一种检测水产品中氯霉素的试剂板的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水产品中氯霉素残留的试剂板的制备方法，具体涉及一种检测氯霉素的免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。
背景技术：
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种有效的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗，对多种病原菌有较强的抑制作用，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性，因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了巨大威胁。氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家与地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。自2001 年以来，我国出口水产品频频被进口国检出氯霉素残留，药物残留已成为扩大水产品国际贸易的主要障碍。针对这种情况，农业部已将氯霉素从2000年《中国兽药典》中删除，此药重新进入安全评价体系，在《动物性食品兽药残留规定》中规定可食部分不得检出，并且在出口的日常检测中，将其列为必检项目，一旦发现超标，一律禁止出口。对于氯霉素残留，存在多种检测方法，大致可分为三大类第一类是生物测定法， 第二类是化学分析法，第三类是兼有生物和化学的酶联免疫检测法。国际上公认的定量确认方法是理化分析法，主要是气相色谱法和液相色谱法，这两种方法灵敏度高，结果准确，重复性好，假阳性少，用配有ECD的气相色谱仪及GC-MS联用技术进行确认及定量分析，检出限可以达到0. lppb。缺点是样品前处理过程复杂仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，不利于大规模样本筛选。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短，使用方便。因此，在现场监控和基层的大规模筛选检测中，免疫学检测方法更实际。胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，简便快速，生产成本低的氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。本发明试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、 胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有l_2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
胶体金结合垫上包被有抗氯霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有氯霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线。偶联氯霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白等。本发明试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗氯霉素单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物。为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。本发明试剂板具有如下有益效果(1)特异性好。本发明试剂板对氯霉素的交叉反应率为100%，对如甲砜霉素、氟甲砜霉素、棕榈氯霉素等抗生素的交叉反应率均低于1%。可见，本发明试剂板对氯霉素反应具有高度专一性。(2)灵敏度高。本发明试剂板对水产品中氯霉素的检出限为0. 3ppb，在水产品中对氯霉素的快速检测达到了较优水平，适用于各类企业及检测机构的现场快速筛选。(3)操作简单快捷。本发明试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中， 滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。(4)成本低，易推广。本发明试剂板生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉，投资少，收效快。
图1为氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板背衬结构示意图，其中1为样品垫，2为胶金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC 底板。图2为氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。图3为氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。具体实施方法本发明试剂板的制备包括氯霉素-载体蛋白偶联物的制备，抗氯霉素单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体的制备和氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的组装。1.氯霉素与载体蛋白的偶联
采用碳二亚胺(EDC-HCl)法将氯霉素与载体蛋白偶联制备免疫抗原及包被抗原。 称取20mg牛血清蛋白(BSA)，加入ImL蒸馏水。另外用ImL蒸馏水溶解20mg EDC · HCl和 20mg氯霉素，加入到上述溶液中。将溶液混勻后，置于4°C下避光反应12小时(期间可颠倒混勻)。之后用PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8小时换液1次。再将溶液离心，收集上清液，-20°C下冻存备用。卵清蛋白(OVA)替代BSA，同样方法制备氯霉素-OVA偶联物。2.氯霉素单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的氯霉素-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂替代完全佐剂进行腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 10的比例混合，在50% PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C、5% C02培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L氯霉素-OVA偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用氯霉素-OVA偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2 X 10-3mol/L氯霉素溶液等量混合，37°C感作lh， 加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH 7.4)替代氯霉素溶液作对照，其余步骤同上。若氯霉素阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5X105mL_l时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株107个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1% 的柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 的氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体的制备取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8. 0。边搅拌边加入1. 5mg抗氯霉素单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL聚乙二醇20000 (25mol/L，PEG 20000)，搅拌15min。20，OOOrpm离心15min,弃上清液，加入IOmL pH 7. 4PBS缓冲液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 μ m 无菌过滤器过滤后，4 0C保存备用。5.氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的氯霉素-BSA偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥他。以同样方法，将制备好的金标记氯霉素单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板， 再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
6.氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6. 1样品制备取切碎的一定量的去脂肪组织样本，用均质机均质。称取2g均质物于5mL离心管中，然后加入3mL乙酸乙酯，剧烈振荡:3min后，室温下4000rpm离心5min ；移取2mL上清液于试管中，65°C下氮气吹干10分钟；向吹干的试管中依次加入0. 3mL正己烷和0. 3mL氯霉素专用PBST缓冲液，用滴管冲洗溶解试管内壁上残留物；静置2min，分层后吸取下层溶液， 待检。6. 2 检测从包装袋中取出试剂板，置于平整的台面上，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100 μ L)，加样后开始计时，结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性(-):T线显色比C线深或一样深，表明样品中氯霉素浓度低于0. 3ppb或无氯霉素残留。如图3. a所示。阳性⑴T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中氯霉素浓度高于0.3ppb ； T线比C线越浅，表明样品中氯霉素浓度越高。如图3. b所示。无效未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新试剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求
1.一种检测水产品中氯霉素的试剂板的制备方法，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫， 相邻各部分间有l-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
2.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于胶体金结合垫上包被有抗氯霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有氯霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线。偶联氯霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白等。
3.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于氯霉素与载体蛋白的偶联采用碳二亚胺法将氯霉素与载体蛋白偶联制备免疫抗原及包被抗原。
4.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1 %的柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 的氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。
5.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于工艺流程包括制备氯霉素-BSA偶联物、 制备抗氯霉素单克隆抗体、制备胶体金溶液、制备胶体金标记抗氯霉素单克隆抗体和组装氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板。
全文摘要
本发明涉及一种检测水产品中氯霉素的试剂板的制备方法，可用于检测水产品中的氯霉素残留。本发明试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需20～30min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合检验检疫机构、海洋与渔业局、水产质量检测部门等对水产品中非法使用氯霉素进行大规模快速检测。
文档编号G01N33/544GK102288762SQ201110179489
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者周崇盈, 张少恩, 桑丽雅 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司