专利名称：一种高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法与装置的制作方法
技术领域：
本发明属于光学显微成像及光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法与装置，可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱探测。
背景技术：
激光共焦拉曼光谱测试技术是将显微分析技术与拉曼光谱分析技术结合起来的新技术，它将入射激光通过显微镜聚焦到样品上，从而可以在不受周围物质干扰的情况下，获得所照样品微区的分子结构等，被称为分子探针。它不仅可以观测样品同一层面内不同微区的拉曼光谱信号，还能分别观测样品内深度不同的各个层面的拉曼信号，对被测样品进行断层扫描，从而在不损伤样品的情况下达到进行“光学切片”的效果。激光共焦拉曼光谱测试技术由于其无损光谱层析成像能力及高分辨率，已广泛应用于物理、化学、生物医学、石油化工、环境科学、材料科学、地质、刑侦和珠宝等领域。目前，典型的激光共焦拉曼光谱探测仪的原理如
图1所示，激光器发出光束后，经过第一聚光镜、第一针孔后、第二聚光镜后扩束成为平行光，透过第一分光系统、四分之一波片、物镜后，聚焦在被测样品上，激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；移动被测样品，使对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片并被第一分光系统反射，经第四聚光镜聚焦到第三针孔后，由第五聚光镜汇聚到第一光谱仪，从而，测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光。现有激光共焦拉曼光谱探测仪存在以下问题:1、为了减小拉曼散射光的能量损失，系统中选取的针孔通常在150 μ m 200 μ m之间，系统利用共焦方式进行焦点定位，针孔尺寸直接影响共焦轴向定位曲线的半高宽，针孔尺寸较大导致系统定焦精度降低，即降低空间分辨力；2、利用微弱的拉曼散射光进行定位，降低了系统的灵敏度；3、在长时间光谱探测过程中，系统容易受环境等因素影响发生漂移，产生离焦，降低系统空间分辨力；4、系统只可进行光谱探测，模式单一。上述原因限制了共焦拉曼光谱显微系统探测微区光谱的能力，制约了共焦拉曼光谱技术的进一步发展。基于上述情况，本发明提出共焦探测系统利用现有共焦拉曼光谱探测系统收集到的样品散射光中遗弃的强于样品拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束进行高精度探测，使其与拉曼光谱探测系统有机融合，以期实现高空间分辨共焦拉曼光谱成像与探测，而实现高空间分辨力的光谱探测是目前光谱显微测试领域亟待解决的问题，具有极其重要的理论和学术价值。本发明专利的具体思路是:将激光共焦技术与拉曼光谱探测技术有机结合，共焦系统利用系统收集到的样品散射光中的瑞利光束对聚焦光斑的焦点进行实时跟踪与空间位置探测，拉曼光谱探测系统利用系统收集到的样品的散射光中的拉曼散射光进行光谱探测，然后再将共焦探测系统信号与拉曼光谱探测系统信号有机融合，从而实现激光共焦拉曼光谱系统高空间分辨探测。
发明内容
本发明的目的是:为了克服现有共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力难以提高的不足，提出一种具有高空间分辨力的共焦拉曼光谱探测方法和装置。本发明的目的是通过下述技术方案实现的。本发明提供了一种高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法，利用二向色分光系统将系统收集到的散射光分离为瑞利光和拉曼散射光，瑞利光进入共焦探测系统进行焦点定位，拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统进行光谱探测，利用共焦曲线最大值M与焦点O位置精确对应这一特性，通过寻找最大值来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测，该方法的具体实现步骤如下:I)通过激发光束产生系统产生激发光，经过第一分光系统、物镜后，聚焦在被测样品上，并激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光；2)移动被测样品，使瑞利光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次经过物镜，并被第一分光系统反射至二向色分光系统，经二向色分光系统分光对拉曼散射光和瑞利光进行分离；3)瑞利光被二向色分光系统反射进入共焦探测系统，利用共焦探测系统中的第一探测器，测得反映样品凹凸变化的强度响度相应I ( v，u)，即可进行三维尺度层析成像测试，其中，V为横向归一化光学坐标，U为轴向归一化光学坐标；4)拉曼散射光经二向色分光系统透射进入拉曼光谱探测系统，利用拉曼光谱探测系统测得载有被测样品光谱特性的拉曼散射信号I ( λ )，即可进行光谱测试，其中λ为波长;5)将I (λ )、I ( v，u)传送到数据处理模块进行数据处理，从而获得包含被测样品位置信息I ( V，u)和光谱信息I ( λ )的三维测量信息I ( V，U，λ );6)使被测样品沿X、y方向扫描，物镜沿ζ方向扫描，重复上述步骤测得对应物镜焦点位置附近的一组i个包含位置信息I ( V，u)和光谱信息I ( λ )的序列测量信息Ui(λ ), Ii ( V，U) }；7)利用可分辨区域δ i对应的位置信息Ii ( V，u)，找出对应δ i区域的光谱信息Ii (λ)值，再依据V与横向位置坐标(X，y)的关系以及u与轴向位置坐标ζ的关系，重构反映被测物微区\三维尺度和光谱特性的信息Ii CxilYilZi, Ai),即实现了微区Smin的光谱探测和三维几何位置探测；8)对应最小可分辨区域δ min的三维尺度和光谱特性由下式确定:
权利要求
1.一种高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法，其特征在于:利用二向色分光系统(13)将系统收集到的散射光分离为瑞利光和拉曼散射光，瑞利光进入共焦探测系统(14)进行焦点定位，拉曼散射光进入拉曼光谱探测系统(18)进行光谱探测，利用共焦曲线(34)最大值M与焦点O位置精确对应这一特性，通过寻找最大值来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测，该方法的具体实现步骤如下: 1)通过激发光束产生系统(I)产生激发光，经过第一分光系统(8)、物镜(10)后，聚焦在被测样品(11)上，并激发出瑞利光和载有被测样品(11)光谱特性的拉曼散射光； 2)移动被测样品(11)，使瑞利光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次经过物镜(10)，并被第一分光系统(8)反射至二向色分光系统(13)，经二向色分光系统(13)分光对拉曼散射光和瑞利光进行分离； 3)瑞利光被二向色分光系统(13)反射进入共焦探测系统(14)，利用共焦探测系统(14)中的第一探测器(17)，测得反映样品凹凸变化的强度响度相应I ( v，u)，即可进行三维尺度层析成像测试，其中，V为横向归一化光学坐标，u为轴向归一化光学坐标； 4)拉曼散射光经二向色分光系统(13)透射进入拉曼光谱探测系统(18)，利用拉曼光谱探测系统(18)测得载有被测样品光谱特性的拉曼散射信号I ( λ )，即可进行光谱测试，其中λ为波长； 5)将I(λ)、Ι ( v，u)传送到数据处理模块(30)进行数据处理，从而获得包含被测样品(11)位置信息I ( V，U)和光谱信息I ( λ )的三维测量信息I ( V，U，λ ); 6)使被测样品(11)沿x、y方向扫描，物镜(10)沿ζ方向扫描，重复上述步骤测得对应物镜焦点位置附近的一组i个包含位置信息I ( V，u)和光谱信息I ( λ )的序列测量信息Ui ( λ )，Ii ( v，u)}； 7)利用可分辨区域31对应的位置信息Ii(v，u)，找出对应SiE域的光谱信息Ii(λ )值，再依据V与横向位置坐标(X，y)的关系以及u与轴向位置坐标Z的关系，重构反映被测物微区\三维尺度和光谱特性的信息Ii (XilYilZi, Ai),即实现了微区Smin的光谱探测和三维几何位置探测； 8)对应最小可分辨区域δmin的三维尺度和光谱特性由下式确定:
2.根据权利I所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法，其特征在于:共焦曲线(34)最大值M处对应物镜(10)焦点O，此处聚焦光斑尺寸最小，探测的区域最小，共焦曲线(34)其他位置对应物镜(10)的离焦区域，在焦前或焦后BB’区域内的聚焦光斑尺寸随离焦量增大而增大，利用此特点，通过调整样品的ζ向离焦量，并根据实际测量精度需求来控制聚焦光斑的尺寸，可实现对样品探测区域大小可控。
