专利名称：一种内嵌样品净化模块的表面等离子共振谱仪及其检测方法
技术领域：
本发明属于食品安全和环境分析检测领域，特别涉及一种内嵌样品净化模块的表面等离子共振谱仪，可实现目标分析物与干扰物的在线快速分离，具有样品需求量小、干扰小、准确度高的检测方法。
背景技术：
近年来，越来越多的有毒有害物质出现在食品和环境中，造成严重的食品安全事故和大面积环境污染，危害人民身体健康。污染物的种类多种多样，例如食品安全中兽残、农残、生物毒素，消费品安全中塑化剂、重金属、高关注度化学物质等等。因此，开发相应快速检测装置迫在眉睫。表面等离子共振谱仪(SPR)，也称分子相互作用谱仪，是一种基于物理光学原理的新型生化分析系统。与传统的相互作用分析技术相比较，它具有实时监控、无需标记、耗样量极少、操作简单等特点。作为一种超灵敏快速检测技术，在食品安全、分析化学、生物分子相互作用分析、临床诊断、环境检测等领域呈现出巨大的应用前景。已有大量文献报道SPR生物传感器可快速测定食品中抗生素、细菌、农药残留、重金属离子等危害因子，具有高灵敏度、快速响应性、在线分析能力等特点，已成为食品安全检测的理想工具之一。众所周知，食品安全和环境检测的样品预处理过程是一个重要环节，约占整个分析时间的三分之二。目前，传统的样品预处理方法主要是色谱、固相萃取等方法。这些方法存在耗时长、样品用量大、操作步骤繁琐等缺点，迫切需要开发在SPR检测前实现简单快速分离目标物和干扰物的器件，减少操作时间。
发明内容
本发明提供一种内嵌样品净化模块的表面等离子共振谱仪及其检测方法，技术方案如下
一种表面等离子共振谱仪，包括样品瓶、适配体或抗体溶液、流动相、微流泵、微型膜透析组件、废液瓶、混合池、连接组件、微射流卡盘、传感器芯片和光学检测系统，该仪器在样品引入的通道上嵌入了净化模块，即微型膜透析组件，所述的微型膜透析组件内部由表面功能化的中空纤维膜组成，位于样品进样接头与微量混合池之间。所述的微型膜透析组件，具体包括常规压力透析去除大分子模式、常规压力透析去除小分子模式和接枝纤维吸附-解析模式三种模式的膜组件，检测过程根据目标分析物的性质进行选择或组合，以实现样品净化，从而提高分析准确性。
(I)当目标分析物为分子量小于IOkDa的小分子时，选择压力透析去除大分子模式组件，该组件内部是由孔径在5-50纳米的中空纤维膜组成，其内部流道为样品中的小分子目标检测物，在通过进样阀进入膜透析组件后，在泵所提供的气压或液压下，透过中空纤维膜壁上的孔进入表面等离子共振仪的检测池，大分子干扰物留在纤维空腔内，经清洗进入废液池；
(2)当目标分析物为分子量大于IOkDa的大分子时，选择压力透析去除小分子模式组件；该组件内部是由孔径在5-50纳米的中空纤维膜组成，其内部流道为样品中小分子干扰物被透析出来后，进入废液池；而大分子目标物则通过中空纤维膜的内部被导入检测区域；
(3)当目标分析物或干扰物为可被选择性吸附时，选择接枝纤维吸附-解析模式组件；该组件内部是由官能化接枝的无孔中空纤维膜组成；该组件的分离净化过程有两种不同方式其一是干扰物被选择性吸附在纤维材料上，而目标物不被吸附，直接在压力下被导入系统的检测部分，而后干扰物再被清洗出去，进入废液；其二是目标物首先被选择性吸附在纤维上，干扰物被清洗进入废液，而后选用另一种流动相将目标物再洗脱下来，被导入系统的检测部分。所述的微型膜透析组件，针对不同样品，采用多种官能化接枝纤维与中空纤维膜材料。所述的官能团为氨基和/或羧基。以上所述的表面等离子共振谱仪的应用方法，包括下述步骤
(1)根据样品的复杂程度以及目标分析物的特性，从压力透析去除大分子、压力透析去除小分子、吸附-解析等三种模式的微型膜透析组件进行选择或组合，并将其置于样品进样接头与微量混合池之间；
(2)根据目标分析物的分子量大小选择传感器芯片，对于分子量大于IOkDa的目标分析物，直接选用链霉亲和素修饰的芯片；对于分子量小于IOkDa的分析物，则选用该分析物修饰的芯片；
