专利名称：一种检测细胞通道电流的装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及电生理学和细胞生物学技术领域，具体地说，本实用新型涉及一种检测细胞通道电流的装置。
背景技术：
1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术(patchclamp recording technique)。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。膜片钳技术的基本原理是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电 流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。膜片钳系统是测量单个细胞离子通道最直接、最灵敏的电生理仪器，广泛应用于生理学、病理学、药理学以及神经科学等领域。它可以记录低至PA级的单通道电流，记录到的离子通道的动力学响应可达10μ S的时间分辨率，还可以测量离子通道的开放、关闭、失活时间常数等基本属性。然而现有的膜片钳系统中，细胞是在玻璃微电极外部与之顶端边缘形成千兆欧姆的封接，它存在以下不足首先，该膜片钳系统的应用范围较窄，仅能用于贴壁细胞(包括原代培养的神经元、肌肉细胞等)和脑片离子通道的检测，难以在分散悬浮细胞上应用；其次，现有的膜片钳系统的实验操作复杂，需要在显微镜下利用显微操纵器接近单细胞施加负压以便实现高阻抗封接，因此需要高度专业化的人员进行操作；再者，现有的膜片钳系统的数据产出较低，满足不了一些需要观察大量细胞的实验的要求，更无法进行高通量筛选等实验。针对传统膜片钳技术的不足，出现了一种玻璃微管内封接的膜片钳技术，它是将细胞灌注入玻璃微管内，通过抽吸使细胞与电极顶端内部形成千兆欧姆的封接。理论上,这种技术不会使细胞贴壁，因此能够测量分散悬浮细胞。然而，目前尚没有适合于上述玻璃微管内封接的专用测量装置。而传统的膜片钳系统显然不适合玻璃微管内封接技术。因此，当且迫切需要一种适合于玻璃微管内封接技术的检测细胞通道电流的装置。
实用新型内容本实用新型的任务是提供一种基于玻璃微管内封接的膜片钳技术的检测细胞通道电流的装置。为实现上述实用新型目的，本实用新型提供了一种检测细胞通道电流的装置，包括用于盛放电极内液的浴槽杯；所述浴槽杯包括浴槽杯体和浴槽杯盖，浴槽杯盖和浴槽杯体密封安装；所述浴槽杯盖上设有玻璃电极接口、放大器探头接口和负压接口。[0009]其中，所述玻璃电极接口包括电极嘴、垫圈和电极帽；电极嘴和电极帽相互配合并通过垫圈密封，电极嘴中空，垫圈具有容纳玻璃电极的中空通道。其中，所述放大器探头接口包括插针嘴、插针帽、插针、插针密封管和Ag/AgCl电极；插针嘴中空，插针帽和插针嘴相互配合，插针密封管位于插针嘴中，Ag/AgCl电极一端进入浴槽杯中与电极内液接触，另一端在所述插针密封管中与所述插针的一端密封连接，插针的另一端从插针帽中穿过并插入放大器探头输入端。其中，所述检测细胞通道电流的装置还包括放大器探头支架。其中，所述放大器探头支架包括立柱、横杆、燕尾卡和支架卡，立柱通过法兰座安装在底板上，横杆通过支架卡安装在立柱上，横杆靠近浴槽杯的一端安装有燕尾卡。其中，所述浴槽杯和放大器探头支架均固定在金属底板上。 其中，所述浴槽杯的内部空间为漏斗形。与现有技术相比，本实用新型具有下列技术效果I、本实用新型能够基于玻璃微管内封接的膜片钳技术实现细胞通道电流的检测。2、本实用新型能够高质量地记录细胞通道的电流信号。3、本实用新型的检测细胞通道电流的装置便于操作。4、本实用新型的检测细胞通道电流的装置成本低。
