专利名称：一种检测泰乐菌素和替米考星残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及ー种检测泰乐菌素和替米考星残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。
背景技术：
泰乐菌素和替米考星属于大环内酯类抗生素，在兽医临床上广泛用于治疗革兰氏阳性菌引起的肺炎、乳房炎、全身性败血症，特别是用于治疗畜禽支原体感染。此外泰乐菌素还广泛用作饲料添加剤。泰乐菌素和替米考星在动物组织中的残留，会威胁到食品安全，对人类健康造成危害。泰乐菌素和替米考星易诱导细菌产生耐药性，且耐药性可在细菌之间转移。鉴于此，欧盟在1999年禁止将泰乐菌素用作饲料添加剂(Council Regulation 2821/98，1998)，我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对泰乐菌素和替米考星在动物性食品中残留也规定了最高残留限量。现有的检测泰乐菌素和替米考星残留量的方法主要包括微生物方法、仪器分析方法和免疫化学分析方法等。微生物法虽在残留筛选高通量上表现出良好的性能，但检测耗时长，缺乏特异性，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性产生。仪器分析方法的样品前处理复杂，成本高，操作繁琐，适用于样品的确证分析，而不适用于大批量样品的筛选及现场检測。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合大量样品现场监測。因此对于快速检测泰乐菌素和替米考星在动物组织中的残留，胶体金层析试纸条更具优势。申请号为200610007286. I的中国发明专利公开了ー种用于泰乐菌素残留快速检测的试纸条，可检测O. Ing的泰乐菌素残留。但该试纸条只涉及单ー药物的检测，且该发明提供的样品处理方法较为复杂，判断检测结果时可能需要读条仪器，不便于现场操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测泰乐菌素与替米考星残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。上述目的是通过以下技术方案实现的ー种胶体金试纸条，包括吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在塑料衬板上，所述金标垫包被有胶体金标记的能识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体，所述检测线包被有泰乐菌素包被原，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。所述的能识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株P3C4所分泌的，所述杂交瘤细胞株P3C4已于2007年3月28日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:C200719。杂交瘤细胞株P3C4已在申请号为200710052663. 8的发明专利中公开，
公开日为2008年I月16日。
所述泰乐菌素包被原是去碳霉糖泰乐菌素一 O —羧甲基羟胺ー卵清蛋白偶联物(DES-A0AA-0VA)。所述的胶体金试纸条的使用方法，包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液为柠檬酸-こ腈缓冲液，其配制方法为称取一水合柠檬酸3. 992g，ニ水合柠檬酸三钠23. 822g，去离子水溶解，定容至IOOOmL得檬酸缓冲液，取こ腈20mL，柠檬酸缓冲液180mL，混匀，所述前处理方法为称取均质后的组织样品lg，加入样品提取液9mL，漩涡I分钟，以4000转/分钟的转速，室温离心10分钟，取上清液。所述组织样品为牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝中的ー种或多种。所述的胶体金试纸条在泰乐菌素和替米考星残留检测中的应用。具体步骤如下
( I)复苏杂交瘤细胞株P3C4，免疫小鼠，制备单克隆抗体，并利用辛酸硫酸铵进行纯化；(2)利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，优化标记条件，制备胶体金标记的单克隆抗体；(3)将包被原DES-A0AA-0VA和羊或兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上；(4)将待测样品用样品提取液提取，用试纸条检测。检测时，若样品中有泰乐菌素或替米考星，泰乐菌素或替米考星先和胶体金标记的单克隆抗体結合，到达检测线时，已结合了泰乐菌素与替米考星的胶体金标记的单克隆抗体就不会与包被在硝酸纤维素膜上的包被原发生结合，就不会在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线，胶体金标记的抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阳性結果。若样品中不含有泰乐菌素与替米考星，检测时，胶体金标记的单克隆抗体就会与包被在硝酸纤维素膜上的包被原发生结合，在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线，未反应完的胶体金标记的抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阴性结果O本发明的胶体金试纸条能同时检测泰乐菌素和替米考星，一次測定即可检出泰乐菌素和替米考星在可食性动物组织中的残留，而现有技术仅能检测泰乐菌素，对于组织中替米考星是否残留无法分辨，需要采用其它方法进行检測，因此本发明试纸条在检测药物的种类上具有明显的优势，可以节省对样品的分析次数，具有更好的经济价值。本发明试纸条的检测速度快，灵敏度高，特异性强，样品处理方法简单，易操作，样品处理所用的主要试剂为こ腈和柠檬酸缓冲液，对操作者身体健康危害较小。
