口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的确定及其含量测定方法，含量测定方法是采用高效液相色谱—质谱联用检测方法，在所建立的检测方法下对口服热淋清颗粒后肾脏组织中的化学成分没食子酸和原儿茶酸进行含量测定。本发明含量测定方法的精密度高，重现性好，稳定性好，测定结果准确，可有效评价口服热淋清颗粒后没食子酸和原儿茶酸在肾脏组织中的分布。
【专利说明】口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药有效成分体内代谢研究【技术领域】，具体涉及一种口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的确定及其含量测定方法。
【背景技术】
[0002]热淋清颗粒是以苗药头花寥为原料制成的单方制剂，收载于《中国药典》2010版。具清热解毒、利尿通淋的功效。用于湿热蕴结，小便黄赤，淋漓涩痛之症，尿路感染，肾盂肾炎见上述证候者。对泌尿系统感染具有确切的疗效。“热淋清颗粒”为国家中药保护品种、国家社保药物，并为唯一进入2010版《中国药典》的苗药，获国家发展改革委员会单独定价权。
[0003]根据文献报道，热淋清颗粒中主要的化学成分为酚酸类化合物和黄酮类化合物。现热淋清颗粒收载于《中国药典》2010版，该标准【含量测定】项仅以没食子酸为指标成分。热淋清颗粒临床上主要应用于治疗泌尿系统疾病，其发挥功效的有效成分是哪些？如何到达肾脏发挥作用？在肾脏中如何进行代谢？这些问题的解决必须依赖于一种准确可靠的有效成分含量测定方法，本发明正是基于这样的背景，发明了一种评价口服热淋清颗粒后肾脏组织中化学成分的含量测定方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于:提供一种口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的确定及其含量测定方法。本发明通过对口服热淋清颗粒后肾脏组织中的化学成分没食子酸及原儿茶酸进行含量测定研究，使口服热淋清颗粒后体内研究更为科学合理。
[0005]本发明是这样实现的:
[0006]提供一种口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的测定方法，其包括以下步骤:
[0007](I)测试样品的制备:
[0008](a)取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg ；
[0009](b)分别在30~360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1~0.5g，加5~10生理盐水，粉碎，3000~6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中；
[0010](C)加入内标岩白菜素母液10 μ 1，然后按肾脏组织与沉淀试剂体积比为1:4~8沉淀蛋白，沉淀时间2~5min，涡旋混匀30~60s后，在O~10°C恒温条件下以10000~12000r/min离心5~15min(所述的沉淀试剂为乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液并且添加I %~4%酸，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合)
[0011](d)将上层液转移至新空白EP管中，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100μΙ流动相溶解，涡旋混匀30~60s后，在O~10°C恒温条件下以10000~12000r/min离心5?15min，取上清液即为供试品溶液；
[0012](e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的动物肾脏组织进行处理，得到空白溶液；
[0013](f)对照品溶液的制备:分别精密称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01?lmg,各自加纯甲醇定容至IOml,即得三种母液,分别取三种母液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至所需浓度，即为对照品溶液；
[0014](2) LC-MS/MS分析的色谱条件和检测条件:
[0015]色谱柱为反相色谱柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O?20:80?100 (体积比)为流动相，流速为0.1?0.5mL/min,柱温为20?40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000?3000V，雾化温度为300?500°C，鞘气压力为30?50mTorr，辅助气压力为5?15mTorr，毛细管温度为200?400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.05%?0.5 %，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合);
[0016](3)测定法:分别精密吸取对照品溶液、空白溶液与供试品溶液5?20μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
[0017]根据本发明的方法，其中步骤(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4ml。
[0018]根据本发明的方法，其中步骤(b)中，分别在30min，60min，2h，3h，6h后大鼠进行米血。
[0019]根据本发明的方法,其中步骤(b)中，将样品于低速离心机5000r/min离心lOmin。
[0020]根据本发明的方法，其中步骤(c)中，用酸度为2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按体积比1:4沉淀蛋白5min。
[0021]根据本发明的方法，其中步骤(C)中，沉淀蛋白后涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速 12000r/min,离心 IOmin0
[0022]根据本发明的方法，其中步骤(C)中，使用甲酸:乙酸=2:1体积比混合酸来酸化沉淀试剂。
[0023]根据本发明的方法，其中两种入肾脏成分是没食子酸和原儿茶酸。
[0024]根据本发明的方法，其中步骤(d)中，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干。
[0025]根据本发明的方法，其中步骤(d)中，残留物用ΙΟΟμ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min, 4°C恒温,离心IOmin后取10 μ I进样。
[0026]根据本发明的方法，其中步骤(2)中，色谱柱为C18色谱柱。
[0027]根据本发明的方法，其中步骤(2)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.1%。
[0028]根据本发明的方法，其中步骤⑵中,流速为0.2ml/min，柱温为30°C。
[0029]根据本发明的方法，其中步骤(2)中，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr，毛细管温度为300°C。
[0030]根据本发明的方法，其中步骤(2)中，使用梯度洗脱，洗脱液的变化为:开始时，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%，稳定3min ;接着至第IOmin时，酸性乙腈相线性增加至10%，酸性水溶液相90% ;第10.1min时，酸性乙腈相改为2 %，酸性水溶液相98%，稳定7min。
[0031]根据本发明的方法，其中步骤(3)中，分别精密吸取对照品溶液、空白溶液与供试品溶液5 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪。
[0032]根据本发明的方法，其中步骤(2)中，质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(TybeLens Offset) 71V,碰撞压力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(CollisionEnergy) 13eV ;原儿茶酸 152.918 — 109.244，补偿电压(Tube Lens Offset) 75V，碰撞压力(Collision Press μ re) 1.SmTorr,碰撞能量(Collision Energy) l；3eV ;内标岩白菜素 326.922 — 192.167，补偿电压(Tube Lens Offset) 100V，碰撞压力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV。
