用于cea定量检测的试剂盒及其制备、使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于CEA定量检测的试剂盒，其包括如下试剂：偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子、酶标记的CEA抗体和化学发光底物，其中偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子由纳米级的磁核与包含各种功能基团的高分子材料复合而成。本发明将纳米磁珠分离技术、化学发光和酶免疫分析技术结合起来，具有灵敏度高、线性范围宽、特异性高、反应迅速等优点。
【专利说明】用于CEA定量检测的试剂盒及其制备、使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体外临床检验和纳米【技术领域】，具体地涉及一种用于定量检测癌胚抗原(CEA)的试剂盒、其制备方法以及使用该试剂盒检测CEA的方法。
【背景技术】
[0002]癌胚抗原(Cacinoembryonic antigen, CEA)是一种高度糖基化的分子量为180-220kDa的细胞表面糖蛋白。CEA是一个广谱性的肿瘤标志物，结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等疾病均可高水平的表达。检测体液(血清、胸腔积液、痰液、唾液、精液、尿液、腹水等)CEA的含量对于肿瘤的诊断、预后、术后疗效观察具有重要的临床意义。正常血清CEA参考值为5ng/mL。
[0003]1969年，放射免疫分析法最早用于CEA的检测。尽管放射免疫分析法是最常用于抗原检测的一种方法，但是用于标记的放射性元素对操作者身体有很大的伤害。因此，酶联免疫分析法(ELISA)、压电免疫分析法、化学发光分析法、比色法、荧光免疫分析法和脂质体免疫分析法等方法被陆续开发出来。然而，这些方法中的大部分步骤繁琐，或者耗时太长，或者需要复杂昂贵的仪器设备，或者需要高度专业的操作人员，等等。
【发明内容】
[0004](一 )要解决的技术问题
[0005]本发明所要解决的技术问题是提出一种新的用于CEA定量检测的试剂盒及其制备、使用方法，以解决现有技术无法简单、快速、灵敏、低成本地对CEA进行检测。
[0006]( 二 )技术方案
[0007]为解决上述技术问题，本发明的用于CEA定量检测的试剂盒包括如下试剂:偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子、酶标记的CEA抗体和化学发光底物。
[0008]根据本发明的一种【具体实施方式】，所述偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子由纳米级的磁核与包含各种功能基团的高分子材料复合而成。
[0009]根据本发明的一种【具体实施方式】，所述高分子材料为聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氯乙烯、二氧化硅、多糖和牛血清白蛋白中的一种或几种。
[0010]根据本发明的一种【具体实施方式】，所述磁核为铁、钴、镍的粉体或氧化物或其合金。
[0011]根据本发明的一种【具体实施方式】，所述化学发光底物包括鲁米诺和过氧化物。
[0012]根据本发明的一种【具体实施方式】，所述酶标记的CEA抗体为CEA的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0013]根据本发明的一种【具体实施方式】,所述酶标记的CEA抗体的浓度为300?2000ng/
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[0014]本发明还提出一种相应的制造用于CEA定量检测的试剂盒的方法，
[0015]该方法包括制造偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子的步骤，[0016]且该步骤包括如下分步骤:第一步、将生物素化的CEA抗体加入磁珠中，
[0017]并摇动反应一段时间，使二者进行偶联形成生物功能化磁纳米复合粒子；第二步、将BSA加入磁珠中再次进行摇动反应以封闭磁珠上未反应的位点；第三步、在磁珠中加入PBS溶液配制成生物功能化磁纳米复合粒子。
[0018]根据本发明的一种【具体实施方式】，在第一步之前，还包括用洗涤液洗涤亲和素修饰的磁珠的步骤。