图I是本发明的技术路线图。图2是本发明胶体金试纸条的结构示意图，图中1 一吸收垫；2 —硝酸纤维素膜；3 一金标垫；4 一样品垫；5 —检测线；6 —质控线；7 —塑料衬板。图3是本发明胶体金试纸条的显色示意图，图中a —明性、b —阳性、c ー无效，其中T为检测线，C为质控线。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进ー步说明，但不限制本发明。实施例I胶体金试纸条的制备I. I单克隆抗体的制备及纯化I. I. I腹水的制备在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射O. 5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC N0:C200719的杂交瘤细胞株P3C4扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种
O.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。I. I. 2单克隆抗体的纯化參照朱立平等《免疫学常用实验方法》人民军医出版社 2000版中的方法取所得的小鼠腹水5ml与适量的ニ氧化硅混合，加入等体积的巴比妥缓冲液，室温振荡Ih后，室温静置30min，取上清于洁净离心管中，4°C，3000r/m离心IOmin ；取上清液8ml，加入16ml O. 06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4. 5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132μ1后，室温搅拌30min，然后转入4°C冰箱充分沉淀2h，4°C，15000r/m离心30min,得上清液22ml，加入2. 2ml O. IM的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7. 6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为O. 277g/ml，4°C冰箱充分沉淀2h后，4°C，12000r/m离心30min，弃上清，沉淀用5ml O. IM的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000ml O. OlM pH7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析后，再对2000ml蒸馏水透析，最后对3000ml三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚こニ醇ー 20000 (PEG 一 20000)浓缩至3ml，然后4°C，12000r/m离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为3. 3mg/ml。经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为98%。该单克隆抗体可用于制备检测泰乐菌素与替米考星残留的试剂。I. 2胶体金、胶体金标记的单克隆抗体的制备I. 2. I溶液的配制(I)氯金酸的配制用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml 1%氯金酸溶液配方IOg氯金酸；双蒸去离子水定容至1000ml。(2)柠檬酸三钠的配制用双蒸去离子水溶解柠檬酸三钠，配成1%溶液，O. 22ΜΠ1膜滤过，置4°C备用，有效期四个月，双蒸去离子水定容至1000ml。(3) O. IM碳酸钾的配制用双蒸去离子水配制，O. 22ΜΠ1膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml O. IM碳酸钾溶液配方13. 8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。(4) 2% PEG-20000的配制用双蒸去离子水配制，O. 22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml2% PEG-20000溶液配方20g PEG-20000 ;双蒸去离子水定容至1000ml。(5)标记洗涤保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)，0. 05%叠氮钠(NaN3)，O. OlMPH 7.2 PBS溶液，O. 22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方20g BSA, O. 5g NaN3, O. OlM pH 7. 2 PBS 溶液定容至 1000ml。I. 2. 2胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成O. 01%，置电炉煮沸，按每IOOml O. 01%氯金酸加入2ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。I. 2. 3胶体金标记的单克隆抗体的制备