(3)根据目标物分子量的大小选择样品和适配体进样方式，对于分子量大于IOkDa的分析物，先将生物素修饰的适配体或抗体通入微射流卡盘，流经传感器芯片进行连接，再将样品注入微型膜透析组件，去除干扰物后，流经微量混合池、微射流卡盘，在传感器芯片上进行检测；对于分子量小于IOkDa的分析物，则先将样品经微型膜透析组件净化，进入微量混合池，与适配体或抗体进行混合，再通入微射流卡盘，流经传感芯片检测，再通过微射流卡盘流到废液瓶中；
(4)当液体通过传感芯片时，光学检测器将检测信号，并进行数据采集和处理，对目标分析物浓度进行分析。与现有技术相比较，本发明具有以下突出优点
(I)本发明在表面等离子体共振谱仪中内嵌了微型膜透析组件，缩短了分析时间，且操作简单易行，重现性好。(2)本发明通过内嵌样品净化模块，适用于待检测样品量少的场合，避免了一般离线样品预处理操作繁琐、耗时多、样品消耗量大等缺点。(3)本发明通过内嵌不同的微型膜透析组件，不仅适用于大分子物质的检测，同时也适用于小分子量物质的检测。(4)本发明中样品的净化处理和检测同步进行，可以实现在线分析或在线检测目 标物的浓度。本发明在传统表面等离子检测模式中内嵌入样品净化模块，具有快速、高效分离目标分析物与干扰物，可用于 农产品食品中生物毒素、农兽药残留、非法化学添加剂的分析检测，也可用于生物和医学的分子相互作用研究，具有样品需求量小、干扰小、灵敏度高、重现性好等优点，可广泛应用于食品安全检测和生物分子相互作用研究。
图I为本发明方法所使用的内嵌净化模块在线分析装置连接方式示意图。该在线分析装置包括表面等离子共振生物传感器的样品瓶I、适配体(或抗体)溶液2、流动相3，微流泵4、5、6，微型膜透析组件7，废液瓶8，混合池9，微流泵10，连接组件11，微射流卡盘12，传感器芯片13，废液瓶14。其中连接组件中的载流入口和废液出口分别与微射流卡盘12相连，芯片13—面固定于微射流卡盘的流通池，另一面固定于检测器。溶液通过微射流卡盘流过芯片表面时，检测器收集信号，随后溶液从微射流卡盘12和连接组件14的废液出口流出。图2为压力透析除去大分子的微型膜透析组件。该组件内部是由孔径在5-50纳米的中空纤维膜组成，可使小分子目标物与大分子干扰物实现快速的分离，同时通过在纤维膜表面的官能化修饰，还可以选择性的吸附小分子干扰物，使其保留在膜上，从而达到样品的快速净化目的。样品中的小分子目标检测物，在通过进样阀进入膜透析组件后，在泵所提供的气压或液压下，透过中空纤维膜壁上的孔进入SPR系统的检测池；大分子干扰物留在纤维空腔内，通过管路b，在泵压下被清洗出来，进入废液池8;小分子干扰物可以通过膜表面的官能团被选择性吸附，随后被清洗进入废液池。整个器件通过毛细管接口分别与样品进样接头、微量混合池连接。这一模式主要用于去除大分子干扰物和部分特异性较强的小分子干扰物，其主要特点是方法简便、快速、适用性强。图3为压力透析除去小分子的微型膜透析组件。这一模式器件的设计和原理与图2的组件非常接近，也是通过中空纤维膜达到大分子与小分子的分离。主要不同之处是在图2组件中中空纤维的两个开口端是并列封在上部，而在这个组件中，一端是直接连到外面与管路a相接。当小分子干扰物被透析出来后，大分子目标物从中空纤维的一端通过管路a被导出进入检测区域。这一模式主要用在检测大分子时，去除小分子或共聚物的干扰；也可用于大分子样品脱盐。该器件与整个系统的集成与图2模式相同。图4为吸附-解吸模式的微型膜透析组件。这一模式与前两个模式有较大的区别，其分离净化作用是通过官能化接枝纤维选择性的吸附/解析过程来实现的。官能化接枝纤维既具有吸附/解析平衡快的特点，又有较高的样品吸附容量，同时基于其无孔的特性，便于微量样品的处理。该器件的分离净化有两种不同模式其一是干扰物被选择性吸附在纤维材料上，而目标物不被吸附，直接在压力下被导入系统的检测部分，而后干扰物再被清洗出去，进入废液；其二是目标物首先被选择性吸附在纤维上，干扰物被清洗进入废液，而后选用另一种流动相将目标物再洗脱下来，被导入系统的检测部分。这一组件与第一种使用官能化中空纤维膜的压力透析组件相比，有大于几十倍的吸附容量，非常适于将小分子目标物与小分子干扰物分离，或将大分子目标物与大分子干扰物分离，从而达到样品净化的目的。其缺点主要在于使用目标物的吸附模式时，需要吸附和解析两步才能完成。该组件与整个系统的集成方式与前两种类似。图5为实施例I中双酚A浓度与共振信号的标准曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明方法的具体操作过程作进一步的详细说明。实施例I :在线分析样品中的双酚A