[0019]本发明还提出一种使用试剂盒检测CEA的方法，该方法利用一校准品进行定标，得到CEA浓度的校准曲线，并根据该校准曲线检测样品的CEA浓度，所述校准步骤和检测步骤均包括如下步骤:第一步、利用生物功能化磁纳米复合粒子对校准品或样品中的CEA进行捕获；第二步、利用酶标记的CEA抗体与所述第一步中的捕获的CEA及生物功能化磁纳米复合粒子形成双抗体夹心结构；第三步、在所述双抗体夹心结构中加入所述化学发光底物，然后放入到化学发光检测仪中，读取光强最大值。。
[0020](三)有益效果
[0021]本发明将纳米磁珠分离技术、化学发光和酶免疫分析技术结合起来，具有灵敏度高、线性范围宽、特异性高、反应迅速等优点。用本发明的方法开发的CEA检测试剂盒能够灵敏、快速、可靠的检测出CEA的含量，从而为临床上肿瘤的诊断、分期、观察术后疗效及预后提供一个准确的参考值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是化学发光强度与时间的关系曲线图(以30ng/mL的CEA为例)；
[0023]图2是由校准溶液测得的校准曲线。
【具体实施方式】
[0024]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0025]本发明包括两个方面，一是生物功能化磁纳米复合粒子及其制备方法，二是利用该生物功能化磁纳米复合粒子对CEA的检测方法。
[0026]根据本发明的第一方面，制备生物功能化的磁性纳米复合粒子的方法包括:将亲和素包被的磁纳米复合粒子与生物素修饰的抗体在37°C的摇床中摇30分钟，并用2% BSA封闭。本发明用生物功能化的磁性纳米复合粒子作为抗体的移动负载取代了传统酶联免疫法(ELISA)的固相负载，
[0027]优点在于加快了免疫反应，缩短了孵育时间。常规ELISA的一次检测周期为3?4小时，而本发明的检测周期为25?30分钟。
[0028]根据本发明的另一方面:利用该生物功能化磁纳米复合粒子对CEA的检测方法包括如下步骤:第一步，向样本中加入生物功能化磁纳米复合粒子来捕获样本中的CEA ;第二步，再加入酶标记的CEA抗体形成双抗体夹心结构；第三步，加入化学发光底物，产生光强并检测，光强的大小代表CEA浓度的高低。
[0029]按照检测方法中所述的步骤进行检测，最后得出光强与时间的关系曲线图如附图1所示。如图1所示，经实验验证光强的最大值与CEA浓度线性相关，所以取光强的最大值作为信号。
[0030]实施例1:试剂盒
[0031]该实施例是一种CEA定量检测试剂盒，该试剂盒基于生物功能化磁纳米复合粒子技术，并具有高灵敏度和快速响应。所谓试剂盒是一种包括多种试剂的套装产品，试剂盒中的各种试剂共同用于完成特定的功能。
[0032]根据本发明，试剂盒至少包括如下试剂:偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子、酶标记的CEA抗体和化学发光底物液。其中偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子用于捕获CEA抗原并且在外部磁场的作用下将CEA与其他介质分离；酶标记的CEA抗体用于与CEA及生物功能化磁纳米复合粒子形成夹心结构并且催化化学发光底物发光，化学发光底物液用于产生光学信号且此信号强度与CEA成比例关系。
[0033]在该实施例中，偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子由纳米级的磁核与包含各种功能基团的高分子材料复合而成，其中高分子材料为聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氯乙烯、二氧化硅、多糖和牛血清白蛋白中的一种或几种。磁核为铁、钴、镍的粉体或氧化物或其合金。生物功能化磁纳米复合粒子是通过亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的抗体偶联或氨基修饰的磁珠与抗体偶联或者羧基修饰的磁珠与抗体偶联制作的。本实施例中磁珠与抗体质量比为250: 1，也可以是150: I?300: I之间的某一个值。
[0034]在该实施例中,所述化学发光底物包括鲁米诺(Iuminol)和过氧化物，
[0035]过氧化物例如为过氧化氢，化学发光底物用于产生化学发光信号。
[0036]在该实施例中，所述酶标记的CEA抗体为CEA的单克隆抗体或多克隆抗体。本实施例中酶标抗体的浓度为2 μ g/mL,也可以是300?2000ng/mL之间的某个值。
[0037]根据本发明，所述试剂盒还可包括浓缩洗涤液和校准品。