图I示出了本实用新型一个实施例中的检测细胞通道电流的装置的结构示意图；图2示出了本实用新型一个实施例中的浴槽杯的结构示意图；图3示出了一个定位于玻璃电极顶端的细胞的显微照片；图4示出了本实用新型一个实施例中的实测得到的玻璃电极入水时的电流随时间变化的曲线；图5示出了本实用新型一个实施例中的实测得到的在完成玻璃电极的内封接后的电流随时间变化的曲线；图6示出了本实用新型一个实例中对果蝇S2细胞氯通道电流的记录结果。
具体实施方式
根据本实用新型的一个实施例，图I示出了一种检测细胞通道电流的装置的结构示意图，包括底板7、分别安装在底板7上的浴槽杯I和放大器探头支架8。浴槽杯I用于盛放电极内液，并提供玻璃电极接口、放大器探头接口和负压接口。放大器探头支架8用于固定放大器探头。本实用新型中的放大器均是指膜片钳放大器，膜片钳放大器是本领域的公知概念，不再赘述。一个实施例中，所述放大器探头支架8包括立柱5、横杆4、燕尾卡2和支架卡3，立柱5通过法兰座6安装在所述底板7上。横杆4通过支架卡3安装在立柱5上,横杆4靠近浴槽杯I的一端安装有燕尾卡2，用于固定放大器探头。需要说明的是，放大器探头支架8也可以采用其它结构，以适应不同型号的放大器探头，这是本领域普通技术人员易于理解的。图2示出了本实用新型一个实施例中的浴槽杯的结构示意图。参考图2，在一个实施例中，所述浴槽杯I包括浴槽杯体101和浴槽杯盖104，浴槽杯盖104和浴槽杯体101之间通过锁紧扣102密封。浴槽杯盖104上具有玻璃电极接口 113、放大器探头接口 114和负压接口 107。玻璃电极接口 113用于玻璃电极的固定，它包括电极嘴105、垫圈112和电极帽106。电极嘴105中空，电极嘴105和电极帽106通过垫圈112密封，垫圈112具有中空通道，玻璃电极可穿过垫圈112，从电极嘴105插入浴槽杯I中与电池内液接触。垫圈112有不同尺寸，以适用于不同外径(包括但不限于I. lmm、l. 3mm、l. 5mm和I. 7mm)的玻璃电极。放大器探头接口 114包括插针嘴108、插针帽109、插针110、插针密封管111，螺纹颈圈(图中未示出，该部件是放大器探头的一个配件)和Ag/AgCl电极115，其中插针110用于连接放大器探头和浴槽杯盖，螺纹颈圈用于固定放大器探头。具体地，Ag/AgCl电极115 —端进入浴槽杯中与电极内液接触，另一端在所述插针密封管111中与所述插针110密封连接。具体地，所述Ag/AgCl电极115—端穿过插针密封管111进入浴槽杯,另一端90°弯曲与插针110的底面充分接触。插针110的另一端(顶面)从插针帽109中穿过，插入放大器探头输入端，螺纹颈圈卡在插针帽109外圈，将插针帽109拧紧在插针嘴108上，可以挤压所述插针密封管111使放大器探头接口密封，通过将螺纹颈圈拧紧而使该部分与放大器探头连 接。负压接口 107用于连接给负压装置。给负压装置可以是注射器。另外，在一个实施例中，底板7采用金属底板，这样，浴槽杯I直接固定在金属底板上，而放大器探头通过支架也连接到金属底板上，使得浴槽杯I和放大器探头可以作为一个整体接地，有利于排除干扰，提高信号分辨率。工作状态下，充满悬浮细胞的玻璃电极和放大器探头接口 114处的Ag/AgCl电极均置于浴槽杯I的电极内液中；放大器探头通过燕尾卡2固定在放大器探头支架8上，并且可以360度调节探头方向，这样可以方便灵活的将放大器探头与浴槽杯I连接。玻璃电极内具有参比Ag/AgCl电极,该参比Ag/AgCl电极和放大器探头接口 114的Ag/AgCl电极分别与膜片钳放大器连接，膜片钳放大器与膜片钳数模/模数转换器连接。