专利名称：一种基于表面等离子共振技术的食品中有害物质多残留同时检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种食品中有害物质多残留同时检测技术。特别是基于表面等离子体共振技术，通过核酸适配体与未标记、标记样品进行特异性竞争识别，采用多探头光纤传感器同时检测食品中多种有害物质的方法。
背景技术：
食品中有害物质残留严重危害了公众身体健康，面对食品安全问题的重大挑战，分析检测食品中有害物质是保障食品安全的重要环节。其中，表面等离子共振(SurfacePlasmon Resonance, SPR),作为ー种超灵敏快速检测手段,是食品安全检测的理想工具之一。但SPR在检测低分子量物质时仍存在信噪比大、响应值小、灵敏度低等不足，而食品中啶虫脒、卡那霉素、土霉素(农药兽药)、赭曲霉素(生物毒素)、孔雀石绿(化学污染物)等均为低分子量有害物质。此外，食品中经常同时存在多种有害物质，使得检测过程复杂繁琐，目前普遍采用的单个物质检测已经无法满足要求。因此，迫切需要开发基于SPR技术的新型检测方法，实现食品中多种低分子量有害物质的超灵敏、快速、同时检測。近几年来，基于适配体识别的检测方法在食品安全检测中呈现出巨大应用前景。适配体是能够与靶标分子高特异性结合的核酸(DNA或RNA)片段。由于适配体具有高特异性和高亲和性，因此被喻为“化学抗体”。跟抗体相比，适配体具有更高的化学稳定性，不易失活，因此更具应用潜力。此外，适配体制备不依赖动物或细胞，可通过聚合酶链反应(PCR)技术在体外大量合成。因此，基于适配体特异性识别，为同时检测食品中多种有害物质提供了基础和依据。结合表面等离子体共振技术，有望实现食品中多种有害物质的超灵敏同时检测。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种采用表面等离子体共振谱技术检测食品中多种低分子量有害物质残留的方法，解决现有表面等离子体共振技术中难以同时检测多种低分子量物质的问题。本发明的技术方案为一种应用表面等离子共振技术的食品中有害物质多残留同时检测方法，对同一样品中的多种有害物质残留组分的含量进行同时检测，其特征在于包括下述步骤
(一)传感器表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的多探头光纤传感器，每个探头表面连接ー种适配体，通过通入5-50 u L浓度为1-50 u g/L已标记生物素的残留组分对应核酸适配体，在多探头光纤传感器上固定上不同残留组分相应的核酸适配体；
(ニ)对待测残留组分进行分子探针标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊ニ醛法交联两个氨基；
(三)标准溶液配制用0. 01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置残留组分的标、准样品储备液，储备液浓度为0. Ing/mL至lmg/mL，分别等量量取残留组分的标准储备液，配制含有有害物质残留组分的混合标准原液，用磷酸盐缓冲液将混合标准原液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测残留组分的标准溶液和分子探针标记的待测残留组分充分混合； (四)建立标准曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 u L待测混合样品，随后通入5-100 u L浓度为5-100ng/mL的分子探针的适配体溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归曲线的方程；依次测得多种有害物质残留组分的工作曲线，进行多项式曲线拟合，获得各自的标准曲线；
(五)定量检测对于未知含量的多种残留组分样品进行检测，同样按照步骤(三)进行；再通入适量分子探针适配体溶液，采用表面等离子共振谱仪记录多种有害物质残留的光谱图；将光谱图中不同残留组分的稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出不同食品中残留组分的浓度值；
(六)通入0.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗多探头光纤传感器表面，进行传感元件再生，用于下次測量。所述分子探针包括凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E,标记方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。可以采用多探头光纤传感器为表面等离子共振仪的传感元件，每个探头连接ー种适配体，总共连接4 16种不同的适配体。所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤
(1)将链霉亲和素SA修饰的光纤传感探头插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰；
(2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液；
(3)通入5-50UL浓度为1-50 y g/L生物素修饰的标记分子适配体溶液，进行在线偶联
至基线稳定；
