专利名称：马布特罗胶体金试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于食品安全领域中涉及免疫胶体金和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及马布特罗胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术：
β_兴奋剂(β-agonist)全称β_肾上腺素受体激动剂(β-adrenoceptoragonist)，又叫β -激动剂，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物(phenethylamines, PEAs)。它能选择性地与细胞膜上的β _肾上素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗。但在高于治疗剂量长期服用时，能提高饲养动物的瘦肉率，导致饲养者经济利益提高，而且β_兴奋剂口服方式具有活性而适宜掺和于动物饲料中，所以一直以来被用作饲料添加剂，因为它能影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加，显著提高瘦肉率及减少脂肪率。但是激素类药物存在着潜在的生理毒性，易在动物组织，尤其是内脏中残留，当人类长期食用药物残留的动物性食品，会对人体产生一系列的危害，如导致肌肉兴奋性增强，肌肉震颤，重症者腓肠肌痉挛，同时引起心肌收缩加强，心率加快；使血管壁弹性降低，导致血压升高，微循环血管膨胀，压迫刺激周围的神经，表现为头晕头痛、呕吐和腹泻等症状；对体内的K+、Ca2+、Na+和Mg2+等浓度的平衡产生破坏，导致细胞膜对离子通透性改变；对有心律失常、高血压、青光眼、糖尿病、甲状腺机能亢进、前列腺肥大等疾病的患者有较大的危害甚至危及生命。自1990年西班牙首次爆发消费 者因食用残留有克伦特罗的牛肉导致中毒的严重事件以来，此类食品安全事件频繁发生。例如，2007年9月，上海市336人因食用了残留有克伦特罗的猪肉发生集体中毒事件，是上海市最大规模的克伦特罗中毒事件；2009年2月，广东省70多人因食用猪的内脏引起中毒。因此它的使用受到国际社会的限制，我国也以法律的形式禁止将其作为饲料药物添加剂使用。马布特罗是受体激动剂中的一种。一般以盐酸盐的形式存在，又名Broncholin,化学名为1- (3-氯-4-氨基-5- 二氟甲基苯基)~2~叔丁胺基乙醇，分子式C13H18ClF3N2O,分子量是347.20，沸点为375.9°C。临床上用于缓解由支气管哮喘、慢性支气
管炎以及肺气肿的气道阻塞性障碍引起的呼吸困难等症状。它的分子结构式见如下:
Cl马布特罗为β 2受体激动药,动物试验表明,本品对β 2受体的选择性及松弛支气管平滑肌作用较异丙肾上腺素、沙丁胺醇、丙卡特罗为强，有支气管扩张作用；对致敏豚鼠肺组织的抗原-抗体反应引起的组胺和SRS-A的释放具有剂量相关性抑制作用(体外)，而对大鼠被动皮肤以及皮内给予右旋糖酐后出现的过敏样反应，其抑制作用较异丙肾上腺素、沙丁胺醇、丙卡特罗强，支气管哮喘成年人口服本品50μ g，可抑制由变应原引起的速发型皮内反应，具有抗过敏作用；能使患实验性亚急性支气管炎的吐痰液粘度降低，使鸽的纤毛运动增加，可降低慢性支气管炎及支气管哮喘病人痰的粘度，增加纤毛运动，使粘痰易于排出，起到祛痰作用。但是过量连续使用可引起心律失常甚至心搏停止，还会表现为震颤、头痛、步履不稳、喘气、皮疹、瘙痒、口渴等症状。为了很好的监控β-受体激动剂药物残留，国内外研究建立的多种检测技术和方法，概括起来主要有两大类:一类是定量确证方法，主要有气相色谱质谱法、液相色谱串联质谱法等；还有一类就是快速筛选检测方法，主要有酶联免疫法、胶体金免疫检测法等。定量确证方法成本高，操作时间长，步骤多且复杂，因此无法实现真正意义上的现场检测。因此，目前对于马布特罗的检测手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效检测马布特罗的试纸条和其制备方法。参考图1，本发明提出了一种马布特罗胶体金试纸条，包括:底板1，所述底板I具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有样品垫2、结合物垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中，所述结合物垫3上含有胶体金标记的抗马布特罗单克隆的抗体，所述硝酸纤维素膜4上进一步形成有检测线6和质控线7，所述检测线6由能与抗马布特罗单克隆抗体结合的马布特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线7由能与抗马布特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。在本发发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述的马布特罗胶体金试纸条的方法，其包括下列步骤:制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有检测线和质控线；制备结合物垫；以及组装试纸条，其中用能与抗马布特罗单克隆抗体结合的马布特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为检测线；用能与抗马布特罗单克隆抗体结合驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。由此，能有效制备前面所述的试纸条。