一种铜离子可视化快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于磷脂酰丝氨酸（DOPS）脂质体修饰的纳米金可视化快速检测铜离子的方法，利用DOPS在一定pH下对Cu2+离子高特异性结合力，将DOPS组装在纳米金表面，利用两个DOPS结合一个Cu2+离子的作用减小相邻的纳米金颗粒间距，使纳米金发生聚集产生颜色变化（由红色变为蓝色），从而达到对Cu2+离子浓度的可视化快速检测。本发明的方法具有快速、简单、灵敏、可视化、高特异性、强抗基体干扰和低成本等特点，可用于各种水样品中铜离子的快速可视化检测。
【专利说明】一种铜离子可视化快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，涉及一种铜离子可视化快速检测方法，具体涉及一种基于磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体修饰的纳米金可视化快速检测铜离子的方法。
【背景技术】
[0002]铜作为一种有色过渡金属广泛应用在工业和农业的生产过程。但是由于过度的开发和利用，导致了环境特别是水环境中铜离子的严重污染。例如高浓度的铜经常被非法添加到猪和家禽饲料中，以促进其生长，高铜猪粪作为有机肥料在菜田上使用，从而通过食物链积累在人体肝脏中。虽然铜离子是人体必须元素之一，但是铜作为重金属元素具有很强的毒性。过量的铜摄入会对人体产生伤害。比如，铜(II)是一种潜在的诱变剂，高剂量的铜(II)离子可能导致哺乳动物细胞染色体的断裂和纺锤体干扰。威尔逊氏及门克斯病也是两种与铜代谢紊乱密切相关的人类遗传性疾病，因此对环境和人体中的铜离子进行快速检测具有重要意义。中华人民共和国地表水环境质量标准(GB 3838-2002)规定铜离子检测标准为 0.01 (I 类)-1.0 (I1-V 类)mg/L。
[0003]传统上，铜离子检测方法主要是仪器分析，例如原子吸收分光光度法、质谱法、中子活化分析法、原子发射光谱法、指示生物检测法、电化学检测法等。这些方法需要用到大型仪器，耗时且无法用于现场的快速检测，无法慢速现在社会发展需要。相比于上述传统方法，比色法具有快速、便携、成本低且可现场分析等优点。目前报道较多的通过比色法对铜离子检测的方法主要是通过有机聚合物与铜离子络合显色或通过纳米金聚沉颜色变化。如专利GN 102863725A合成了 一种检测铜离子的显色探针P (NVP-GMA-g-H)，并在此基础上合成了凝胶探针P (NVP-co-Bi S-(GMA-g-H))，但是由于有机聚合物合成较为复杂，分离提纯过程困难，限制了其在铜离子检测中的应用。Qu Xiaogang课题组报道了一种基于Cu+离子催化点击化学反应方法，将碳纳米管结合到磁性二氧化硅纳米颗粒上，通过碳纳米管催化底物TMB显色间接测定Cu2+离子的浓度。同样使用电击化学的方法，Jiang Xingyu课题组发展了一种基于纳米金的检测Cu2+的方法。将叠氮化合物与三炔基化合物分别通过金巯键连接在纳米金的表面，用抗坏血酸钠将Cu2+还原为Cu+，在Cu+的催化下，叠氮化合物与三炔基化合物发生环加成反应，促使分散的纳米金稳定的结合在一起，通过纳米金颜色的变化检测铜离子。此方法快速、稳定、选择性好、检测限在20 μ M。这些点击化学反应是采用Cu(I)配合物催化，此类催化剂要求去除氧气，以免被氧化而失效，因此限制了点击化学在铜离子现场检测的应用。同时，上述快速检测方法还存在着抗基体干扰能力较低，无法用于实际样品检测等缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种基于磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体修饰的纳米金可视化快速检测铜离子的方法，具有快速、简单、灵敏、可视化、高特异性、强抗基体干扰和低成本等特点，可用于各种水样品中铜离子的快速可视化检测。[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
将磷脂酰丝氨酸(DOPS)组装在纳米金表面，利用两个DOPS结合一个Cu2+离子的作用减小相邻的纳米金颗粒间距，使纳米金发生聚集产生颜色变化，从而达到对Cu2+离子浓度的可视化快速检测。
[0006]采用双层膜法把DOPS脂质体可控组装在纳米金表面，制备DOPS脂质体修饰的纳米金溶液。
[0007]所述的DOPS脂质体修饰的纳米金溶液的制备方法包括以下步骤:
(1)采用种子生长法合成溴化十六烷基三甲铵(CTAB)双层膜修饰的纳米金溶液
将 lwt.% HAuCl4 稀释至 2mM，取 18.75 μ L 2mM HAuCl4,力卩入 66 μ L 二次水，力口入56.4 μ L 0.2Μ CTAB,力口入 9 μ L 0.1M NaBH4,混匀放置 2 小时，SP 得晶种；取 5mL 2mMHAuCl4，加入35.5 mL 二次水，加入4mL 0.2M CTAB，混匀；加入3mL 0.1M抗坏血酸，再加入2.5mL稀释40倍的晶种，混匀，25°C水浴24小时，即得CTAB双层膜修饰的纳米金溶液50mL ；