(4)重复步骤(2)至(3)，获得标记分子适配体修饰的光纤传感探头。可以采用分子探针标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。 所述步骤(四)和(五)中通入适量分子探针适配体溶液，提高表面等离子体共振谱仪响应值，适用于测量响应信号较小的小分子量有害物质残留组分。所述的小分子量有害物质残留组分的分子量〈1000 Da。本发明方法中采用的表面等离子体共振多探头光纤传感器，在传感器表面固定多种不同的适配体，基于适配体特异性识别，可同时检测多种物质。本发明方法引入大分子标记物凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E，基于表面等离子体共振传感表面适配体竞争识别未标记和标记的目标分子，若待测样品中目标分子少，则表面等离子体共振表面吸附的标记分子多，此时引起的表面等离子体共振响应越大，反正则越小。由于分子探针分子量大，与分子探针适配体特异性识别吸附后，表面等离子体共振响应值进ー步増大，因此，可实现小分子物质的超灵敏检測。本发明提供的基于表面等离子体共振谱仪，采用多探头光纤传感器，检测食品中多种低分子量有害物质残留的方法，与现有技术相比具有以下优点(I)采用高稳定性的核酸适配体为识别分子，相比抗体-抗原识别检測，大大提高了传感元件的使用寿命，降低了检测成本；(2)采用表面等离子体共振多探头光纤传感器，可同时检测多种有害物质，相比单个物质检测技木，大大提高了样品检测效率，缩短了样品检测时间；(3)引入具有大分子量的分子探针，基于竞争识别，可实现小分子有害物质的超灵敏检测，解决了表面等离子体共振技术检测小分子量物质 的响应值小、灵敏度低等问题。
图I是本发明所述基于表面等离子共振的多种小分子有害物质同时检测原理图；其中!)为凝血酶适配体。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。实施例选择凝血酶为分子探针，凝血酶适配体序列为GGTTGGTGTGGTTGG。选择五种典型食品中小分子有害物质为检测对象，分别为啶虫脒、卡那霉素、土霉素、赭曲霉素、孔雀石绿，相应适配体序列为
啶虫脒适配体-CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTTGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTT
GATCGCTGACACCATATTATGAAGATAAGCTTGGCACCCGCATCGT
卡那霉素适配体-CACCTAATACGACTCSCTATAGCGGATCCGAAGATGGGGGTTG
AGGCTAAGCCGACCGTAAGTTGGGCCGTCTGGCTCGAACAAGCTTGC
土霉素适配体-CGTACGGAATTCGCTAGCCGAGTTGAGCCGGGCGCGGTACGGGT
ACTGGTATGTGTGGGGATCCGAGCTCCACGTGGGATCCGAGCTCCACGTG
赭曲霉素适配体-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
孔雀石绿适配体-GGAUCCCGACUGGCGAGAGCCAGGUAACGAAUGGAUCC。具体操作步骤如下
(1)传感器表面适配体固定选择链霉亲和素(SA)修饰的多探头光纤传感器，每个探头表面连接ー种适配体，通过通入IOy L浓度为30 y g/L已标记生物素的残留组分对应核酸适配体，在多探头光纤传感器上固定上不同残留组分相应的核酸适配体；
(2)分子标记物偶联将五种待测物通过戊ニ醛法与凝血酶进行偶联标记，标记方法根据待测物基团不同选择，包括EDC/NHS法、戊ニ醛法等，如卡那霉素，可采用戊ニ醛法与凝血酶连接，待用；
(3)标准溶液配制分别称取啶虫脒、卡那霉素、土霉素、赭曲霉素、孔雀石绿5种标准品10mg，溶解于0. 02mol/L (pH = 7. 4)磷酸盐缓冲液定容至10mL，即为lmg/mL的标准贮备液；分别等量量取5种标准贮备液，配制含有5种有害物质残留组分的混合标准原液10U g/mL ;用磷酸盐缓冲液将混合标准原液配制成不同浓度的标准溶液，浓度在pg/mL ng/mL 致，イ衣&为 0,Ing/mL,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL ；
(4)标准曲线绘制将上述浓度为0ng/mL未标记的标准溶液与适量的凝血酶标记有害物质溶液充分混合，该标记溶液中5种有害物质残留组分含量也相等；采用表面等离子共振谱仪测量，通入0. 02mol/L (pH = 7. 4)磷酸盐缓冲液作为测量基准，然后泵入待测混合样品，响应值稳定后通入凝血酶适配体溶液，待表面等离子体共振响应值稳定后，记录表面等离子体共振光谱 (5)通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液，冲洗多探头光纤传感器表面，破坏适配体和待测物的结合,完成传感元件再生；
(6)浓度由低到高，依次通入其他浓度(l-8ng/mL)的待测标准样品测量方法同(4)，获得相应表面等离子体共振光谱图；取各有害物质残留组分的表面等离子体谱图稳定值，绘制标准曲线，并进行多项式曲线拟合，获得浓度-稳定值关系回归曲线方程；
(7)传感芯片再生后，将实际未知浓度待测样品按步骤(4)与适量凝血酶标记有害物质溶液充分混合；泵入的表面等离子体共振谱仪中，同时记录不同有害物质残留组分的光谱图，确定相应稳定值，代入各自标准曲线，确定各组分含量，检测限可达pg/mL ng/mL级；