将20ml胶体金加入50ml小烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌,加入O. IM的K2CO3调节至最佳pH处。缓慢逐滴加入杂交瘤细胞株P3C4所分泌的单克隆抗体,搅拌反应30min。加入10%的BSA溶液，使BSA终浓度达到1%，持续搅拌lOmin。4°C条件下静置lh。将标记好的单克隆抗体复合物以lOOOOr/mir^fC离心30min,弃去上清；沉淀用含1%BSA的IOmM磷酸盐缓冲液(PB，pH值约为7. O)缓冲液重悬于原体积，重复离心两次；沉淀用配好的含1%BSA的IOmM的PB (含O. 02%NaN3)缓冲液重悬于原体积1/10中，4°C保存备用。I. 3金标垫3的制备封闭液的配制2% BSA, O. 1%聚こニ醇辛基苯基醚(Triton Χ_100)、0· 05%NaN3, O. OlM ρΗ7· 2 PBS溶液，0. 22Mm微孔滤膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方20g BSA, 0. 5g NaN3iIml Triton X_100、0. OlM pH7. 2PBS 溶液定容至 1000ml。金标垫3的制备将金标垫3浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干。然后将制备好的胶体金标记的抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装， 置4°C备用。I. 4试纸条样品垫4的制备封闭液的配制2%BSA, 0. 1% Triton Χ_100、0· 05% NaN3, 0. OlM pH 7.2 PBS 溶液，0. 22Mm微孔滤膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方20g BSA, 0. 5gNaN3'Iml Triton X_100、0. OlM ρΗ7· 2PBS 溶液定容至 1000ml。样品垫4的制备将样品垫4浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干，封装，置4°C备用。I. 5试纸条的组装将吸收垫I、硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫4按图2所示依次层叠粘贴在塑料衬板7上，切成3mm宽的小条。每十小条ー包，加入干燥剂，真空封装。4 8°C保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。实施例2胶体金试纸条的使用方法和应用2. I胶体金试纸条检测方法的优化当包被原的浓度大于0. 05mg/ml时,利用泰乐菌素10 μ g/L的浓度药物检测，结果为阴性；当包被浓度小于0. 05mg/ml时，检测10 μ g/L药物结果为阳性，但是空白样品的检测线同样显色很浅。当包被原的浓度为0. 05mg/ml时,检测泰乐菌素10 μ g/L的浓度结果为阳性，同时阴性空白对照检测线显色清晰。质控线羊或兔抗鼠IgG包被浓度为0. 3mg/ml时，阴性空白质控线与检测线显色相差不多。最终选择羊或兔抗鼠IgG包被浓度为0. 05mg/ml,质控线的浓度为0. 3mg/ml。2.2样品前处理方法泰乐菌素样品提取液(柠檬酸缓冲液)准确取一水合柠檬酸3. 992g，ニ水合柠檬酸三钠23. 822g，去离子水溶解，定容至IOOOmL,现配现用。取こ腈20mL，柠檬酸缓冲液180mL，混匀。用于牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝组织中泰乐菌素和替米考星的提取。组织样品的前处理称取均质后的组织样品I. 0g±0. 02g于50mL离心管中，カロ入提取液9mL,镟润Imin , 4000r/min,室温离心IOmin0取上清液100 μ L检测。牛奶样品的前处理称取均质后的样品Iml于50mL离心管中，加入提取液4mL，镟涡Imin , 4000r/min,室温离心lOmin。取上清液100 μ L检测。2. 3胶体金试纸条检测步骤毎次使用试纸条检测时均需要设置对照用移液器或者滴管滴加100 μ L水或者阴性的样品于样品口中。样品检测方法将待测样品处理后，取IOOyL加入加样孔中，通过样品检测试纸条和对照试纸条检测线的显色情况比较来判断待测样品的阴阳性。阴阳性判断标准如样品检测试纸条和对照的检测试纸条颜色深浅一致或者略浅，结果判断为阴性；如果样品检测试纸条检测线没有出现或者检测线明显浅于对照试纸条检测线，结果判断为阳性。2. 4胶体金试纸条性能參数的确定2. 4. I 检测限在动物可食性组织和产品中添加泰乐菌素和替米考星标准品，添加Ομ g/L、50 μ g/L,60 μ g/L,70 μ g/L,80 μ g/L,90 μ g/L, 100 μ g/L 和 200μ g/L 不同浓度，样品处理后，用试纸条检测，检测结果表明当泰乐菌素药物浓度等于或大于ΙΟΟμ g/kg时，检测线完全不显色，结果显示为阳性，当浓度低于100 μ g/kg时结果为阴性。所以试纸条的泰乐菌素的检测限为ΙΟΟμ g/kg。