[0033]根据本发明的方法，其特征在于:取热淋清颗粒2.0g，W 5?10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在30?360min后，对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1?0.5g，加5?10生理盐水，粉碎，3000?6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，用酸度为2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按体积比1:4沉淀蛋白5min，涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心lOmin，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心IOmin后取10 μ I进样，空白肾脏组织按同样方法处理，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行LC-MS/MS分析:
[0034]色谱条件和检测条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5%)水=O?20:80?100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.2ml/min，柱温为30°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr，毛细管温度为3500C ；
[0035]对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01?lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10ml，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
[0036]测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
[0037]前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的变化为:开始时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定3min ;第IOmin时，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定7min。
[0038]前述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞压力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原儿茶酸 I52.918 — 109.244，补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,内标 326.922 — 192.167,补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞压力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0039]根据本发明，所述反相色谱柱是C18色谱柱。[0040]根据本发明的方法，其优选地包括以下步骤:
[0041]取热淋清颗粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在30?360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1?0.5g，加5?10生理盐水，粉碎，3000?6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ 1，然后按1:4?1:8体积比用I?4%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀时间2?5min,润旋混勻30?60s后10000?12000r/min, O?10°C恒温,离心5?15min,上层液转移至新空白EP管中于30?50°C氮气流吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀30?60s后10000?12000r/min, O?10°C恒温，离心5?15min后取5?20 μ I进样，空白血楽.按同样方法处理，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行LC-MS/MS分析:
[0042]色谱条件和检测条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5%)水=O?20:80?100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.1?0.5mL/min,柱温为20?40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000?3000V，雾化温度为300?500°C，鞘气压力为30?50mTorr，辅助气压力为5?15mTorr，毛细管温度为200?400°C ；
[0043]对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01?lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10ml，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
[0044]根据本发明的方法，其特征在于肾脏组织样品按以下步骤操作:
[0045]取热淋清颗粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在30?360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1?0.5g，加5?10生理盐水，粉碎，3000?6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ 1，然后按1:4体积比用2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀时间5min，涡旋混匀后12000r/min离心5min，上层液转移至新空白EP管中于40°C氮气流吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，4°C恒温，12000r/min离心IOmin后取10 μ I进样，空白肾脏组织样品按同样方法处理。
[0046]根据本发明的方法，其特征在于色谱柱规格为2.1 X 150mm，填料粒径为1.7μπι，以甲酸0.1 %乙腈Α:甲酸0.1 %水B为流动相，按以下条件梯度洗脱:0?3min2%A, 3.0 ?3.1min2% A—10% A, 3.I ?10.0minl0% A, 10.0 ?10.1minl0% -2% A, 10.1 ?17.0min2% A。
[0047]根据本发明的方法，其特征在于，质谱喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为350°C。
[0048]根据本发明的方法，其特征在于:质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为:没食子酸 169.181 — 125.268，原儿茶酸 152.918 — 109.244，内标 326.922 — 192.167。
[0049]以下是本发明人对口服热淋清颗粒后肾脏组织中化学成分含量测定进行研究的过程:
[0050]一、口服热淋清颗粒肾脏组织中化学成分的确定
[0051]本发明人对于有关热淋清颗粒及其原料药的文献进行了大量的研究，而且根据发明人所在课题组前期对头花寥展开的化学成分研究发现，没食子酸和原儿茶酸为头花寥中的生物活性成分，因此选取热淋清颗粒中的没食子酸和原儿茶酸为指标进行了口服热淋清颗粒后肾脏组织分布试验研究。
[0052]取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在给药后30min，60min，2h，3h，6h，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.5g，加5生理盐水，粉碎，5000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，用酸度为2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按体积比1:4沉淀蛋白5min,润旋均匀30s后4°C恒温离心,转速12000r/min,离心10min,将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心10min后取10 μ I进样，空白肾脏组织按同样方法处理，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行LC-MS/MS:
