硫酸阿米卡星注射液中杂质的检测方法
【专利摘要】提供了一种检测硫酸阿米卡星注射液中杂质D卡那霉素的含量的方法，所述方法包括以下步骤：量取硫酸阿米卡星注射液，加水稀释制成每1mL中含硫酸阿米卡星1-5mg的溶液，经衍生化处理后，作为测试溶液；量取卡那霉素对照品，加水稀释成每1mL中含10-50μg卡那霉素的溶液，经衍生化处理后，作为卡那霉素对照品溶液；量取卡那霉素对照品溶液5-100μL注入高效液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的30-60%；量取测试溶液与对照品溶液各10-100μL，分别注入高效液相色谱仪；测试溶液的色谱图中如有与卡那霉素保留时间一致的色谱峰，根据卡那霉素标准曲线得到测试溶液中杂质卡那霉素的含量。
【专利说明】硫酸阿米卡星注射液中杂质的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种硫酸阿米卡星注射液中杂质的检测方法，具体涉及以柱前衍生化-HPLC法对硫酸阿米卡星注射液中已知杂质D卡那霉素的检测方法。
【背景技术】
[0002]硫酸阿米卡星注射液的主要成分是硫酸阿米卡星，本品对多数肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属等均具有良好作用，可用于治疗革兰阴性杆菌所致的各种严重感染等。
[0003]欧洲药典、英国药典中均指明了硫酸阿米卡星注射液中有四种已知杂质，分别为杂质A、B、C、D，而中国药典中仅仅控制了已知杂质A，该杂质为合成过程中产生的杂质，在注射液生产及贮存过程中，杂质A的量不会增加。而已知杂质D卡那霉素为降解杂质，在制剂制备及贮存过程中含量会有所增加。且卡那霉素的肾毒性和耳毒性均强于阿米卡星，临床应用卡那霉素后还会产生造血系统毒性反应，引起白细胞减少，严格控制其限度是化学分析工作中的重要环节。
[0004]按照《中国药典》2010年版硫酸阿米卡星注射液有关物质项下方法对已知杂质D进行方法学考察，主药硫酸阿米卡星浓度为lOmg/mL时，杂质D卡那霉素的平均回收率较低，为66.29%，RSD为19.6% ;欧洲药典、英国药典中规定衍生化样品应贮存在10°C环境下，经考察，在该温度下，样品稳定性较差，24h内测得卡那霉素的含量下降了 76.5%。可见，采用药典方法对杂质D卡那霉素进行定量测定是不准确的。因此，提供一种硫酸阿米卡星注射液中已知杂质卡那霉素的检测方法，是有关方面所十分需要的。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题是现有检测方法中回收率低、稳定性差的缺点，提供一种准确、稳定的检测方法，用于检测硫酸阿米卡星注射液中已知杂质D卡那霉素的含量。
[0006]本发明一方面一种检测硫酸阿米卡星注射液中杂质D卡那霉素的含量的方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]量取硫酸阿米卡星注射液,加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_5mg的溶液，经衍生化处理后，作为测试溶液；
[0008]量取卡那霉素对照品，加水稀释成每ImL中含10-50 U g卡那霉素的溶液，经衍生化处理后，作为卡那霉素对照品溶液；
[0009]量取卡那霉素对照品溶液5-100 U L注入高效液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的30-60% ；
[0010]量取测试溶液与对照品溶液各10-100 U L，分别注入高效液相色谱仪；测试溶液的色谱图中如有与卡那霉素保留时间一致的色谱峰，根据卡那霉素标准曲线得到测试溶液中杂质卡那霉素的含量。
[0011]在本发明的一个优选实例中，所述衍生化处理包括:量取0.2mL待处理溶液至IOmL量瓶中，加1.0%的2，4，6-三硝基苯磺酸溶液2mL和吡啶3mL ;然后强力振摇30秒；将量瓶置水浴保温2小时，然后在冷水中冷却2分钟；然后在量瓶中加入冰醋酸2mL ;强力振摇30秒后用水稀释至刻度，并摇匀。
[0012]在本发明的一个优选实例中，所述水浴的温度为50-100°C，较好60_90°C，更好为70-80°C，最好 75°C。
[0013]在本发明的一个优选实例中，所述盐酸阿米卡星注射液一般加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_4mg的溶液,更好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_3mg的溶液，最好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星2mg的溶液。
[0014]在本发明的一个优选实例中，卡那霉素对照品加水稀释成每ImL中含15-40 μ g卡那霉素的溶液，更好加水稀释成每ImL中含15-30 μ g卡那霉素的溶液，最好加水稀释成每ImL中含20 μ g卡那霉素的溶液
