凝集素功能化的纳米金及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种凝集素功能化的纳米金及其制备方法和应用，本发明还提供利用所述凝集素功能化的纳米金检测AFP-L3的方法以及包含所述凝集素功能化的纳米金的试剂盒。本发明的凝集素功能化的纳米金由纳米金以及与所述纳米金共价连接的凝集素构成，其能够方便、直观、高效、灵敏、特异地检测样品中的AFP-L3，而其制备方法简便、成本低廉。
【专利说明】凝集素功能化的纳米金及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及复合材料领域。具体地说，本发明涉及凝集素功能化的纳米金及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]我国是肝癌高发国家，每年约11万患者死于肝癌，相当于整个世界死于肝癌HCC的患者的45%，占我国恶性肿瘤的第二位。临床肝癌发现时多已晚期，治疗难度大，因此，肝癌防治中早期诊断尤为重要。
[0003]甲胎蛋白(AFP)是肝癌标志物，但慢性肝病患者的AFP也会持续升高。研究表明，AFP包括AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3等多种亚型。其中，与肝癌最相关的和最特异的是AFP-L3，而AFP-L1、AFP-L2对肝癌检测有一定的干扰，易导致假阳性。
[0004]2005年FDA批准AFP-L3为原发性肝癌肿瘤标志物(Serum markersofhepatocellular carcinoma AFP—L3 in chronic liver diseases withpersistentElevation of Alpha-fetoprotein)。AFP-L3在肝癌的早期诊断中非常有效，具有相当高的准确率。而肝癌的早期发现可以为患者提供更多的治疗机会，例如外科手术切除或介入治疗等等。因此，AFP-L3可作为肝癌的诊断及疗效随访观察指标。
[0005]纳米金具有独特的光、热、电及化学方面的性能，在催化、光电器件和生物医学等领域的潜在应用引起了众多研究人员的关注。纳米金可以通过弱的相互作用与生物大分子结合，也可以通过化学键与生物大分子偶联，而不改变生物大分子的生物活性，从而能广泛应用于临床诊断及药物检测等各方面。
[0006]目前，已经利用纳米金技术开发了方便、准确、灵敏地检测一些生物样品中的特定分子(如蛋白)的方法和试剂盒。在现有技术中，虽然可通过将纳米金与AFP的抗体偶联形成抗体功能化的纳米金，再用该功能化的纳米金检测AFP，但目前为止，这些抗体功能化的纳米金对AFP-L3不具备特异性(只能不加区分地检测AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3)。此夕卜，由于利用了抗体，该功能化的纳米金的成本很高，制备条件非常苛刻，操作难度更高、导致成本居高不下。更为重要的是，由于缺乏AFP-L3的特异性，无法灵敏准确地用于基于AFP-L3的肝癌的早期诊断。
[0007]因此，本领域急需开发特异性针对AFP-L3、制法简单、成本低、和灵敏度高的纳米金检测试剂和试剂盒。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就是提供一种特异性针对AFP-L3、制法简单、成本低、和灵敏度高的纳米金检测试剂以及包含该试剂的试剂盒。
[0009]在第一方面，本发明提供一种凝集素功能化的纳米金，所述凝集素功能化的纳米金由纳米金以及与所述纳米金共价连接的凝集素构成，并且所述凝集素功能化的纳米金特异性结合AFP-L3，而不结合AFP-Ll和AFP-L2。[0010]在优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金与AFP-Ll或AFP-L2的结合量和与AFP-L3的结合量相比，小于10%，优选小于5%，更优选小于1%。
[0011]在优选的实施方式中，所述的共价连接是通过-CO-NH-键连接。
[0012]在另一优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.01-500):1。
[0013]在更优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.1-200):1。
[0014]在最优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(1-100):1。
[0015]在优选的实施方式中，所述凝集素选自下组中的至少一种:扁豆凝集素、刀豆素A、大豆凝集素、花生凝集素、麦胚素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、蓖麻凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素。
[0016]在第二方面，本发明提供一种制备凝集素功能化的纳米金的方法，所述方法包括以下步骤:
[0017]a)制备纳米金颗粒；和
[0018]b)将凝集素与纳米金颗粒偶联，从而制得凝集素功能化的纳米金。
[0019]在优选的实施方式中，步骤b)包括:
[0020]bl)将a)制得的纳米金颗粒与巯基化合物孵育，从而将纳米金表面置换成巯基化合物；和
[0021]b2)将缩合剂和凝集素与bl)所得纳米金一起孵育，从而制得凝集素功能化的纳米金。
[0022]在进一步优选的实施方式中，所述巯基化合物选自下组中的至少一种:半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙醇、16-烷基硫醇、二巯基丁二酸、巯基乙胺、苯硫酚。
[0023]在优选的实施方式中，所述巯基化合物选自半胱氨酸或巯基丙酸。
[0024]在另一优选的实施方式中，所述缩合剂选自下组中的至少一种:1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、N，N’ -羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺、4-二甲氨基吡啶、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、N-羟基琥珀酰亚胺。
[0025]在进一步优选的实施方式中，所述缩合剂是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳化二亚胺。
[0026]在优选的实施方式中，所述巯基化合物与纳米金的质量比为1: (0.001-20000)。
[0027]在更优选的实施方式中，所述巯基化合物与纳米金的质量比为1: (0.05-10000)。
[0028]在最优选的实施方式中，所述巯基化合物与纳米金的质量比为1: (0.1-5000)。
[0029]在另一优选的实施方式中，所述巯基化合物与缩合剂的摩尔比为1: (0.001-2000)
[0030]在更优选的实施方式中，所述巯基化合物与缩合剂的摩尔比为1: (0.01-1000)。
[0031]在最优选的实施方式中，所述巯基化合物与缩合剂的摩尔比为1: (0.05-200)。
[0032]在另一优选的实施方式中，所述巯基化合物与凝集素的质量比为1:(0.001-1000)。
[0033]在更优选的实施方式中，所述巯基化合物与凝集素的质量比为1: (0.01-500)。[0034]在最优选的实施方式中，所述巯基化合物与凝集素的质量比为1: (0.05-50)。
[0035]在第三方面，本发明提供通过本发明第二方面所述的方法制备的凝集素功能化的纳米金，所述凝集素功能化的纳米金由纳米金以及与所述纳米金共价连接的凝集素构成，并且所述凝集素功能化的纳米金特异性结合于AFP-L3，而不结合于AFP-Ll和AFP-L2。
[0036]在优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.01-500):1。
[0037]在更优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.1-200):1。
[0038]在最优选的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(1-100):1。
[0039]在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒装有:
[0040]a)凝集素功能化的纳米金；
[0041]b)利用a)所述的凝集素功能化的纳米金检测AFP-L3的所需试剂；和
[0042]c)使用所述检测试剂盒的使用说明书。
[0043]在第五方面，本发明提供一种利用本发明第一方面所述的凝集素功能化的纳米金检测AFP-L3的方法，所述方法包括以下步骤:
[0044]a)将本发明第一方面所述的凝集素功能化的纳米金与待测样品混合孵育；和
[0045]b)通过观察混合液颜色变化来判断或者通过紫外/可见光分光光度计来测试所述待测样品中是否含有AFP-L3。
[0046]在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的凝集素功能化的纳米金在制备检测AFP-L3的试剂中的应用。
[0047]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1为实施例1制备的凝集素功能化纳米金与AFP-L3结合前后投射电镜照片。其中A为胶体金-凝集素，B为AFP-L3/凝集素-胶体金(AFP-L3 IOOng)。
[0049]图2为实施例1制备的凝集素修饰纳米金与AFP-L3结合凝集素修饰纳米金与AFP-L3结合后肉眼可观察到的颜色变化。其中A为胶体金，B为胶体金-凝集素，C为AFP-L3/ 凝集素-胶体金(AFP-L3 IOOng)，D 为 AFP-L3/ 凝集素-胶体金(AFP-L3 200ng)。
[0050]图3为实施例2中不同反应步骤及AFP-L3检测后纳米金溶液紫外可见光图谱。