(2)采用双层膜法制备DOPS脂质体修饰的纳米金溶液
称取12wt.%的磷脂酰丝氨酸(DOPS) /1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)溶于氯仿，混匀，使总摩尔浓度为20mM，真空干燥后，加入与氯仿等体积的二次水，40°C恒温水浴I小时，之后通氮气10分钟；再用IOW功率超声粉碎5分钟，此时脂质体分散液由浑浊变成澄清；最后12000rpm离心30分钟，取其上清，获得12 wt.% DOPS / POPC脂质体分散液；
取ImL步骤(I)的溴化十六烷基三甲铵双层膜修饰的纳米金溶液，12000rpm离心30分钟，去上清，加ImL 二次水，再12000rpm离心30分钟，去上清，加100 μ L 二次水，加入
2.5 μ LDOPS / POPC脂质体分散液，放入47°C恒温水浴5小时；然后8000rpm离心30分钟，去上清，加入400 μ L pH= 8.0的浓度为2 mM的MES/Tris (2-吗啉乙磺酸/三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，混匀制成DOPS脂质体修饰的纳米金溶液。
[0008]测试时，取相同体积的水样和DOPS脂质体修饰的纳米金溶液混匀，40 °C恒温IOmin后，通过裸眼观测混合溶液颜色变化(随着Cu2+离子浓度的增大，颜色由酒红色变为紫红色直至蓝色)或紫外分光光度计测试溶液的吸光度对Cu2+离子进行半定量及定量快速检测。
[0009]本发明的显著优点在于:
(I)本发明涉及的检测方法响应快，一次检测仅需10分钟时间。
[0010](2)本发明涉及的检测方法具有较高的灵敏度，可检测低至1.5 μΜ的铜离子。最低检出限低于地表水中铜离子含量国家标准(GB 3838-2002)，可用于水环境中Cu2+的现场快速检测。
[0011](3)本发明制备的DOPS修饰的纳米金测试液稳定，4°C冰箱保存3个月后仍可用于铜离子检测。
[0012](4)本发明涉及的检测方法具有良好的特异性，该探针只对铜离子有显色反应，考察了 12 种常见离子(如 Al3+、Ba2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Na+、K+),都不引起干扰。
[0013](5)本发明涉及的检测方法操作简单，用裸眼即可观察实验现象，无需昂贵特殊仪器，避免了传统方法需要借助大型仪器操作过程，适合铜离子的现场快速检测。[0014](6)本发明涉及的检测方法具有良好的抗基质干扰能力，检测水样无需复杂的前处理，只需要将水样过滤去除沙土及悬浮物，便可立即检测。
[0015](7)成本低廉，一个样品的检测成本仅约人民币0.1元。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是A为所制备磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体修饰的纳米金测试液颜色和扫描电镜图。B为加入Cu2+离子后，DOPS修饰的纳米金测试液颜色和扫描电镜图。
[0017]图2是利用所制备的纳米金测试液检测不同浓度Cu2+离子时溶液颜色的变化图。
[0018]图3是利用所制备的纳米金测试液检测Cu2+离子时的特异性验证。相比于12种常见离子，只有铜离子存在时纳米金测试液的颜色才发生变化。
【具体实施方式】
[0019]本发明利用磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体在特定pH下对Cu2+具有特异结合能力，以DOPS为Cu2+识别探针，结合纳米金实现对Cu2+的可视化快速检测。主要技术方案是:采用双层膜法把磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体可控组装在纳米金表面，制备磷脂酰丝氨酸脂质体修饰的纳米金溶液。所制备的DOPS修饰的纳米金溶液呈稳定酒红色，在一定pH下，纳米金表面的DOPS可特异结合Cu2+ (这个过程是可逆，且受pH控制)使纳米金发生聚集，并产生颜色变化(随着Cu2+浓度的增大，颜色由酒红色变为紫红色直至蓝色)，达到对Cu2+的可视化快速检测。
[0020]DOPS修饰的纳米金测试液的制备方法具体如下:
(I)采用种子生长法合成CTAB (溴化十六烷基三甲铵)双层膜修饰的纳米金。首先制备晶种:取1% HAuCl4稀释至2mM，取18.75 μ L 2mM HAuCl4,加入66 μ L 二次水，加入56.4 μ L 0.2Μ CTAB,加入9 μ L 0.1M NaBH4,混匀放置2小时，即得晶种。取5mL 2mMHAuCl4，加入35.5 mL 二次水，加入4mL 0.2M CTAB，混匀。加入3mL 0.1M抗坏血酸，再加入2.5mL稀释40倍的晶种，混匀，25°C水浴24小时，即得纳米金溶液50mL。所得纳米金溶液为稳定酒红色。