[0015]在本发明的一个优选实例中，量取卡那霉素对照品溶液10-90 μ L注入高效液相色谱仪，更好量取卡那霉素对照品溶液20-80 μ L注入高效液相色谱仪，最好量取卡那霉素对照品溶液40-60 μ L注入高效液相色谱仪。
[0016]在本发明的一个优选实例中，主成分色谱峰的峰高为满量程的30-60%，较好为满量程的40-60%，更好为满量程的45-55%，最好为满量程的55%。
[0017]在本发明的一个优选实例中，量取测试溶液与对照品溶液各10-100 μ L分别注入高效液相色谱仪，较好量取测试溶液与对照品溶液各10-90 μ L分别注入高效液相色谱仪，量取测试溶液与对照品溶液各20-80 μ L分别注入高效液相色谱仪，量取测试溶液与对照品溶液各40-60 μ L分别注入高效液相色谱仪。
[0018]在本发明的一个优选实例中，上述测试溶液和对照品溶液存放在5_40°C环境中，较好在10-30°C环境中，更好在20-25°C环境中，最好为室温。
[0019]本发明的检测方法相比现有检测方法来说可以准确、稳定的检测硫酸阿米卡星注射液中已知杂质D卡那霉素的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为杂质D卡那霉素对照图谱(标准曲线绘制:卡那霉素对照浓度20 μ g/ml)。
[0021]图2为卡那霉素含量测定标准曲线(卡那霉素含量测定标准曲线的绘制)。
[0022]图3为硫酸阿米卡星注射液有关物质卡那霉素加样回收图谱(准确度试验:硫酸阿米卡星注射液浓度2mg/ml,卡那霉素对照的加样浓度20 μ g/ml)。
[0023]图4为硫酸阿米卡星注射液有关物质图谱(实施例5，产品批号:110525)。
[0024]图5为酸破坏图谱(专属性试验:酸破坏样品)。
[0025]图6为碱破坏图谱(专属性试验:碱破坏样品)。
[0026]图7为氧化破坏图谱(专属性试验:氧化破坏样品)。
[0027]图8为光破坏图谱(专属性试验:光破坏样品)。
[0028]图9为热破坏图谱(专属性试验:热破坏样品)。
【具体实施方式】
[0029]本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60 - 120和80 - 110的范围，理解为60 - 110和80 - 120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值I和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到:1 一 3、I 一 4、I 一 5、2 — 3、2 — 4、和 2 — 5。
[0030]在本发明中，除非有其他说明，组合物的各组分的含量范围以及其优选范围之间可以相互组合形成新的技术方案。
[0031 ] 在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
[0032]在本发明中，除非有其他说明，所有“份”和百分数(％)都指重量百分数。
[0033]在本发明中，除非有其他说明，所有组合物中各组分的百分数之和为100%。
[0034]在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a_b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了 “0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
[0035]在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a_b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
[0036]如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
[0037]如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。
[0038]在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
[0039]在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
[0040]在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
[0041 ] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“阿米卡星”、“硫酸阿米卡星”等都表示硫酸阿米卡星，其包含通常包含的杂质，例如杂质A、B、C和/或D。
