一种糖敏灵制剂中14种化学成分的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种糖敏灵制剂中化学成分的检测方法，该方法包括，将被检测的糖敏灵制剂样品用甲醇提取，然后用高效液相色谱进行检测，色谱条件为采用C18色谱柱，流动相A相为乙酸或磷酸或甲酸或十二烷基磺酸钠水溶液，B相为乙腈或甲醇，检测器为二极管阵列检测器。本发明具有很好的线性、重复性、重现性和回收率，有助于更加全面控制糖敏灵的质量。
【专利说明】一种糖敏灵制剂中14种化学成分的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于现代中药应用领域，特别涉及一种糖敏灵制剂中化学成分的检测方法。
【背景技术】
[0002]糖敏灵丸是在临床验证的有效方开郁清胃颗粒基础上加减变化与剂型改革而成。糖敏灵丸由黄连、大黄、黄芩、白芍、柴胡、枳实、山楂、乌梅、半夏、天花粉共十味常用中药组成，具有开郁清胃、滋阴降火、通腑泻浊之功效。临床观察证实其对II型糖尿病的血糖有明显的改善作用，尤其是对体型偏胖的早中期II型糖尿病患者效果更加显著。同时，药理实验揭示糖敏灵能显著增强高热量饲料诱导的胰岛素抵抗模型糖尿病大鼠和自发性II型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。
[0003]为使糖敏灵药物生产标准化，达到疗效确切，质量稳定的目的，需要准确检测糖敏灵制剂的化学成分。糖敏灵丸所含的药物成分中，可以确定的药物活性物质包括:柚皮苷、黄芩苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素，橙皮苷、盐酸药跟碱、盐酸黄连碱、汉黄芩苷、盐酸巴马亭、柚皮素、千层纸素A、白杨素。这些物质均属于已知物质，为更加全面控制糖敏灵制剂的质量，建立满足中药现代化的质量控制标准，需要一种可以同时检测糖敏灵制剂中多种化学成分的分析方法。
【发明内容】
[0004]为使糖敏灵药物生产标准化，达到疗效确切，质量稳定的目的。本发明提供了一种检测本发明制剂中14种药物活性物质的方法，该方法采用HPLC法对其中的药物活性物质同时进行含量测定。该方法精密度、灵敏度、稳定性均好，确保产品质量的“安全、均一、稳定、有效、可控”。
[0005]本发明提供了一种糖敏灵制剂中化学成分的测定方法，技术解决方案如下:
[0006]检测样品采用甲醇提取，然后采用高效液相色谱进行检测，色谱条件为采用C18色谱柱，流动相A相为乙酸或磷酸或甲酸或十二烷基磺酸钠水溶液，B相为乙腈或甲醇，检测器为二极管阵列检测器。
[0007]根据本发明实施方式之一，检测样品采用甲醇超声提取。
[0008]根据本发明的实施方式之一,流动相A相为pH为3-5的醋酸盐缓冲液，含体积比为0.2%-0.8%的三乙胺，B相为乙腈。
[0009]优选的，A相为pH3.5的醋酸盐缓冲液，含体积比为0.5%的三乙胺，B相为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱方法为:
[0010]O ?24min, 19%B 相—20%B 相；
[0011]24 ?30min，20%B 相—25%B 相；
[0012]30 ?35min，25%B 相—35%B 相；
[0013]35 ?55min，35%B 相—55%B 相。[0014]考察了多种流动相系统，包括甲醇-磷酸-水系统、乙腈-磷酸-水系统、乙腈-磷酸-磷酸二氢钾-水系统和乙腈-冰醋酸-三乙胺-水系统，结果表明在流动相中加入冰醋酸或磷酸可以提高黄酮类成分的分离度，而加入三乙胺作为离子对试剂，可以使生物碱类成分的分离度和峰形得到极大改善，因此优选乙腈-冰醋酸-三乙胺-水系统为流动相系统。
[0015]试验考察了三乙胺浓度为0.2%,0.5%,0.8%时，生物碱成分的色谱行为，结果表明当三乙胺浓度为0.5%时，各峰之间分离度好，峰形锐。
[0016]考察了 pH值对待测样品色谱行为的影响。结果表明，pH在3-5范围内，随着pH值增加，黄芩苷和汉黄芩苷的保留能力增强，而4种生物碱的保留能力增加，但部分待测组分色谱峰重叠，因此优选A相pH值为3.5。
[0017]根据本发明的另一实施方式,流动相流速为0.8-1.2mL/min。