3.根据权利I所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法，其特征在于:激发光束可以是偏振光束:线偏光、圆偏光、径向偏振光等；还可以是由光瞳滤波技术生成的结构光束，其与偏振调制技术联用可以压缩测量聚焦光斑尺寸，提高系统横向分辨力。
4.一种高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:包括激发光束产生系统(I)、第一分光系统(8)、物镜(10)、三维扫描工作台(12)、二向色分光系统(13)、拉曼光谱探测系统(18)、共焦探测系统(14)及数据处理模块(30);其中，第一分光系统(8)、物镜(10)、三维扫描工作台(12)沿光路依次放置在激发光束产生系统(I)出射方向，二向色分光系统(13)位于第一分光系统(8)的反射方向，拉曼光谱探测系统(18)位于二向色分光系统(13)的透射方向，共焦探测系统(14)位于二向色分光系统(13)的反射方向，数据处理模块(30)与拉曼光谱探测系统(18)和共焦探测系统(14)连接，用于融合并处理拉曼光谱探测系统(18)与共焦探测系统(14)采集到的数据。
5.根据权利4所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:拉曼光谱探测系统(18)可以是普通拉曼光谱探测系统，包括沿光路依次放置的第七聚光镜(41)、位于第七聚光镜(41)焦点位置的第二光谱仪(42)及位于第二光谱仪(42)后的第四探测器(43)，用于被测样品的表层光谱探测；还可以是共焦拉曼光谱探测系统，包括沿光路依次放置的第四聚光镜(19)、位于第四聚光镜(19)焦点位置的第三针孔(20)、位于第三针孔(20)后的第五聚光镜(21)、位于第五聚光镜(21)焦点位置的第一光谱仪(22)及位于第一光谱仪(22)后的第二探测器(29)，用于提高系统信噪比和空间分辨力，以及对被测样品的层析光谱探测。
6.根据权利4所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:激发光束产生系统(I)还可以包括偏振调制器(6)及光瞳滤波器(7)，用于产生偏振光及结构光束。
7.根据权利6所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:用于压缩激发光斑的光瞳滤波器(7)可以位于偏振调制器(6)与第一分光系统(8)之间,还可以位于第一分光系统(8)与物镜(10)之间。
8.根据权利4所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:激发光束产生系统(I)还可以放在第一分光系统(8)的反射方向，二向色分光系统(13)沿光路依次放在第一分光系统(8)的 透射方向，拉曼光谱探测系统(18)位于二向色分光系统(13)的透射方向，共焦探测系统(14)位于二向色分光系统(13)的反射方向，数据处理模块(30)连接共焦探测系统(14)与拉曼光谱探测系统(18)。
9.根据权利4所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:还可以包括第二分光系统(35)及位于第二分光系统(35)反射方向的显微观察系统(36),用于被测样品粗猫；其中，第二分光系统(35)可以位于激发光束产生系统(I)与第一分光系统(8)之间，还可以位于第一分光系统(8)与物镜(10)之间。
10.根据权利4所述的高空间分辨共焦拉曼光谱探测装置，其特征在于:数据处理模块(30)包括用于处理位置信息的共焦数据模块(31)和用于融合位置信息和光谱信息的数据融合模块(32)。
全文摘要
本发明属于光学显微成像及光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨共焦拉曼光谱探测方法与装置。该方法与装置在光谱探测中融入共焦技术，并利用二向色分光系统(13)对瑞利光和拉曼散射光进行无损分离，利用共焦曲线(34)最大值与焦点位置精确对应的特性，通过寻找最大值来精确捕获激发光斑焦点位置的光谱信息，实现高空间分辨的光谱探测，构成一种可实现样品微区高空间分辨光谱探测的方法和装置。本发明具有定位准确，高空间分辨，光谱探测灵敏度高等优点，在生物医学、法庭取证等领域有广泛的应用前景。
文档编号G01J3/44GK103105231SQ201310027359
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者赵维谦, 崔晗, 邱丽荣, 王允 申请人:北京理工大学