专利名称：热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法
技术领域：
本发明属中药技术领域，涉及从热淋清颗粒的原料中提取短叶苏木酚的方法，例如从头花寥水提物中提取短叶苏木酚的方法，还涉及从热淋清颗粒的原料或头花寥水提物中提取短叶苏木酚和槲皮苷的方法。本发明还进一步涉及使用短叶苏木酚对热淋清颗粒制剂进行质量监控的方法。
背景技术：
头花寥为寥科植物头花寥Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don的干燥全草或地上部分，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》2003年版，具清热利湿、抗菌消炎、利尿通淋等功效(贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药材民族药材质量标准[M].贵阳贵州科技出版社，2003 :147)。头花寥是贵州常用苗药，是贵州省中药现代化重点发展的“六大苗药”和重点培育发展的“七大中药产业链”的品种之一。以头花寥为主要原料的热淋清颗粒在临床上用于治疗泌尿系统感染，被《中国药典》2010年版一部收载，但国内外至今对头花寥的研究报道较少，已有的文献初步认为黄酮类、酚酸类为头花寥的有效成分[卜4]。目前《中国药典》2010年版仅以没食子酸作为热淋清颗粒的定量监控指标，仍然期待有更有效的可靠的评价指标。本发明人致力于对热淋清颗粒的原料药(即头花寥水提物，为粉末状物)进行系统的全成分分析，期待寻找可用于定量监控热淋清制剂例如热淋清颗粒制剂的新方法。众所周知，监控成分复杂的物质例如中药提取物需要有明确的监控指标，例如需要有该中药中含有的、可得到、易得到的标准物质，并且对于某一中药提取物，如果能够以多种化学物质同时监控其质量，则对于药品的质量把控将会比单一组分控制更加合理。因此，从热淋清颗粒的原料药(即头花寥水提物，为粉末状物)中发现新的化学物质仍是本领域技术人员期待的，以便为药品质量控制提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于为头花寥制剂例如热淋清颗粒提供药品质量控制的新途径。本发明人发现，采用独特的方法处理热淋清颗粒制剂的原料药即头花寥水提物，寻找到一种未曾在头花寥药材中报道的新物质即短叶苏木酹(brevifolin),该方法在获得该新物质以及其它化学单体方面的收率具有有益的工业价值的优点。本发明基于此发现而得以完成。为此，本发明第一方面提供了从热淋清颗粒的原料(例如头花寥水提物)中提取短叶苏木酚(和/或槲皮苷)的方法，该方法包括以下步骤 (I)取头花寥水提物，用60 95%乙醇浸泡5 24小时，超声处理10 120min，过滤，滤液蒸发干燥，残余物用水溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至上层无色，将乙酸乙酯层合并，蒸发干燥，得到乙酸乙酯粗提物；(2)将步骤⑴所得乙酸乙酯粗提物加载到高速逆流色谱仪(HSCCC)中，用正己烷乙酸乙酯甲醇水(I 4 6 0. 8 I. 2 4 6)的混合物作为HSCCC溶剂系统进行分离，收集40 90min的流分；必要时重复此分离和收集的操作；将所述流分蒸除溶剂，得到头花寥二次分离原料物；(3)在分液漏斗中，按乙酸乙酯正丁醇0. 008 0. 012mol/L的磷酸氢二钾溶液=3. 36 5. 04 0. 64 0. 96 5的比例(体积比)配置约1500mL的两相溶剂系统，静置分层成上相(固定相)和下相(流动相)，超声脱气；(4)采用单线圈、头接尾的洗脱方式，首先使管路充满固定相(上相)，主机正转，然后泵入流动相，待流动相流出，两相溶剂在柱中达到平衡状态时，取步骤(2)所得头花寥二次分离原料物，溶于等体积的上下相中，用注射器进样；(5)用紫外检测器对流分进行检测，检测波长为250 290nm，同时记录色谱图，根据色谱图用流分收集器自动收集流分，每3min收集一管；分离时间在270min以上；(6)收集30 40min之间出峰的流分作为流分I, 200 260min之间出峰的流分作为流分II ； (7)分别除去流分I和流分II的溶剂，流分I和流分II分别相应地得到组分I和组分II，任选地分别对组分I和组分I进一步精制，组分I为短叶苏木酚，组分II为槲皮苷。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所用乙醇是70 90%乙醇，优选80%乙醇。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，乙醇浸泡的时间是8-15小时，例如10-12小时。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，超声处理的时间是15-60min，优选20_45min,例如约 30min。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述HSCCC溶剂系统是正己烷乙酸乙酯甲醇水(I 4. 5 5. 5 0. 9 I. I 4. 5 5. 5)的混合物，在一个实施方案中，所述HSCCC溶剂系统是正己烷乙酸乙酯甲醇水(I : 5 : I : 5)的混合物。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，收集45 80min的流分，优选收集53 74min的流分。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述分离和收集的操作重复2 6次，优选重复3 5次，优选重复4次；并合并所收集的流分。