本实施例中对样品中双酚A的在线分析按下述步骤进行
(I)在线分析装置的建立
根据本实施例的目标分析物双酚A (分子量为228Da，小于IOkDa)的性质，样品净化模块选择压力透析除去大分子模式，芯片选择经双酚A修饰的SA芯片；进样方式选择样品和适配体在混合池进行混合后进样。(2)样品中双酚A的在线分析
将流动相溶液3中的载流液经连接组件11中的载流入口通入在线分析装置，以保证始终有溶液流过芯片13表面。首先，利用微流泵4将含10 μ L双酚A的样品由进样瓶I经微型膜透析组件7，去除干扰物，获得干扰小的目标分析物，置于混合池9中；其次，利用微流泵5将30 μ L浓度为50 μ g/L的双酚A适配体从样品瓶2中加入混合池9中；此时样品与适配体在混合池9中进行结合；未结合的适配体随溶液经连接组件11通过微射流卡盘12，流过芯片13表面被检测，此时收集信号即可实现样品中双酚A的在线分析；最后，流动相和样品再经微射流卡盘12和连接组件11流入废液瓶14。(3)残留双酚A的去除与芯片的再生
用5 μ L含lOmmol/L氢氧化钠与质量浓度为O. 001%十二烷基磺酸钠的混合溶液通入在线分析装置，即实现管道中残留双酚A的去除与芯片表面的再生。首先制定内嵌样品净化模块的表面等离子共振在线分析水样中含不同浓度双酚A的标准溶液的SPR信号曲线。将10 μ L浓度为O. 5、I、2、4、8和Wyg/L的双酚A标准溶液分别进行在线分析，收集信号即可得到对应的共振信号曲线。样品中双酚A的浓度越高，通入双酚A，双酚A适配体混合溶液所对应的共振信号越弱。通过对浓度与SPR共振信号大小作图，得到双酚A浓度与SPR共振信号的标准曲线，如图5所示。共振信号大小与双酚A浓度成反比。通过对未知样品的在线分析，获得SPR共振信号，由该标准曲线可计算出该样品的双酚A含量。实施例2 :在线分析血液中的凝血酶含量
本实施例中对血液中的凝血酶含量分析按下述步骤进行
(I)在线分析装置的建立
将微型膜透析模块连接在样品进样器和连接组件之间，根据本实施例的目标分析物凝血酶(分子量为37kDa，大于IOkDa)的性质，选择压力透析除去小分子模式的微型膜透析组件，芯片直接选择链霉亲和素修饰的SA芯片。(2)血液中凝血酶的在线分析
首先将5 μ L经生物素修饰的凝血酶适配体通过微泵5流经混合池9、连接组件11、微射流卡盘12，最后在SA芯片上与链霉亲和素进行连接；再将5 μ L浓度为O. 125,0. 25、0. 5、
I.0,2. O和4. O μ g/L的凝血酶样品，加入微型膜透析组件7，去除小分子干扰物，流经混合池9、连接组件11、微射流卡盘12，在芯片上进行信号检测，并根据信号与浓度大小绘制标准曲线。
再将未知度的血样通入在线分析装置，收集信号，根据标准曲线即可计算出血样中凝血酶的浓度。(3)凝血酶的去除与芯片的再生
用5 μ L含lOmmol/L氢氧化钠与质量浓度为O. 001%十二烷基磺酸钠的混合溶液通入在线分析装置，即实现管道中残留双酚A的去除与芯片表面的再生。本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中分别以双酚A (小分子)和凝血酶(大分子)为例进行详细描述，但本发明同样适用于其他物质的测定。此外，根据实施例I和实施例2的方法进行检测样品，与现有表面等离子体检测技术相比，提高了复杂样品的检测准确度，总体检测时间比传统方法(分开预处理+检测)缩短2倍以上，减少了大量干扰物的干扰，芯片寿命延长2倍以上，可获得准确的检测结果。
权利要求