[0038]在该实施例中，所述浓缩洗涤液是PBST (磷酸盐缓冲液中加入5 %的Tween-20配制而成，详见实施例2)，但是，其也可以是0.1m0IL-1Tris-HCl缓冲液，或者其他可以用来洗涤磁珠的缓冲液。
[0039]在该实施例中，所述校准品是浓度为0、5、10、20、40、80、200ng/mL的七个点，但是，其也可以是O?200ng/mL范围内具有合理梯度的若干个浓度点的CEA。
[0040]实施例2:试剂盒的制备方法
[0041]试剂盒的制备方法包括制备该试剂盒中每一种试剂的步骤，在本发明中，其主要在于生物功能化磁纳米复合粒子的制备方法，其也是本发明的创新和关键所在。生物功能化磁纳米复合粒子是一种具有超顺磁性的由纳米粒子复合而成的微球，在该微球上偶联生物抗体形成生物功能化磁纳米复合粒子。
[0042]第一步、将生物素化的CEA抗体加入磁珠中，并摇动反应一段时间，
[0043]使二者进行偶联形成生物功能化磁纳米复合粒子；第二步、将BSA(bovine serumalbumin)加入磁珠中再次进行摇动反应以封闭磁珠上未反应的位点；第三步、在磁珠中加A PBS(phosphate buffered saline)溶液配制成生物功能化磁纳米复合粒子。
[0044]在该实施例中，以亲和素修饰的磁珠为例，取100 μ L浓度为10mg/mL的亲和素修饰的磁珠用250 μ L的PBST (浓缩洗涤液按照1: 100稀释得到)洗涤3?5次，加入40 μ L生物素化的CEA抗体，置于120转、37°C的摇床中10?30分钟后取出，用200 μ LPBST洗涤4次。然后加入ImL 2%的BSA进行封闭反应20min，该反应在摇床中进行。然后取出用200 μ LPBST洗涤4次加入500 μ L磷酸盐缓冲液PBS配成lmg/mL的免疫磁珠。置于4°C避
光保存。
[0045]CEA校准品的制备，与一般试剂盒中校准品的制备过程类似。在该实施例中，将100 μ g/mL进口的CEA溶液(Biodesign公司，人源,校准级别)用抗原稀释液(牛血清、防腐剂等)进行梯度稀释，0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、200ng/mL,进行分装即可。
[0046]该实施例的化学发光底物液购自北京科跃中楷生物技术有限公司。
[0047]该实离例的浓缩洗涤液的制备:浓缩洗涤液由在浓度为lmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入5%的Tween-20配制而成。
[0048]在试剂盒的开发过程中，发明人对生物功能化磁纳米复合粒子的偶联效率、生物功能化磁纳米复合粒子的稳定性、反应中孵育时间的优化、干扰性实验、HR标记CEA抗体浓度的优化、发光底物液体积的优化、光强随时间的变化过程等进行了探索和优化。CEA抗体与磁粒子的偶联效率可达75% ;通过对4°C避光保存的同一批次制备的磁珠，每3天对10ng/mL的CEA进行检测，30天内测定10次，相对标准偏差为4.02%，表明该生物功能化磁纳米复合粒子在30天内具有很好的稳定性；反应中水浴的时间优化为10分钟，使得总的检测时间控制在25分钟以内；干扰性实验中向CEA抗原溶液中加入甲胎蛋白AFP和糖蛋白CA125，随着AFP和CA125浓度的增高光强信号并没有明显变化，与纯的CEA溶液相比光强信号值增加2.1%，可以忽略，表明该试剂盒具有很好的抗干扰性。
[0049]实施例3:使用试剂盒检测CEA的方法
[0050]1、对于试剂盒和样本的预处理。
[0051]在该实施例中，将试剂盒置于室温(18-26°C )平衡10-15分钟；取浓缩洗涤液100 μ L用去离子水按照1: 100稀释备用；将待测的样本(血液、胸腔积液、痰液、唾液、精液、尿液、腹水)等进行预处理，取上清液，置于室温平衡10-15分钟。
[0052]2、利用所述试剂盒对样本进行CEA的检测。
[0053]步骤一:该步骤为校准品的检测过程，利用校准品进行定标。该步骤包括以下三个步骤:
[0054]第一步，该步骤利用生物功能化磁纳米复合粒子对溶液中的CEA进行捕获。在该实施例中，将50 μ L生物功能化磁纳米复合粒子与50 μ L校准品进行混合，37°C水浴5分钟后取出，孵育时间还可以为5?15分钟。
[0055]第二步，该步骤利用酶标抗体与上一步中的CEA及生物功能化磁纳米复合粒子形成双抗体夹心结构。在该实施例中，加入50 μ L辣根过氧化物酶标记的CEA抗体，37°C水浴10分钟，根据本发明，辣根过氧化物酶标记抗体体积与生物功能化磁纳米复合粒子体积还可以为20?100 μ L之间的某个体积；孵育时间还可以为5?15分钟。