[0053]色谱条件和检测条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1 % )水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.2ml/min,柱温为30°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为350°C ；
[0054]对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品
0.01~lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10ml，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
[0055]测定法:分别 精密吸取对照品溶液与供试品溶液5 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
[0056]前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的变化为:开始时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定3min ;第IOmin时，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定7min。
[0057]前述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞压力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原儿茶酸 I52.918 — 109.244，补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,内标 326.922 — 192.167,补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞压力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0058]测定结果如图1-4所示，从图可以看出，没食子酸和原儿茶酸为口服热淋清颗粒后肾脏组织中的化学成分。
[0059]二、口服热淋清颗粒大鼠肾脏组织中没食子酸和原儿茶酸的含量测定方法的建立
[0060]1.仪器与试药
[0061]TSQ 04 8社11111超高效液相色谱-质谱联用仪(河？^:-|^/^5)，包括:三重四级杆质量分析器，ESI离子源，Xcalib μ r工作站，液相部分为Thermo AccelaMPLC,包括:Accela PDA检测器,Accela自动进样器，Accelal250输液泵(美国赛默飞世尔科技有限公司)、十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、KQ5200E型超声波清洗(昆明市超声仪器有限公司)，TGL-16M高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)，EYELANG-2200型氮气吹干仪(日本东京理化器械株式会社)，微量移液枪(德国Eppendorf公司)。
[0062]乙腈(色谱纯，美国“天地”试剂公司)、甲醇(色谱纯，美国“天地”试剂公司)；水(重蒸水，临用前制备)；甲酸(色谱纯，美国Roe Scientific公司)、乙酸(色谱纯，美国 Roe Scientific 公司)；
[0063]没食子酸、原儿茶酸及岩白菜素对照品(中国药品生物制品检定所提供)。
[0064]2.仪器操作条件
[0065]液相色谱条件:PhenomenexKinetexXB_C18 色谱柱(2.1 X 150mm, 1.7 μ m),流动相A为乙腈(含0.1%甲酸)，B为水(含0.1%甲酸)，梯度洗脱:0~3min2%A，3.0~
3.1min2 % A—10 % A, 3.I ~10.0minlO % A, 10.0 ~10.1minlO % -2 % A, 10.1 ~17.0min2% A，流速 0.2mL/min，进样量为 5 μ L,
[0066]质谱条件:采用ESI离子源；负离子检出模式；扫描方式为多反应监测方式(MRM);用于定量分析的监测离子见表1。离子源参数:鞘气流速:40Arb，辅助气流速:IOArb ;毛细管温度:350°C ;毛细管电压:30V ;雾化温度为350°C ;喷雾电压:2500V ;扫描频率:0.1s。
[0067]表1、以SRM模式优化GA、PA、内标(IS)形成稳定子离子所需碰撞能量
[0068]
【权利要求】
1.口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的测定方法，其包括以下步骤: (1)测试样品的制备: (a)取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg ； (b)分别在30~360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1~0.5g，加5~10生理盐水，粉碎，3000~6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中； (c)加入内标岩白菜素母液10μ 1，然后按肾脏组织与沉淀试剂体积比为1:4~8沉淀蛋白，沉淀时间2~5min，涡旋混匀30~60s后，在O~I (TC恒温条件下以10000~12000r/min离心5~15min (所述的沉淀试剂为乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液并且添加I %~4%酸，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合) (d)将上层液转移至新空白EP管中，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100μ I流动相溶解，润旋混匀30~60s后,在O~10°C恒温条件下以10000~12000r/min离心5~15min，取上清液即为供试品溶液； (e)按步骤(b)至 步骤⑷的方法对未服用药物的动物肾脏组织进行处理，得到空白溶液； (f)对照品溶液的制备:分别精密称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~Img,各自加纯甲醇定容至IOml,即得三种母液,分别取三种母液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至所需浓度，即为对照品溶液； (2)LC-MS/MS分析的色谱条件和检测条件: 色谱柱为反相色谱柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，流速为0.1~0.5mL/min，柱温为20~40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000~3000V，雾化温度为300~500°C，鞘气压力为30~50mTorr，辅助气压力为5~15mTorr，毛细管温度为200~400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.05%~0.5 %，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合); (3)测定法:分别精密吸取对照品溶液、空白溶液与供试品溶液5~20μL，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
2.根权利要求1的方法，其中步骤(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4ml。
3.根权利要求1的方法，其中步骤(b)中，分别在30min，60min，2h，3h，6h后大鼠进行米血。
4.根权利要求1的方法，其中步骤(b)中，将样品于低速离心机5000r/min离心10min。
5.根权利要求1的方法，其中步骤(c)中，用酸度为2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按体积比1:4沉淀蛋白5min。
6.根权利要求1的方法，其中步骤(c)中，沉淀蛋白后涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速 12000r/min,离心 lOmin。
7.根权利要求1的方法，其中步骤(c)中，使用甲酸:乙酸=2:1体积比混合酸来酸化沉淀试剂。
8.根权利要求1的方法，其中步骤(d)中，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干。