[0018]优选地,流动相流速为1.0mL/min。
[0019]根据本发明的再一实施方式，色谱柱温为25_35°C。
[0020]优选地，色谱柱温为30°C。
[0021]优选地，柱温为30°C。发明人考察了柱温(不控温、25°〇、301:、351:)对分离效果的影响使用，结果表明柱温30°C的情况下，制剂中待测组分峰形对称，分离度高且分析结果稳定。
[0022]根据本发明的再一实施方式，检测器波长为220_345nm。
[0023]优选地，检测器波长·为278nm。
[0024]实验表明:黄酮类成分在278nm有最大吸收,生物碱类成分在278nm和345nm处有最大吸收。选择278nm为检测波长，各指标成分吸收较强且干扰成分少。
[0025]根据本发明的检测方法，检测出的糖敏灵制剂中的化学成分为柚皮苷、黄芩苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素、橙皮苷、盐酸药跟碱、盐酸黄连碱、汉黄芩苷、盐酸巴马亭、柚皮素、千层纸素A和白杨素。它们的含量测定结果分别为12.19-34.59mg.g'
13.34-21.77mg.g \ 13.17-35.42mg.g \ 13.78-18.75mg.g \ 5.175-6.366mg.g \
2.536-3.585mg.g-1、2.714-5.265mg.g_1>0.1786-0.4344mg.g_1> 1.745-2.865mg.g-1、
0.5570-1.374mg.g \0.9185-1.349mg.g \0.1099-0.3353mg.g \0.6955-0.8649mg.g \
5.381 X 10_2-8.551 X 10_2mg.g—1。
[0026]本发明利用HPLC测定了糖敏灵中14种化学成分的含量，具有很好的线性、重复性、重现性和回收率，有助于更加全面控制糖敏灵的质量。
[0027]本发明所述糖敏灵制剂包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉针剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、滴剂、贴剂、滴丸。因为药物活性成分相同，所以本发明提供的方法可以用于多种不同制剂的检测。
[0028]本发明所述糖敏灵丸由下列重量份的原料制成:
[0029]天花粉10~30份，柴胡10~30份，枳实3~15份，大黄I~6份，半夏I~12份，黄芩3~15份，黄连f 12份，白芍3~15份，乌梅5~20份，山楂3~15份。
[0030]制备方法如下:所述的黄芩加水提取两次，每次I小时，提取液加浓盐酸调pH值至
1.5~2.0，80°C保温I小时，抽滤，滤饼干燥，得黄芩提取物；所述的黄连加75%乙醇提取2次每次2小时，提取液减压回收乙醇，加入浓盐酸调pH值至1.0?2.0，抽滤，滤饼干燥，得黄连提取物；其余8味药用水回流提取2次，每次I小时，提取液减压浓缩至1:1，加入95%乙醇至含醇量70%，滤过，滤液减压浓缩至稠膏加入黄连提取物与黄芩提取物，即得糖敏灵制剂的药物活性成分。药物活性成分与微晶纤维素按适当比例混合，按照常规方法制备成浓缩丸。
[0031]本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1对照品色谱图。1-柚皮苷、2-橙皮苷、3-黄芩苷、4-新橙皮苷、5-药根碱、6-黄连碱、7-汉黄芩苷、8-巴马亭、9-小檗碱、10-柚皮素、11-黄芩素、12-汉黄芩素、13-白杨素、14-千层纸素A。
[0033]图2糖敏灵丸色谱图。1-柚皮苷、2-橙皮苷、3-黄芩苷、4-新橙皮苷、5-药根碱、6-黄连碱、7-汉黄芩苷、8-巴马亭、9-小檗碱、10-柚皮素、11-黄芩素、12-汉黄芩素、13-白杨素、14-千层纸素A。
[0034]图3黄连阴性对照色谱图。1-柚皮苷、2-橙皮苷、3-黄芩苷、4-新橙皮苷、7-汉黄芩苷、10-柚皮素、11-黄芩素、12-汉黄芩素、13-白杨素、14-千层纸素A。
[0035]图4黄芩阴性对照色谱图。1-柚皮苷、2-橙皮苷、4-新橙皮苷、5-药根碱、6_黄连碱、8-巴马亨、9-小檗碱、10-柚皮素。