浴槽杯体101和浴槽杯盖104之间通过金属密封扣(锁紧扣102)密封，玻璃电极接口 113通过电极帽106拧紧，挤压中间插有玻璃电极的密封垫圈112从而实现密封；通过拧紧螺纹颈圈挤压包裹Ag/AgCl电极的插针密封管111从而实现放大器探头端的密封。这样，整个检测细胞通道电流的装置的处于密闭状态。在密闭状态下，通过负压接口 107的负压吸引(例如，可以用软管连接注射器与浴槽杯盖上的负压接口，通过注射器提供负压)可以将细胞定位在玻璃电极的尖端，从而实现细胞的玻璃微管内封接，图3就示出了一个定位于玻璃电极顶端的细胞的显微照片。另外，上述玻璃电极接口的设计在实现有效密封的同时，还可以通过拧下电极帽来方便快速地更换玻璃电极。上述实施例中的这种基于浴槽杯的设计方案与传统的膜片钳系统有很大区别。传统的膜片钳系统中，电池内液需要置于玻璃电极内，而细胞位于玻璃电极之外。而在本实用新型的上述实施例中，可以将悬浮的细胞置于玻璃电极内，电极内液置于浴槽杯(即内液池)中，内置参比Ag/AgCl电极的玻璃电极和连接放大器探头的Ag/AgCl电极均置于浴槽杯的电极内液中，使得电路连通。这种结构不仅能实现悬浮细胞的内封接，还使得玻璃电极和放大器探头Ag/AgCl电极之间能够保持足够距离，从而避免二者互相干扰。另外，在一个实施例中，浴槽杯的内部空间可设计成漏斗形，其中下方的柱状体用于盛放电极内液，这样有利于节省内液的使用量；而上方的类似于倒锥形的空间则可以给玻璃电极和放大器探头的Ag/AgCl电极插入提供更大的空间，避免二者相互触碰。玻璃电极可以通过电极拉制仪拉制玻璃毛坯管获得，材料简单易得，价格便宜。根据本实用新型的一个实施例，上述检测细胞通道电流的装置与膜片钳放大器以及膜片钳数模/模数转换器一起构成检测细胞通道电流的系统。其中采用美国MolecularDevice公司的Multichlamp 700A放大器作为膜片钳放大器,采用Molecular Device公司的Dididata 1322A数模/模数转换器作为膜片钳数模/模数转换器，采用MolecularDevice公司的pClamp 9. O软件(包括Clampex 9. O和Clamfit 9. O软件)用于数据记录和分析。玻璃电极使用美国Sutter公司的Sutter P97电极拉制仪制作。基于上述检测细胞通道电流的系统进行基于玻璃微管内封接的膜片钳实验的工作流程如下(I)制备适合于进行内封接膜片钳实验的玻璃电极将玻璃毛坯管拉制成顶端为锥形的玻璃电极，在玻璃电极内冲灌用无血清培养基悬浮的细胞，然后将该玻璃电极装置于浴槽杯盖玻璃电极接口内，同时玻璃电极内置参比Ag/AgCl电极,将玻璃电极插入玻璃 电极接口，电极尖端和电极内液接触，拧紧电极帽，实现密封和电极固定。当放大器探头连接好后，可以测量出玻璃电极的入水电阻，选用阻值5ΜΩ左右的玻璃电极用于后续离子通道电流的记录；图4示出了一个实测得到的玻璃电极入水时的电流曲线，可以看出该玻璃电极的入水电阻为4. 6ΜΩ。(2)在浴槽杯中注入电极内液。(3)固定放大器探头放大器探头固定到探头支架上，将探头角度和与浴槽杯的距离调节至适合于与浴槽杯盖上放大器探头接口连接的位置处。(4)连接放大器探头将浴槽杯盖上放大器探头接口上的插针插入探头输入端中，用螺纹颈圈固定探头。(5)连接抽负压装置负压口与抽负压装置连接。(6)扣紧密封口以保证浴槽的密封性。(7)利用内封接技术记录在悬浮条件下的果蝇S2细胞氯通道电流通过施加负压，使玻璃电极内的一个细胞与电极尖端内部形成千兆欧姆的封接，此时可通过测量封接电阻的变化来判断是否已完成细胞与电极尖端的内封接，图5示出了实测得到的在完成玻璃电极的内封接后的电流曲线，可以看出其中电阻已达到I. 256Ω，证明封接已完成。