9.根权利要求1的方法，其中: 步骤(d)中，残留物用100μ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心.10min后取10 μ I进样； 步骤(2)中，色谱柱为C18色谱柱； 步骤(2)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.1% ； 步骤⑵中，流速为0.2ml/min，柱温为30°C ； 步骤(2)中，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为.350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为300°C ； 步骤(2)中，使用梯度洗脱，洗脱液的变化为:开始时，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相.98%,稳定3min ;接着至第IOmin时,酸性乙腈相线性增加至10%,酸性水溶液相90% ;第.10.1min时，酸性乙腈相改为2%，酸性水溶液相98%，稳定7min ； 步骤⑶中，分别精密吸取对照品溶液、空白溶液与供试品溶液5yL，注入高效液相色谱-质谱联用仪；和/或 步骤(2)中，质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 71V,碰撞压力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV ；原儿茶酸152.918 — 109.244，补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV ;内标岩白菜素 326.922 — 192.167，补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞压力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV。
10.根权利要求1的方法，其特征在于: 取热淋清颗粒2.0g,加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在30~360min后，对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1~0.5g，加5~10生理盐水，粉碎，3000~6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，用酸度为2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按体积比1:4沉淀蛋白5min,润旋均匀30s后4°C恒温离心,转速12000r/min,离心10min,将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心IOmin后取10μ I进样，空白肾脏组织按同样方法处理，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行LC-MS/MS分析: 色谱条件和检测条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5(%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.2ml/min，柱温为30°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为.350 0C ； 对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~.lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10ml，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度；或者，其特征在于: 前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的变化为:开始时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定3min ;第IOmin时，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min时，甲酸乙腈相2 %，甲酸水溶液相98 %，稳定7min ； 或者，其特征在于: 前述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞压力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV,原儿茶酸 152.918 — 109.244,补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,内标 326.922 — 192.167,补偿电压(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞压力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV ； 或者，其特征在于:所述反相色谱柱是C18色谱柱； 或者，其特征在于:取热淋清颗粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在30~360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1~0.5g，加5~10生理盐水，粉碎，3000~6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10μ 1，然后按1:4~1:8体积比用I~4%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀时间2~5min，润旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温,离心5~15min,上层液转移至新空白EP管中于30~50°C氮气流吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温，离心5~15min后取5~20 μ I进样，空白血衆按同样方法处理，采用液 相色谱-质谱联用仪按以下条件进行LC-MS/MS分析: 色谱条件和检测条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5(%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.1~0.5mL/min,柱温为20~40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000~3000V，雾化温度为300~500°C，鞘气压力为30~50mTorr，辅助气压力为5~15mTorr，毛细管温度为200~400°C ； 对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10ml，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度；或者，其特征在于: 肾脏组织样品按以下步骤操作: 取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg，分别在30~360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1~0.5g，加5~10生理盐水，粉碎，3000~6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ I，然后按1:4体积比用2 %酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀时间5min,润旋混匀后12000r/min离心5min,上层液转移至新空白EP管中于40°C氮气流吹干，残留物用100 μ I流动相溶解，4°C恒温，12000r/min离心10min后取10 μ I进样，空白肾脏组织样品按同样方法处理； 或者，其特征在于:色谱柱规格为2.1 X 150mm,填料粒径为1.7 μ m，以甲酸0.1 %乙腈A:甲酸0.1 %水B为流动相，按以下条件梯度洗脱:0~3min2% A，3.0~3.1min2% A—10% A, 3.I ~10.0minl0% A, 10.0 ~10.1minl0% -2% A, 10.1 ~17.0min2% A ； 或者，其特征在于:质谱喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为lOmTorr，毛细管温度为350°C ； 或者，其特征在于:质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为:没食子酸.169.181 — 125.268，原儿茶酸 152.91 8 — 109.244，内标 326.922 — 192.167。
【文档编号】G01N30/02GK103983713SQ201410234592
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】周欣, 龚小见, 陈华国, 马风伟, 赵杨, 梁斌, 杨槐 申请人:贵州威门药业股份有限公司