[0056]该步骤还包括洗涤过程，将样本在磁场中进行洗涤，洗去多余的酶标记抗体。在该实施例中，用200 μ L洗涤液反复清洗5次，洗涤液的体积还可以是200?500 μ L之间的某个值。
[0057]第三步，该步骤为化学发光检测过程。在该实施例中，取化学发光底物液50μ L加到上述步骤形成的双抗体夹心结构中，然后放入到化学发光检测仪中，读取光强最大值。化学发光底物的体积还可以是30?80 μ L之间的某个值。七个校准点依次按照上述操作步骤进行检测，得出各自的光强值。优选的是，每个点平行检测三次，将光强值作为纵轴，CEA浓度作为横轴，作出光强与浓度的校准曲线图并得出校准方程。检测结果可参考附图2。
[0058]步骤二、该步骤为实际样本的检测过程。
[0059]在该实施例中，将50 μ L生物功能化磁纳米复合粒子与50 μ L样本进行混合，同样按照上述所述四个步骤进行操作。根据校准曲线所得的校准方程计算得出样本中CEA的浓度。优选为每个样本测三到五次。
[0060]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂:偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子、酶标记的CEA抗体和化学发光底物。
2.如权利要求1所述的用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，所述偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子由纳米级的磁核与包含各种功能基团的高分子材料复合而成。
3.如权利要求2所述的用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，所述高分子材料为聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氯乙烯、二氧化硅、多糖和牛血清白蛋白中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，所述磁核为铁、钴、镍的粉体或氧化物或其合金。
5.如权利要求1所述的用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括鲁米诺和过氧化物。
6.如权利要求1所述的用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的CEA抗体为CEA的单克隆抗体或多克隆抗体。
7.如权利要求6所述的用于CEA定量检测的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的CEA抗体的浓度为300?2000ng/mL。
8.—种制造用于CEA定量检测的试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括制造偶联有CEA抗体的生物功能化磁纳米复合粒子的步骤，且该步骤包括如下分步骤: 第一步、将生物素化的CEA抗体加入磁珠中，并摇动反应一段时间，使二者进行偶联形成生物功能化磁纳米复合粒子； 第二步、将BSA加入磁珠中再次进行摇动反应以封闭磁珠上未反应的位点； 第三步、在磁珠中加入PBS溶液配制成生物功能化磁纳米复合粒子。
9.如权利要求8所述的制造用于CEA定量检测的试剂盒的方法，其特征在于，在第一步之前，还包括用洗涤液洗涤亲和素修饰的磁珠的步骤。
10.一种使用检测样品中的CEA的浓度的方法，该方法利用一校准品进行定标，得到CEA浓度的校准曲线，并根据该校准曲线检测样品的CEA浓度，其特征在于，所述校准步骤和检测步骤均包括如下步骤: 第一步、利用生物功能化磁纳米复合粒子对校准品或样品中的CEA进行捕获； 第二步、利用酶标记的CEA抗体与所述第一步中的捕获的CEA及生物功能化磁纳米复合粒子形成双抗体夹心结构； 第三步、在所述双抗体夹心结构中加入所述化学发光底物，然后放入到化学发光检测仪中，读取光强最大值。
11.如权利要求10所述的使用检测样品中的CEA的浓度的方法，其特征在于，在所述第二步中还包括洗涤步骤，用于洗去多余的酶标记抗体。
【文档编号】G01N33/577GK103575892SQ201210281112
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月8日 优先权日:2012年8月8日
【发明者】曲书雪, 蔡新霞, 刘军涛, 黄一清, 王彬 申请人:中国科学院电子学研究所