[0051]图4为对比例2制备的凝集素修饰纳米金与AFP-L3结合凝集素修饰纳米金与AFP-L3结合后肉眼基本观察不到颜色变化。A为胶体金-凝集素，B为AFP-L3/凝集素-胶体金(AFP-L3 IOOng)，C 为 AFP-L3/ 凝集素-胶体金(AFP-L3 200ng)。
[0052]图5为对比例3中凝集素修饰纳米金及AFP-L3检测后纳米金溶液紫外可见光图谱。图中看不到SPR峰的明显位移。
【具体实施方式】[0053]发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用缩合剂可以方便地将纳米金与凝集素制成复合物，从而能高效地检测待测样品中AFP-L3是否存在。在此基础上完成了本发明。
[0054]凝集素
[0055]凝集素(Lectin)是从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球，故称为凝集素。其中常见的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA),通常以其被提取的植物命名。例如，刀豆素A(Conconvalina, ConA)、麦胚素(Wheatgerm agglutinin, WGA)、花生凝集素(Peanut agglutinin, PNA)和大豆凝集素(Soybeanagglutinin, SBA)等，凝集素是它们的总称。凝集素因具有某些“亲合”特性，而能应用于免疫检测。
[0056]本发明可利用各种凝集素，包括但不限于下组中的至少一种:扁豆凝集素、刀豆素A、大豆凝集素、花生凝集素、麦胚素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、蓖麻凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素。在优选的实施方式中，本发明利用扁豆凝集素或刀豆凝集素。
[0057]纳米金
[0058]本文所用的术语“纳米金”具有本领域普通技术人员熟知的含义，S卩，金的微小颗粒，其直径在I?lOOnm。纳米金具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。纳米金具有的特性还有:颜色稳定、不褪色、不变色；单体粒子的表面稳定性；杀菌、抗菌性；亲水性、渗透性；很好的分散性、均匀且稳定；安全性好无毒副作用；纳米金单体粒子具有强磁性。
[0059]目前，通常利用氯金酸，在还原剂作用下聚合成一定大小的金纳米颗粒。
[0060]众所周知，纳米金在特定波长显示表面等离子体激元共振(SPR)吸收带。SPR的吸收频率和宽度依赖于金属纳米粒子的粒径和形状，以及在电介质金属本身和它周围的介电常数。诱导偶极相互作用依赖于粒子间距和团聚粒子大小，所以当纳米金粒子聚集时，最大吸收峰转移到更长的波长导致颜色由红色变为蓝色。此特性可用于直观快速检测蛋白含量。
[0061]纳米金的应用
[0062]纳米金可应用于各种领域:做食品、玻璃以及生物体的着色剂；制作液体及固体的不变色的着色材料；利用纳米金粒子解析DNA ;用于遗传基因的测定；添加到化妆品中可起到美白、抗衰老、润肤、抗菌作用；与氧化钛等混合使用可制作环境净化产品，特别是清除CO等有害物质效果极佳。
[0063]纳米金可作为免疫标记物应用于检测技术，例如，作为显微镜示踪物，应用于均相溶胶颗粒免疫测定技术，应用于流式细胞仪，应用于斑点免疫金银染色技术，应用于免疫印迹技术，应用于斑点金免疫渗滤测定技术，应用于免疫层析技术，应用于生物传感器，应用于生物芯片；
[0064]纳米金还可应用于食品安全快速检测，例如检测兽药残留、动物传染病、农药残留、以及检测致病微生物或真菌毒素。
[0065]凝集素功能化的纳米金
[0066]本发明的“凝集素功能化的纳米金”是将凝集素与纳米金偶联后得到的纳米金颗粒。本领域技术人员明白，凝集素与纳米金偶联后得到的功能化纳米金既具备纳米金的检测便利性，又具备凝集素结合AFP-L3的特异性。
[0067]本发明的凝集素功能化的纳米金由纳米金以及与所述纳米金共价连接的凝集素构成。
[0068]在具体的实施方式中，所述的共价连接是通过-CO-NH-键连接。
[0069]在具体的实施方式中，本发明的凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.01-500):1。
[0070]在优选的实施方式中，本发明的凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.1-200):1。
[0071]在更优选的实施方式中，本发明的凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(1-100):1。
[0072]本发明的凝集素功能化的纳米金能特异性地结合AFP-L3，而不结合AFP-Ll和AFP-L2。换言之，本发明的凝集素功能化的纳米金能在AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3之间作出辨别，与AFP-L3之间有必然的对应选择关系。