[0042]本发明提供了一种检测硫酸阿米卡星注射液中杂质D卡那霉素的含量的方法，所述方法包括以下步骤:
[0043]量取硫酸阿米卡星注射液,加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_5mg的溶液，经衍生化处理后，作为测试溶液；
[0044]量取卡那霉素对照品，加水稀释成每ImL中含10_50 μ g卡那霉素的溶液，经衍生化处理后，作为卡那霉素对照品溶液；
[0045]量取卡那霉素对照品溶液5-100 μ L注入高效液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的30-60% ；
[0046]量取测试溶液与对照品溶液各10-100 μ L，分别注入高效液相色谱仪；测试溶液的色谱图中如有与卡那霉素保留时间一致的色谱峰，根据卡那霉素标准曲线得到测试溶液中杂质卡那霉素的含量。[0047]在本发明中，所述盐酸阿米卡星注射液是常规的。例如，盐酸阿米卡星注射液可购自上海信谊金朱药业有限公司等。
[0048]在本发明中，所述衍生化处理是已知的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接进行衍生化处理。例如，衍生化处理可参见中国药典2010年版阿米卡星含量测定项下的操作。在本发明的一个优选实例中，所述衍生化处理包括:量取0.2mL待处理溶液至IOmL量瓶中，加1.0%的2，4，6-三硝基苯磺酸溶液2mL和吡啶3mL ;然后强力振摇30秒；将量瓶置水浴保温2小时，然后在冷水(2-10°C)中冷却2分钟；然后在量瓶中加入冰醋酸2mL ;强力振摇30秒后用水稀释至刻度，并摇匀。在本发明的另一个优选实例中，所述水浴的温度为 50-100°C，较好 60-90°C，更好为 70_80°C，最好 75°C。
[0049]在本发明中，所述盐酸阿米卡星注射液一般加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l-5mg的溶液,较好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_4mg的溶液,更好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_3mg的溶液,最好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星2mg的溶液。
[0050]在本发明中，卡那霉素对照品一般加水稀释成每ImL中含10-50 μ g卡那霉素的溶液，较好加水稀释成每ImL中含15-40 μ g卡那霉素的溶液，更好加水稀释成每ImL中含15-30 μ g卡那霉素的溶液,最好加水稀释成每ImL中含20 μ g卡那霉素的溶液
[0051 ] 在本发明中，一般量取卡那霉素对照品溶液5-100 μ L注入高效液相色谱仪，较好量取卡那霉素对照品溶液10-90 μ L注入高效液相色谱仪，更好量取卡那霉素对照品溶液20-80 μ L注入高效液相色谱仪，最好量取卡那霉素对照品溶液40-60 μ L注入高效液相色谱仪。
[0052]在本发明中，主成分色谱峰的峰高一般为满量程的30-60%，较好为满量程的40-60%，更好为满量程的45-55%，最好为为满量程的55%。
[0053]在本发明中，一般量取测试溶液与对照品溶液各10-100 μ L分别注入高效液相色谱仪，较好量取测试溶液与对照品溶液各10-90 μ L分别注入高效液相色谱仪，量取测试溶液与对照品溶液各20-80 μ L分别注入高效液相色谱仪，量取测试溶液与对照品溶液各40-60 μ L分别注入高效液相色谱仪。在本发明的一个优选实例中，所述测试溶液和对照品溶液的用量是相同或不同的。在本发明的一个优选实例中，所述测试溶液和对照品溶液的用量是相同的。
[0054]在本发明中，虽然没有具体限制，但是上述测试溶液和对照品溶液可以存放在5-40°C环境中，较好在10-30°C环境中，更好在20-25°C环境中，最好为室温。
[0055]本发明所涉及的试验过程(参照《中国药典》2010年版二部及《英国药典》2009年版)如下:
[0056]1、有关物质含量测定方法的建立
[0057]专属性试验(破坏性试验)
[0058]取供试品10支，混匀，精密量取本品ImL于50mL量瓶中，按下述各条件配制供试
品O
[0059]未破坏:加水稀释并定容至刻度，混匀后照衍生化方法进行处理，摇匀，备用；
[0060]酸破坏:加0.lmol/L的盐酸溶液稀释至刻度，混匀，室温避光放置10天，照衍生化方法进行处理，摇匀，备用；[0061 ] 碱破坏:加0.lmol/L的氢氧化钠溶液稀释至刻度，混匀，室温避光放置10天，照衍生化方法处理，摇匀，备用；
[0062]氧化破坏:加3%的过氧化氢溶液稀释至刻度，混匀，室温避光放置10天，照衍生化方法处理，摇匀，备用；
[0063]光照破坏:加水稀释并定容至刻度，混匀，置强光下(4500±500Lx)照射10天，照衍生化方法处理，摇匀，备用；