当替米考星药物浓度等于或大于80 μ g/kg吋，检测线完全不显色，结果显示为阳性，当浓度低于80 μ g/kg时结果为阴性。所以试纸条的替米考星的检测限为80 μ g/kg。2、特异性測定泰乐菌素试纸条的特异性，用PBS配制大环内酯类药物(泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、红霉素、吉他霉素)和其他药物(莱克多巴胺、克伦特罗、氯霉素)的标准品，配制成10 μ g/L、100 μ g/L、200 μ g/L的浓度，并设置阴性对照，用试纸进行检测，每个浓度设置三个重复试验，观察显色結果。结果显示，当药物浓度为10 μ g/L时，试纸条对泰乐菌素、替米考星药物检测结果为阳性；药物浓度为100 μ g/L、200 μ g/L吋，试纸条检测大环内脂类其他药物，螺旋霉素、红霉素、吉他霉素和其他药物以及莱克多巴胺、克伦特罗、氯霉素等药物，检测结果均为阴性，结果表明本发明试纸条具有较高的特异性。3、假阴性率与假阳性率測定取添加泰乐浓度为O μ g/L、50 μ g/L、100 μ g/L、200 μ g/L的动物可食性组织和产品样品各25份，分别用试纸进行检测。室温条件下操作，肉眼观测进行判定。用Oyg/L及50 μ g/L浓度的添加样品计算假阳性率，假阳性率=假阳性样品数/100 X 100% ;用IOOyg/L、200 μ g/L浓度的添加样品计算假阴性率，假阴性率=假阴性样品数/100X 100%。试纸条检测结果如表I所示，其中50份空白样品和添加药物浓度为50 μ g/kg时，检测结果全部为阴性，药物浓度100μ g/kg、200 μ g/kg，检测结果全部为阳性，对于200份样品检测结果，试纸条阳性符合率为100% (100/100)，阴性符合率为100%(100/100)，说明试纸条的准确性比较高。表I泰乐菌素与替米考星试纸条的假阴性率与假阳性率測定结果
权利要求
1.一种胶体金试纸条，包括吸收垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)，所述硝酸纤维素膜(2)上设有检测线(5)和质控线(6)，所述吸收垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)依次粘贴在塑料衬板(7)上，其特征在于所述金标垫(3)包被有胶体金标记的能识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体，所述检测线(4)包被有泰乐菌素包被原，所述质控线(5)包被有羊或兔抗鼠IgG。
2.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的能识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C200719的杂交瘤细胞株P3C4所分泌的。
3.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述泰乐菌素包被原是去碳霉糖泰乐菌素一 O —羧甲基羟胺ー卵清蛋白偶联物。
4.如权利要求I一 3任何一项所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液为柠檬酸-こ腈缓冲液，其配制方法为称取一水合柠檬酸3. 992g，ニ水合柠檬酸三钠23. 822g，去离子水溶解，定容至IOOOmL得檬酸缓冲液，取こ腈20mL，柠檬酸缓冲液180mL，混匀，所述前处理方法为称取均质后的组织样品lg，加入样品提取液9mL，漩涡I分钟，以4000转/分钟的转速，室温离心10分钟，取上清液。
5.如权利要求4所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于所述组织样品为牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝中的ー种或多种。
6.权利I一 3任何一项所述的胶体金试纸条在泰乐菌素和替米考星残留检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金试纸条，该试纸条由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠粘贴在塑料衬板上构成，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述金标垫包被有胶体金标记的能识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体，所述检测线包被有去碳霉糖泰乐菌素－O－羧甲基羟胺－卵清蛋白偶联物，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。本发明还公开了一种胶体金试纸条的使用方法和在泰乐菌素和替米考星残留检测中的应用。本发明可用于对牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝等组织进行泰乐菌素和替米考星残留检测，具有灵敏度高，特异性强，操作简便，检测快速、准确和检测费用低廉等优点。
文档编号G01N33/577GK102707059SQ201210177238
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘振利, 彭大鹏, 彭庆娟, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞 申请人:华中农业大学