[0073]在具体的实施方式中，所述凝集素功能化的纳米金与AFP-Ll或AFP-L2的结合量和与AFP-L3的结合量相比，小于10%，优选小于5%，更优选小于1%。
[0074]巯基化合物
[0075]本文所用的术语“巯基化合物”表示具有巯基的化合物。在具体的实施方式中，本发明所用的巯基化合物包括但不限于以下的一种或多种:半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙醇、16-烷基硫醇、二巯基丁二酸、巯基乙胺、苯硫酚。在优选的实施方式中，本发明所用的巯基化合物包括巯基丙酸和/或半胱氨酸。
[0076]本发明方法
[0077]本发明提供一种制备凝集素功能化的纳米金的方法，所述方法包括以下步骤:
[0078]a)制备纳米金颗粒；和
[0079]b)将凝集素与纳米金颗粒偶联，从而制得凝集素功能化的纳米金。
[0080]在具体的实施方式中，本发明方法的步骤b)包括:
[0081]bl)将a)制得的纳米金颗粒与巯基化合物孵育，从而将纳米金表面置换成巯基化合物；和
[0082]b2)将缩合剂和凝集素与bl)所得纳米金一起孵育，从而制得凝集素功能化的纳米金。
[0083]在具体的实施方式中，本发明方法中使用的所述巯基化合物选自下组中的至少一种:半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙醇、16-烷基硫醇、二巯基丁二酸、巯基乙胺、苯硫酚。
[0084]在优选的实施方式中，所述巯基化合物选自半胱氨酸或巯基丙酸。
[0085]在具体的实施方式中，本发明方法中使用的缩合剂选自下组中的至少一种:1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-轻基苯并二唑、2- (7-偶氮苯并二氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、N，N’ -羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺、4-二甲氨基吡啶、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、N-羟基琥珀酰亚胺。
[0086]在优选的实施方式中，所述缩合剂是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳化二亚胺。[0087]在具体的实施方式中，本发明方法中所述巯基化合物与纳米金的质量比为1: (0.001-20000);优选 1: (0.05-10000);更优选 1: (0.1-5000)。
[0088]在具体的实施方式中，本发明方法中所述巯基化合物与缩合剂的摩尔比为1: (0.001-2000);优选 1: (0.01-1000);更优选 1: (0.05-200)。
[0089]在具体的实施方式中，所述巯基化合物与凝集素的质量比为1: (0.001-1000);优选 1: (0.01-500);更优选 1: (0.05-50)。
[0090]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0091]材料
[0092]实施例中所用的试剂均购自百灵威试剂公司
[0093]实施例中所用的待测样品获自Sino Biological有限公司
[0094]实施例
[0095]实施例1
[0096](I)纳米金溶液的制备
[0097]将IOOmL HAuCl4在剧烈搅拌下加热到沸腾，快速倒入5mL柠檬酸三钠。5分钟后颜色变红，继续沸腾5分钟后冷却20分钟。最终产物过醋酸纤维素滤膜，4°C冰箱避光保存。
[0098](2)凝集素功能化的纳米金的制备
[0099]将ImL柠檬酸钠稳定的金纳米粒在HOOOrpm离心10分钟，重新分布于磷酸钠缓冲液。加入12 μ L 25 μ M巯基丙酸孵育I小时，将金表面的柠檬酸钠置换成巯基丙酸。离心除去多余的巯基丙酸后重新分散于磷酸钠缓冲液中，加入30 μ L 40 μ M的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和5yg扁豆凝集素，孵育半个小时。获得的凝集素-纳米金中凝集素与纳米金的质量比为1:40。
[0100](3)利用凝集素功能化的纳米金检测待测样品中的AFP-L3
[0101]将凝集素功能化的纳米金与待测样品混合孵育，观察颜色变化。如图1所示，凝集素功能化的纳米金与待测样品中AFP-L3结合后呈聚集态分布。如图2所示，可目测观察凝集素功能化的纳米金与待测样品中AFP-L3结合后溶液的颜色变化。
[0102]实施例2
[0103](I)纳米金溶液的制备
[0104]将IOOmL HAuCl4在剧烈搅拌下加热到沸腾，快速倒入7mL柠檬酸三钠。5分钟后颜色变红，继续沸腾5分钟后冷却20分钟。最终产物过醋酸纤维素滤膜，4°C冰箱避光保存。