根据本发明的实施例，用于制备检测线的马布特罗检测抗原是通过下列方法获得的:称取50mg马布特罗，用IOmL pHl.0的蒸馏水将其溶解作为A液，称取60mg亚硝酸钠用2mL蒸馏水将其溶解作为B液，称取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作为C液；冰浴条件下把B液缓慢滴入A液中，4°C磁力搅拌反应4小时后，在冰浴条件下将其缓慢地加入C液中，加完后调pH至8.0，室温磁力搅拌反应过夜；以及最终产物用0.01MpH7.4的PBS透析除去杂质得到用于制备检测线的马布特罗偶联物。根据本发明的实施例，用于制备质控线的抗体是通过下列步骤获得的:通过在驴体内注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗体的血清经纯化后制得的，以便获得用于制备质控线的抗体。
根据本发明的实施例，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的:将硝酸纤维素膜按2(T30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2^1.0mg/mL的马布特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15 18_ ;将经纯化浓度调整为0.5^1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边If 13mm;将所述硝酸纤维素膜室温干燥30min，置于1%牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min,取出吸干水分,于37摄氏度下孵育30min。根据本发明的实施例，结合物垫是通过下列步骤获得的:选用能与马布特罗结合的抗马布特罗单克隆抗体标记胶体金；以及把经过标记的胶体金，分散在玻璃纤维纸上。根据本发明的实施例，用于标记胶体金的能与马布特罗结合的抗马布特罗单克隆抗体是通过下列步骤制备的:按Davis的方法将马布特罗-蛋白复合体溶于同体积的磷酸生理盐水和完全佐剂中，免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾脏与SP2/0小鼠骨髓细胞融合，融合细胞在选择性培养液中培养7 14天，采用间接竞争ELISA方法筛选分泌抗体的杂交细胞株，杂交细胞株进行三次克隆化，将所产生的克隆细胞株注入小鼠腹腔产生腹水，经纯化后得到用于标记胶体金的能与马布特罗结合的抗马布特罗单克隆抗。为此，本发明提供了一种快速检测马布特罗残留的胶体金试纸条，所产生的单克隆抗体为特异性抗马布特罗单克隆抗体。所述的马布特罗单克隆抗体为马布特罗半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔、鼠)制得。所述的马布特罗半抗原是采用化学方法使其含有活性基团，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的马布特罗-载体蛋白偶联物采用重氮法偶联得到。所述胶体金标记可以用商品化的氯金酸，通过产生的氯金酸与马布特罗单克隆抗体偶联制得。为方便现场检测和大量样本筛查，所述马布特罗的免疫胶体金试纸条包括:NC膜、样品垫、胶金垫、吸水纸、柠檬酸三钠、PVC背衬和结合垫，PVC背衬一端依次黏附样品垫、胶体金结合垫、中间黏附NC膜层，另一端依次黏附吸水垫，所述吸水垫是胶体金结合垫包被了抗马布特罗特异性单克隆抗体一胶体金标记物，NC膜上吸附了马布特罗-OVA和羊或兔抗鼠IgG。制备本发明检测尿液中马布特罗的免疫胶体金试剂方法为:(I)马布特罗全抗原合成将马布特罗半抗原与载体蛋白按重氮法合成马布特罗-载体蛋白偶联物，经分离纯化后得到马布特罗半抗原-载体蛋白偶联物；(2)单克隆抗体制备以半抗原-BSA为免疫原多次免疫Balb/c纯系小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合产生杂交瘤细胞，经选择性培养基筛选获得阳性杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔获取腹水或体外细胞培养收集上清液等方法，大量制备抗马布特罗单克隆抗体；(3)单克隆抗体胶体金标记用朽1檬酸三钠等还原剂将氯金酸还原成2(T40nm的胶体金颗粒；然后把胶体金与抗马布特罗单克隆抗体按1:0.005、.015(体积质量比)混匀，使其结合形成稳定的胶体金颗粒，经纯化和浓缩产生抗马布特罗单克隆抗体-胶体金标记物；(4)羊(兔)抗鼠IgG制备将半抗原-OVA多次免疫小鼠，获取抗血清，再免疫山羊或兔，经分离纯化后获得羊(兔)抗鼠IgG ；(5)胶体金结合垫的制备将马布特罗特异单克隆抗体-胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将马布特罗-OVA偶联物和羊(兔)抗鼠IgG吸附在NC膜的检测区和控制区，在37 °C充分干燥；(6)胶体金试纸条组装:将NC膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水垫等依次粘连在PVC背衬上，将粘好的PVC材料切成一定宽度的试纸条，最后组装到一定大小的塑料盒中即可。有益效果本发明的检测马布特罗免疫胶体金试纸条，采用直接竞争免疫法，以胶体金标记马布特罗特异单克隆抗体，能快速定性检测，结果准确，无需试剂洗涤和标准对照，能分批或单个样品及时检测。本发明的检测马布特罗免疫胶体金试纸条，使用原材料进行生产，产品生产流程简单，成本低。为使用者节省时间，降低因操作步骤冗繁造成的误差，试剂保存时间长、现场操作方便等优点。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明一个实施例的马布特罗免疫胶体金试纸条的结构示意图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1完全抗原(免疫原)合成