[0064]高温破坏:加水稀释并定容至刻度，混匀，置于80°C烘箱中加热10天，放冷，照衍生化方法处理，摇匀，备用。
[0065]分别取上述溶液各50μ L，注入液相色谱仪，记录色谱图，与未破坏样品进行比较。结果表明，阿米卡星在氧化和紫外光照条件下较为稳定，在强酸、强碱和高温条件下破坏，均会产生降解杂质卡那霉素，其他杂质峰均无明显变化，卡那霉素峰与阿米卡星主峰及其它各杂质峰分离良好，说明该方法专属性强，可较好地分离并检测出硫酸阿米卡星注射液中杂质卡那霉素的含量。
[0066]定量限的测定
[0067]取卡那霉素对照品适量，逐级稀释后，照衍生化方法进行处理，进样测定，按10:1信噪比作为定量限，结果为2ng。
[0068](3)耐用性试验
[0069]照衍生化方法分别对供试品溶液和对照品溶液进行处理，进样测定，色谱条件与流动相发生一定改变时考察其耐用性。
[0070]耐用性试验结果
[0071]
【权利要求】
1.一种检测硫酸阿米卡星注射液中杂质D卡那霉素的含量的方法，所述方法包括以下步骤: 量取硫酸阿米卡星注射液，加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_5mg的溶液，经衍生化处理后，作为测试溶液； 量取卡那霉素对照品，加水稀释成每ImL中含10-50 μ g卡那霉素的溶液，经衍生化处理后，作为卡那霉素对照品溶液； 量取卡那霉素对照品溶液5-100 μ L注入高效液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的30-60% ； 量取测试溶液与对照品溶液各10-100 μ L，分别注入高效液相色谱仪；测试溶液的色谱图中如有与卡那霉素保留时间一致的色谱峰，根据卡那霉素标准曲线得到测试溶液中杂质卡那霉素的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化处理包括:量取0.2mL待处理溶液至IOmL量瓶中，加1.0%的2，4，6-三硝基苯磺酸溶液2mL和吡啶3mL ;然后强力振摇30秒；将量瓶置水浴保温2小时，然后在冷水中冷却2分钟；然后在量瓶中加入冰醋酸2mL ;强力振摇30秒后用水稀释至刻度，并摇匀。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水浴的温度为50-100°C，较好60-90°C，更好为70-80°C，最好75°C。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐酸阿米卡星注射液一般加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l_4mg的溶液，更好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星l-3mg的溶液,最好加水稀释制成每ImL中含硫酸阿米卡星2mg的溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，卡那霉素对照品加水稀释成每ImL中含15-40 μ g卡那霉素的溶液,更好加水稀释成每ImL中含15_30 μ g卡那霉素的溶液,最好加水稀释成每ImL中含20 μ g卡那霉素的溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，量取卡那霉素对照品溶液10-90μ L注入高效液相色谱仪，更好量取卡那霉素对照品溶液20-80 μ L注入高效液相色谱仪，最好量取卡那霉素对照品溶液40-60L注入高效液相色谱仪。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，主成分色谱峰的峰高为满量程的30-60%，较好为满量程的40-60%，更好为满量程的45-55%，最好为满量程的55%。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，量取测试溶液与对照品溶液各10-100μ L分别注入高效液相色谱仪，较好量取测试溶液与对照品溶液各10-90 μ L分别注入高效液相色谱仪，量取测试溶液与对照品溶液各20-80 μ L分别注入高效液相色谱仪，量取测试溶液与对照品溶液各40-60 μ L分别注入高效液相色谱仪。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述测试溶液和对照品溶液存放在5-40°C环境中，较好在10-30°C环境中，更好在20-25°C环境中，最好为室温。
【文档编号】G01N30/02GK103512965SQ201210206258
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2012年6月20日
【发明者】刘长海, 常靓, 陆峰, 张明媛, 张军东 申请人:上海信谊药厂有限公司