[0105](2)凝集素功能化的纳米金的制备
[0106]将ImL柠檬酸钠稳定的金纳米粒在HOOOrpm离心10分钟，重新分布于磷酸钠缓冲液。加入IOyL 30 μ M半胱氨酸孵育半小时，将金表面的柠檬酸钠置换成半胱氨酸。离心除去多余的半胱氨酸之后重新分散于磷酸钠缓冲液，加入20 μ L 5mM的二环己基碳化二亚胺和3 μ g刀豆凝集素，孵育I个小时。获得的凝集素-纳米金中凝集素与纳米金的质量比为1:66。
[0107](3)利用凝集素功能化的纳米金检测待测样品中的AFP-L3[0108]将凝集素功能化的纳米金与待测样品混合孵育，紫外可见光光谱检测SPR峰值位移，判断样品中是否含有AFP-L3。如图3所示。
[0109]实施例3-6
[0110]发明人还利用表1所示参数重复实施例1或2，得到的结果与实施例1或2相似。
[0111]表1
实施例凝集素与纳米巯基化合物与纳巯基化合物与缩巯基化合物与凝
【权利要求】
1.一种凝集素功能化的纳米金,其特征在于,所述凝集素功能化的纳米金由纳米金以及与所述纳米金共价连接的凝集素构成，并且所述凝集素功能化的纳米金特异性结合AFP-L3,而不结合 AFP-Ll 和 AFP-L2。
2.如权利要求1所述的凝集素功能化的纳米金，其特征在于，所述凝集素功能化的纳米金中纳米金与凝集素的质量比为(0.01-500):1。
3.一种制备凝集素功能化的纳米金的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a)制备纳米金颗粒；和 b)将凝集素与纳米金颗粒偶联，从而制得凝集素功能化的纳米金。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b)包括: bl)将a)制得的纳米金颗粒与巯基化合物孵育，从而将纳米金表面置换成巯基化合物；和 b2)将缩合剂和凝集素与bl)所得纳米金一起孵育，从而制得凝集素功能化的纳米金。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述巯基化合物选自下组中的至少一种:半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸、巯基乙醇、16-烷基硫醇、二巯基丁二酸、巯基乙胺、苯硫酚。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缩合剂选自下组中的至少一种:1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-轻基苯并二唑、2- (7-偶氮苯并二氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、N，N’ -羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺、4- 二甲氨基吡啶、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、N-羟基琥珀酰亚胺。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述巯基化合物与纳米金的质量比为1:(0.001-20000)。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述巯基化合物与缩合剂的摩尔比为1:(0.001-2000)。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述巯基化合物与凝集素的质量比为1: (0.001-1000)。
10.通过权利要求3-9中任一项所述的方法制备的凝集素功能化的纳米金，其特征在于，所述凝集素功能化的纳米金由纳米金以及与所述纳米金共价连接的凝集素构成，并且所述凝集素功能化的纳米金特异性结合于AFP-L3，而不结合于AFP-Ll和AFP-L2。
11.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒装有: a)凝集素功能化的纳米金； b)利用a)所述的凝集素功能化的纳米金检测AFP-L3的所需试剂；和 c)使用所述检测试剂盒的使用说明书。
12.一种利用权利要求1或2所述的凝集素功能化的纳米金检测AFP-L3的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a)将权利要求1或2所述的凝集素功能化的纳米金与待测样品混合孵育；和 b)通过观察混合液颜色变化来判断或者通过紫外/可见光分光光度计来测试所述待测样品中是否含有AFP-L3。
13.权利要求1或2所述凝集素功能化的纳米金在制备检测AFP-L3的试剂中的应用。
【文档编号】G01N21/25GK103822878SQ201210466746
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2012年11月16日
【发明者】段友容, 孙颖, 覃刘彬 申请人:上海市肿瘤研究所