(8)封接完成后，再通过施加脉冲负压将细胞膜打破，形成全细胞记录模式,最后得到S2细胞的氯通道电流。上述所说的步骤(1、7、8)中的电阻检测、电流检测采用Clampex 9. O软件完成。可以看出，基于上述实施例，可以方便地将各类细胞悬浮后通过电极加液器加入玻璃电极内，并完成在玻璃电极内的内封接操作，因此本实用新型的适用范围不局限于贴壁细胞，只要能够分散悬浮的细胞均可适用于本实用新型的检测细胞通道电流的装置。图6示出了一个实际测试中对果蝇S2细胞氯通道电流的记录结果。容易看出，所记录的电流平稳噪声少，显示出装置对电流信号的高质量记录效果。最后，上述的实施例仅用来说明本实用新型，它不应该理解为是对本实用新型的保护范围进行任何限制。而且，本领域的技术人员可以明白，在不脱离上述实施例精神和原理下，对上述实施例所进行的各种等效变化、变型以及在文中没有描述的各种改进均在本专利的保护范围之内。
权利要求1.一种检测细胞通道电流的装置，其特征在于，包括用于盛放电极内液的浴槽杯；所述浴槽杯包括浴槽杯体(101)和浴槽杯盖(104)，浴槽杯盖(104)和浴槽杯体(101)密封安装；所述浴槽杯盖(104)上设有玻璃电极接口( 113)、放大器探头接口( 114)和负压接口(107)。
2.按权利要求I所述的检测细胞通道电流的装置，其特征在于，所述玻璃电极接口(113)包括电极嘴(105)、垫圈(112)和电极帽(106);电极嘴(105)和电极帽(106)相互配合并通过垫圈(112)密封，电极嘴(105)中空，垫圈(112)具有容纳玻璃电极的中空通道。
3.按权利要求I所述的检测细胞通道电流的装置，其特征在于，所述放大器探头接口(114)包括插针嘴(108)、插针帽(109)、插针(110)、插针密封管(111)和Ag/AgCl电极(115);插针嘴(108)中空，插针帽(109)和插针嘴(108)相互配合，插针密封管(111)位于插针嘴(108)中，Ag/AgCl电极(115)—端进入浴槽杯中与电极内液接触，另一端在所述插针密封管(111)中与所述插针(110)的一端密封连接，插针(110)的另一端从插针帽(109)中穿过并插入放大器探头输入端。
4.按权利要求I所述的检测细胞通道电流的装置，其特征在于，所述检测细胞通道电流的装置还包括放大器探头支架(8 )。
5.按权利要求4所述的检测细胞通道电流的装置，其特征在于，所述放大器探头支架(8 )包括立柱(5 )、横杆(4 )、燕尾卡(2 )和支架卡(3 )，立柱(5 )通过法兰座(6 )安装在底板(7)上,横杆(4)通过支架卡(3)安装在立柱(5)上,横杆(4)靠近浴槽杯(I)的一端安装有燕尾卡(2)。
6.按权利要求4所述的检测细胞通道电流的装置，其特征在于，所述浴槽杯(I)和放大器探头支架(8)均固定在金属底板上。
7.按权利要求5所述的检测细胞通道电流的装置，其特征在于，所述浴槽杯的内部空间为漏斗形。
专利摘要本实用新型提供一种检测细胞通道电流的装置，包括用于盛放电极内液的浴槽杯；所述浴槽杯包括浴槽杯体(101)和浴槽杯盖(104)，浴槽杯盖(104)和浴槽杯体(101)密封安装；所述浴槽杯盖(104)上设有玻璃电极接口(113)、放大器探头接口(114)和负压接口(107)。本实用新型能够基于玻璃微管内封接的膜片钳技术实现细胞通道电流的检测；能够高质量地记录细胞通道的电流信号；便于操作且成本低。
文档编号G01N27/26GK202693661SQ20122030654
公开日2013年1月23日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者杨琳, 伍一军 申请人:中国科学院动物研究所