1.一种表面等离子共振谱仪，包括样品瓶、适配体或抗体溶液、流动相、微流泵、微型膜透析组件、废液瓶、混合池、微流泵、连接组件、微射流卡盘、传感器芯片和光学检测系统，该仪器在样品引入的通道上嵌入了净化模块，即微型膜透析组件，所述的微型膜透析组件内部由表面功能化的中空纤维膜组成，位于样品进样接头与微量混合池之间。
2.如权利要求I所述的表面等离子共振仪，所述的微型膜透析组件，具体包括常规压力透析去除大分子模式、常规压力透析去除小分子模式和接枝纤维吸附-解析模式三种模式的膜组件，检测过程根据目标分析物的性质进行选择或组合，以实现样品净化，从而提高分析准确性； (O当目标分析物为分子量小于IOkDa的小分子时，选择压力透析去除大分子模式组件，该组件内部是由孔径在5-50纳米的中空纤维膜组成，其内部流道为样品中的小分子目标检测物，在通过进样阀进入膜透析组件后，在泵所提供的气压或液压下，透过中空纤维膜壁上的孔进入表面等离子共振仪的检测池，大分子干扰物留在纤维空腔内，经清洗进入废液池； (2)当目标分析物为分子量大于IOkDa的大分子时，选择压力透析去除小分子模式组件；该组件内部是由孔径在5-50纳米的中空纤维膜组成，其内部流道为样品中小分子干扰物被透析出来后，进入废液池；而大分子目标物则通过中空纤维膜的内部被导入检测区域； (3)当目标分析物或干扰物为可被选择性吸附时，选择接枝纤维吸附-解析模式组件；该组件内部是由官能化接枝的无孔中空纤维膜组成；该组件的分离净化过程有两种不同方式其一是干扰物被选择性吸附在纤维材料上，而目标物不被吸附，直接在压力下被导入系统的检测部分，而后干扰物再被清洗出去，进入废液；其二是目标物首先被选择性吸附在纤维上，干扰物被清洗进入废液，而后选用另一种流动相将目标物再洗脱下来，被导入系统的检测部分。
3.如权利要求I所述的表面等离子共振仪，其特征在于，所述的微型膜透析组件，针对不同样品，采用多种官能化接枝纤维与中空纤维膜材料。
4.如权利要求3所述的表面等离子共振仪，其特征在于，所述的官能团为氨基和/或羧基。
5.权利要求I所述的表面等离子共振谱仪的应用方法，包括下述步骤 (1)根据样品的复杂程度以及目标分析物的特性，从压力透析去除大分子、压力透析去除小分子、吸附-解析等三种模式的微型膜透析组件进行选择或组合，并将其置于样品进样接头与微量混合池之间； (2)根据目标分析物的分子量大小选择传感器芯片，对于分子量大于IOkDa的目标分析物，直接选用链霉亲和素修饰的芯片；对于分子量小于IOkDa的分析物，则选用该分析物修饰的芯片； (3)根据目标物分子量的大小选择样品和适配体进样方式，对于分子量大于IOkDa的分析物，先将生物素修饰的适配体或抗体通入微射流卡盘，流经传感器芯片进行连接，再将样品注入微型膜透析组件，去除干扰物后，流经微量混合池、微射流卡盘，在传感器芯片上进行检测；对于分子量小于IOkDa的分析物，则先将样品经微型膜透析组件净化，进入微量混合池，与适配体或抗体进行混合，再通入微射流卡盘，流经传感芯片检测，再通过微射流卡盘流到废液瓶中； (4)当液体通过传感芯片时，光学检测器将检测信号，并进行数据采集和处理，对目标 分析物浓度进行分析。
全文摘要
本发明在表面等离子共振谱仪内嵌微型膜透析组件，该组件内部由表面功能化的中空纤维膜组成，建立一种无需样品前处理的表面等离子共振检测方法，特征是选择或组合选择压力透析去除大分子、压力透析去除小分子、吸附-解析三种模式的微型膜透析组件，并将其置于样品进样接头与微量混合池之间。检测时，先将一定量的样品经进样接头通入微型膜透析组件，将目标分析物与干扰物进行快速分离，再进入微量混合池，与通过另一流道进样的目标分析物抗体或适配体进行混合，随后经微射流卡盘进样，进行痕量目标分析物的在线分析。本方法具有样品用量小、干扰小、灵敏度高、重现性好等优点，可广泛应用于食品安全检测和生物分子相互作用研究。
文档编号G01N21/55GK102636461SQ20121011072
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者于艳军, 王利兵, 苏荣欣 申请人:王利兵