[0036]图5枳实阴性对照色谱图。3-黄芩苷、5-药根碱、6-黄连碱、7-汉黄芩苷、8-巴马亭、9-小檗碱、11-黄芩素、12-汉黄芩素、13-白杨素、14-千层纸素A。
[0037]图6流动相pH值与容量因子的关系。
【具体实施方式】:
[0038]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
[0039]试验例方法学考察与样品测定
[0040]色谱条件
[0041]色谱柱:AgilentZorbax SB - C18 柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m)；
[0042]流动相:溶剂A(醋酸盐缓冲液，含0.5%(v/v)三乙胺，用冰醋酸调节pH至3.5)-溶剂B (乙腈)，按如下梯度进行梯度洗脱:
[0043]O ?24min，19%B 相—20%B 相；
[0044]24 ?30min，20%B 相—25%B 相；
[0045]30 ?35min，25%B 相—35%B 相；
[0046]35 ?55min，35%B 相—55%B 相。
[0047]检测波长:278nm；
[0048]流速:1.0mT,.mirf1 ；
[0049]柱温:30°C;
[0050]进样量:10μ L。[0051]在上述色谱条件下，分别取对照品、样品及阴性对照溶液进样分析，结果表明，各成分之间分离效果良好，阴性无干扰。
[0052]对照品溶液和供试品溶液的制备
[0053](I)对照品溶液的制备取柚皮苷㈧、黄芩苷(C)、新橙皮苷⑶、盐酸小檗碱⑴、黄芩素(K)、汉黄芩素(L)对照品适量，精密称定，分别制成含柚皮苷2150 μ gmr1，黄芩苷2301 μ g.mL_1,新橙皮苷 2300 μ g 盐酸小檗碱 1385 μ g 黄岑素 842.5 μ g.mL_1,汉黄芩素615.0 μ g.mL-1的对照品储备液I。取橙皮苷(B)、盐酸药跟碱(E)、盐酸黄连碱(F)、汉黄芩苷(G)、盐酸巴马亭(H)、柚皮素(J)、千层纸素A(N)对照品适量，精密称定，分别制成含橙皮苷175.2 μ g.ml/1,盐酸药跟碱66.10 μ g.ml/1,盐酸黄连碱111.5 μ g.ml/1,汉黄岑苷177.2 μ g.mL—1,盐酸巴马亭75.10 μ g.mL—1,柚皮素31.05 μ g.mL—1,千层纸素AeOJOyg.!!^1的对照品储备液II。取白杨素(M)对照品适量，精密称定，制成浓度为16.00 μ g.ml/1的对照品储备液III。[0054]分别精密量取上述对照品储备液1、I1、111适量，置于容量瓶中，甲醇稀释并定容，得到各指标成分对照品溶液浓度范围为:Α43.0I~430.1 μ g.mL—1，Β3.504~35.04 μ g.mL—1，C46.03~460.3 μ g.ml/1, D46.00~460.0 μ g.ml/1, El.322~13.22 μ g.ml/1,F2.230^22.30 μ g.ml/1, G3.544~3 5.44 μ g.ml/1, H1.502^15.02 μ g.ml/1,127.70^277.0 μ g.mL' J0.62 I ~6.2 10 μ g.ml/1, K16.85^168.5 μ g.ml/1,L12.30~123.0 μ g.πι?Λ M0.320~3.200 μ g.πι?Λ N1.204~12.04 μ g.mL'
[0055](2)供试品溶液的制备取糖敏灵丸约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，称重，超声处理(功率250W，频率33kHz) 40min，放冷至室温，甲醇补足减失重量，摇匀，取上清液经0.45 μ m微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试溶液。
[0056](3)阴性对照溶液的制备按糖敏灵丸处方与制备工艺，分别制备不含黄连、黄芩和枳实的阴性对照缺味制剂，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，制备阴性对照溶液。
[0057]系统适用性试验
[0058]取供试溶液10 μ L进样，记录色谱图，Α、色谱峰的保留时间分别为11.2，12.9，