权利要求
1.一种马布特罗胶体金试纸条，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫， 其中，所述结合物垫上含有胶体金标记的抗马布特罗单克隆的抗体， 所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗马布特罗单克隆抗体结合的马布特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗马布特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。
2.一种制备权利要求1所述的马布特罗胶体金试纸条的方法，其特征在于，包括下列步骤: 制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有检测线和质控线； 制备结合物垫；以及 组装试纸条， 其中， 用能与抗马布特罗单克隆抗体结合的马布特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为检测线； 用能与抗马布特罗单克隆抗体结合驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于制备检测线的马布特罗检测抗原是通过下列方法获得的: 称取50mg马布特罗，用IOmL pHl.0的蒸馏水将其溶解作为A液，称取60mg亚硝酸钠用2mL蒸馏水将其溶解作为B液，称取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作为C液；冰浴条件下把B液缓慢滴入A液中，4°C磁力搅拌反应4小时后，在冰浴条件下将其缓慢地加入C液中，加完后调pH至8.0，室温磁力搅拌反应过夜；以及 最终产物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去杂质得到用于制备检测线的马布特罗偶联物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其特征是用于制备质控线的抗体是通过下列步骤获得的: 通过在驴体内注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗体的血清经纯化后制得的，以便获得用于制备质控线的抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的: 将硝酸纤维素膜按2(T30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2^1.0mg/mL的马布特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15 18_ ；将经纯化浓度调整为0.5^1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边If 13mm ； 将所述硝酸纤维素膜室温干燥30min，置于1%牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37摄氏度下孵育30min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，结合物垫是通过下列步骤获得的: 选用能与马布特罗结合的抗马布特罗单克隆抗体标记胶体金；以及把经过标记的胶体金，分散在玻璃纤维纸上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用于标记胶体金的能与马布特罗结合的抗马布特罗单克隆抗体是通过下列步骤制备的: 按Davis的方法将马布特罗一蛋白复合体溶于同体积的磷酸生理盐水和完全佐剂中，免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾脏与SP2/0小鼠骨髓细胞融合，融合细胞在选择性培养液中培养7 14d，采用间接竞争ELISA方法筛选分泌抗体的杂交细胞株，杂交细胞株进行三次克隆化，将所产生的克隆 细胞株注入小鼠腹腔产生腹水，经纯化后得到用于标记胶体金的能与马布特罗结合的抗马布特罗单克隆抗体。
全文摘要
本发明提出了一种马布特罗胶体金试纸条及其制备方法，其中马布特罗胶体金试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合物垫上含有胶体金标记的抗马布特罗单克隆的抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗马布特罗单克隆抗体结合的马布特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗马布特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。利用该试纸条能有效检测马布特罗。
文档编号G01N33/558GK103149352SQ20131004571
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者赖卫华, 刘道峰, 邓省亮 申请人:江西中德生物工程有限公司