(8)再次通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液，冲洗表面等离子体共振多探头光纤传感器，进行探头再生，用于下次测量。本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中以啶虫脒、卡那霉素、土霉素、赭曲霉素、孔雀石绿为例进行详细描述，但本发明同样适用于食品中其他有害物质的测定，如肉毒杆菌毒素、雌二醇、四环素类抗生素等的精确检测和定性分析，因此上述内容均在本发明保护范围之内。此外，根据实施例的方法进行检测样品，与现有表面等离子体检测技术相比，准确度提高2 10倍，检测时间缩短5倍以上，探头寿命延长20%，现有表面等离子体检测技术不能准确检测的啶虫脒等小分子量(〈lOOODa)物质，可以采用本发明的方法获得准确的检测结果。
权利要求
1.一种应用表面等离子共振仪的食品中有害物质多残留同时检测方法，对同ー样品中的多种有害物质残留组分的含量进行同时检测，其特征在于包括下述步骤 (一)传感器表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的多探头光纤传感器，每个探头表面连接ー种适配体，通过通入5-50 u L浓度为1-50 u g/L已标记生物素的残留组分对应核酸适配体，在多探头光纤传感器上固定上不同残留组分相应的核酸适配体； (ニ)对待测残留组分进行分子探针标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊ニ醛法交联两个氨基； (三)标准溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置残留组分的标准样品储备液，储备液浓度为0. Ing/mL至lmg/mL，分别等量量取残留组分的标准储备液，配制含有有害物质残留组分的混合标准原液，用磷酸盐缓冲液将混合标准原液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测残留组分的标准溶液和分子探针标记的待测残留组分充分混合； (四)建立标准曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 u L待测混合样品，随后通入5-100 u L浓度为5-100ng/mL的分子探针的适配体溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归曲线的方程；依次测得多种有害物质残留组分的工作曲线，进行多项式曲线拟合，获得各自的标准曲线； (五)定量检测对于未知含量的多种残留组分样品进行检测，同样按照步骤(三)进行；再通入适量分子探针适配体溶液，采用表面等离子共振谱仪记录多种有害物质残留的光谱图；将光谱图中不同残留组分的稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出不同食品中残留组分的浓度值； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗多探头光纤传感器表面，进行传感元件再生，用于下次測量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述分子探针包括凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E，标记方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用多探头光纤传感器为表面等离子共振仪的传感元件，每个探头连接一种适配体，总共连接4 16种不同的适配体。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤 (1)将链霉亲和素SA修饰的光纤传感探头插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰； (2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液； (3)通入5-50UL浓度为1-50U g/L生物素修饰的标记分子适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定； (4)重复步骤(2)至(3)，获得标记分子适配体修饰的光纤传感探头。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用分子探针标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(四)和(五)中通入适量分子探针适配体溶液，提高表面等离子体共振谱仪响应值，适用于测量响应信号较小的小分子量有害物质残留组分。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的小分子量有害物质残留组分的分子量〈1000 Da。
全文摘要
一种基于表面等离子共振(SPR)技术的食品中有害物质多残留同时检测方法，包括传感表面适配体固定、样品标记、样品检测、传感元件再生四个步骤。采用多探头光纤传感器表面连接不同残留组分相应的核酸适配体，加入不同残留组分相应的分子探针标记物并通入传感表面，未标记和标记的残留组分特异性竞争识别相应的核酸适配体。再通入分子探针适配体溶液，与连接在光纤传感器表面的标记样品结合，利用带有多探头光线传感器进行SPR检测。多探头光纤传感器可进行再生，实现传感元件的反复使用。本发明基于SPR技术、适配体特异性竞争识别，实现了同一样品中的多种有害物质残留组分的同时检测，特别是适用于小分子量物质的检测。
文档编号G01N21/55GK102645420SQ20121011073
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者王利兵, 苏荣欣, 韩伟 申请人:王利兵