[0021](2)采用双层膜法制备磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体修饰的纳米金测试液。首先，称取12% (w/w)的基磷脂酰丝氨酸(DOPS) /1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)溶于氯仿，混匀，使总摩尔浓度为20mM，真空干燥后，加入与氯仿等体积的二次水，40°C恒温水浴I小时，之后通氮气10分钟。再用IOw功率超声粉碎5分钟，此时脂质体分散液由浑浊变成澄清。最后12000rpm离心30分钟，取其上清。即获得12% (w/w) D0PS/P0PC脂质体分散液。第二，取ImL上述(步骤I)所制备的CTAB双层膜修饰的纳米金分散液，12000rpm离心30分钟，去上清，加ImL 二次水，再12000rpm离心30分钟，去上清，加100 μ L 二次水，加入2.5 μ L上述D0PS/P0PC脂质体溶液，放入47°C恒温水浴5小时。然后8000rpm离心30分钟，去上清，加入400yL pH= 8.0的浓度为2 mM的MES/Tris (1:1)缓冲液，混匀制成纳米金测试液。
[0022]测试时，取相同体积的水样和纳米金测试液混匀，40°C恒温水浴IOmin后，通过裸眼观测混合溶液颜色变化或紫外分光光度计测试吸光度对Cu2+进行半定量及定量快速检测。[0023]产品的使用过程和方式:
(I)在浓度ΙμΜ至100 μΜ间取3至4个不同浓度，分别取铜标准溶液100 μ L，各与100μ L本发明制备的纳米金测试液混匀，40°C恒温下放置10分钟，观测颜色变化或通过紫外分光光度计测定吸光度，用作比对标准。
[0024](2)取100 μ L水样品，与100 μ L本发明制备的纳米金测试液混匀，40°C恒温下放置10分钟，观测颜色变化或通过紫外分光光度计测定吸光度，对比步骤(I)所得的标准铜离子溶液的颜色或吸光度，对样品中的铜离子进行半定量或定量检测。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种铜离子可视化快速检测方法，其特征在于:将磷脂酰丝氨酸组装在纳米金表面，利用两个磷脂酰丝氨酸结合一个Cu2+离子的作用减小相邻的纳米金颗粒间距，使纳米金发生聚集产生颜色变化，从而达到对Cu2+离子浓度的可视化快速检测。
2.根据权利要求1所述的铜离子可视化快速检测方法，其特征在于:采用双层膜法把磷脂酰丝氨酸脂质体可控组装在纳米金表面，制备磷脂酰丝氨酸脂质体修饰的纳米金溶液。
3.根据权利要求2所述的铜离子可视化快速检测方法，其特征在于:所述的磷脂酰丝氨酸脂质体修饰的纳米金溶液的制备方法包括以下步骤: (1)采用种子生长法合成溴化十六烷基三甲铵双层膜修饰的纳米金溶液 将 lwt.% HAuCl4 稀释至 2mM，取 18.75 μ L 2mM HAuCl4,力卩入 66 μ L 二次水，力口 入56.4yL 0.2M溴化十六烷基三甲铵，加入9 μ L 0.1M NaBH4，混匀放置2小时，即得晶种；取5mL 2mM HAuCl4,加入35.5 mL 二次水，加入4mL (λ 2M溴化十六烷基三甲铵，混匀；加入3mL0.1M抗坏血酸，再加入2.5mL稀释40倍的晶种，混匀，25°C水浴24小时，即得溴化十六烷基三甲铵双层膜修饰的纳米金溶液50mL ； (2)采用双层膜法制备磷脂酰丝氨酸脂质体修饰的纳米金溶液 称取12wt.%的磷脂酰丝氨酸/1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂溶于氯仿，混匀，使总摩尔浓度为20mM，真空干燥后，加入与氯仿等体积的二次水，40°C恒温水浴I小时，之后通氮气10分钟；再用IOW功率超声粉碎5分钟，此时脂质体分散液由浑浊变成澄清；最后12000rpm离心30分钟，取其上清，获得12 wt.%磷脂酰丝氨酸/1-棕榈酰基_2_油酰基卵磷脂脂质体分散液； 取ImL步骤(I)的溴化十六烷基三甲铵双层膜修饰的纳米金溶液，12000rpm离心30分钟,去上清,加ImL 二次水，再12000rpm离心30分钟，去上清，加100 μ L 二次水，加入2.5 μ L磷脂酰丝氨酸/1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂脂质体分散液，放入47°C恒温水浴5小时；然后8000rpm离心30分钟，去上清，加入400 μ L pH= 8.0的浓度为2 mM的2-吗啉乙磺酸/三羟甲基氨基甲烷缓冲液，混匀制成磷脂酰丝氨酸脂质体修饰的纳米金溶液。
4.根据权利要求2所述的铜离子可视化快速检测方法，其特征在于:测试时，取相同体积的水样和磷脂酰丝氨酸脂质体修饰的纳米金溶液混匀，40°C恒温IOmin后，通过裸眼观测混合溶液颜色变化或紫外分光光度计测试溶液的吸光度对Cu2+进行半定量及定量快速检测。
【文档编号】G01N1/28GK103454273SQ201310433574
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】付凤富, 杨玮娟, 何叶 申请人:福州大学