14.2，15.5,21.1,22.1,30.9,33.8,35.0,38.9,41.4,49.1,49.6,50.8min，各峰与相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数按黄芩苷峰计算不低于3000。典型色谱图见图1-图5。
[0059]标准曲线的绘制
[0060]分别精密吸取各混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标(y)，以对照品溶液的浓度(μ g.mL-1)为横坐标(X)，绘制标准工作曲线，回归方程和浓度范围如表1所示，各待测成分在浓度范围内呈良好线性关系。
[0061]表1标准曲线与检测限(n=6).[0062]
【权利要求】
1.一种糖敏灵制剂中化学成分的检测方法，其特征在于，检测样品采用甲醇提取，然后采用高效液相色谱进行检测，色谱条件为采用C18色谱柱，流动相A相为乙酸或磷酸或甲酸或十二烷基磺酸钠水溶液，B相为乙腈或甲醇，检测器为二极管阵列检测器。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测样品采用甲醇超声提取。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A相为pH为3-5的醋酸盐缓冲液，含体积比为0.2%-0.8%的三乙胺，B相为乙腈。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述流动相A相为pH3.5的醋酸盐缓冲液，含体积比为0.5%的三乙胺，B相为乙腈，梯度洗脱方法为: O ?24min, 19%B 相—20%B 相； 24 ?30min, 20%B 相—25%B 相； 30 ?35min, 25%B 相—35%B 相； 35 ?55min, 35%B 相—55%B 相。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱流动相流速为0.8-1.2mL/min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱柱温为25-35°C。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测器波长为220-345nm。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，检测器波长为278nm。
9.如权利要求1至8任意一项所述的方法，其特征在于，检测糖敏灵制剂中的柚皮苷、黄芩苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素、橙皮苷、盐酸药跟碱、盐酸黄连碱、汉黄芩苷、盐酸巴马亭、柚皮素、千层纸素A和白杨素。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，糖敏灵制剂中柚皮苷、黄芩苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素、橙皮苷、盐酸药跟碱、盐酸黄连碱、汉黄芩苷、盐酸巴马亭、柚皮素、千层纸素A和白杨素的含量测定结果分别为12.19-34.59mg.g'.13.34-21.77mg.g \ 13.17-35.42mg.g \ 13.78-18.75mg.g \ 5.175-6.366mg.g \.2.536-3.585mg.g-1、2.714-5.265mg.g_1>0.1786-0.4344mg.g_1> 1.745-2.865mg.g-1、.0.5570-1.374mg.g \0.9185-1.349mg.g \0.1099-0.3353mg.g \0.6955-0.8649mg.g \.5.381 X 10_2-8.551 X 10_2mg.g—1。
【文档编号】G01N30/36GK103575821SQ201210281531
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月8日 优先权日:2012年8月8日
【发明者】佟玲, 朱永宏, 周水平, 马晓慧, 张瀛, 靳元鹏 申请人:天士力制药集团股份有限公司