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，所述两相溶剂系统的比例为3. 78 4. 62 0.72 0.88 5，优选所述两相溶剂系统的比例为4. 2 : 0. 8 : 5。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为0. 009 0. 011mol/L，优选为 0. 01mol/L。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，主机正转的转速为700 lOOOrpm，优选 800 900rpm,优选 860rpm。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，向管路泵入流动相的流速为I 3mL/min,优选 L 5 2. 5mL/min,优选约 2mL/min。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述检测波长为260 280nm，优选270 275nm，优选 272nm。本发明第二方面提供了一种监测头花寥制剂(例如热淋清颗粒制剂)质量的方法，该方法包括使用短叶苏木酚作为对照品，使用高效液相色谱法进行检测，测定该制剂中短叶苏木酚的含量、或者不同批次制剂中短叶苏木酚含量的变异、或者每批产品的测定值与均值之间差异。根据本发明第二方面的方法，其中所述的高效液相色谱法的色谱条件是使用C18色谱柱，流动相为甲醇和0.2%的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相(甲醇)的梯度比例如下5*% (Omin) 30% (5min) 65% (20min) 65% (24min) 5% (25min) 5%(30min)，检测波长为272nm。根据本发明第二方面的方法，其中所述的高效液相色谱法的色谱条件是使用固定相为 Venusil MP C18 色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 u m, Agela Technologie 公司)，流动相为甲醇和0. 2%的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相的梯度比例如下5% (Omin) 30%(5min) ~ 65% (20min) ~ 65% (24min) ~ 5% (25min) ~ 5% (30min);检测波长为 272nm， 流速为I. OmL/min,柱温为室温，进样量为20 y L。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。在本发明中，热淋清颗粒的原料可以是指以任何方法由中药材头花寥提取获得提取物，该提取物可用于制备热淋清颗粒剂。在一个实施方案中，热淋清颗粒的原料是指头花寥水提物。在一个实施方案中，头花寥水提物由如下制法得到的取头花寥加水煎煮二次，每次I. 5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，即得。本发明的目的在于探索热淋清颗粒质量控制的新方法。本发明人从热淋清颗粒的原料头花寥水提物粉末中，提取、分离并鉴定到一种新成分-短叶苏木酹(brevifolin),从而为热淋清颗粒的质量控制提供了新方案。在本发明的一个有益的方法中，应用高速逆流色谱法(high-speed counter-current chromatography, HSCCC)对头花寥水提粉末的乙酸乙酯粗提物进行第一步分离(溶剂系统为正己烷乙酸乙酯甲醇水=I : 5 : I : 5)，对所得的流分进行二次分离，(溶剂系统为乙酸乙酯正丁醇O.Olmol/L的磷酸氢二钾溶液4. 2 0.8 5)，上相为固定相，主机转速为860rpm，流速为2. OmL/min，检测波长为272nm，进样量为0. 25g。本发明某些实施方案可以得到纯度为96. 2%和98. 4%的两种产物，经结构鉴定分别为短叶苏木酹和槲皮苷(quercitrin)。其中短叶苏木酹为首次从该属植物中分离得到。本发明从头花寥水提粉末中提取分离到短叶苏木酚；使用的高速逆流色谱法简便、快速，适合于中药有效成分的研究和单体的提取制备。
图I描绘了头花寥二次分离原料物、HSCCC所得流分I和流分II进行HPLC检测的色谱图，三种物料所得图谱分别是图中的A、B、C。图2描绘了头花寥二次分离原料物的高速逆流色谱图
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。A、试验中使用到的一些仪器知材料Mk5Qui IkPr印500高速逆流色谱仪(英国AECS公司)，配有聚四氟乙烯管(PTFE)离柱(管直径2. 16mm,分离体积120mL, P值为0. 5 0. 8), SeriesII恒流泵(ScientificSystem公司)，STO-lOAvp紫外可见检测器(苏州岛津仪器公司)，N2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)。Watersl525高效液相色谱仪，Waters717型自动进样器，2996型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站(美国waters公司)。TSQ型三重四极杆液相色谱-串联质谱联用仪(美国San Jose公司)，FinniganSurveyor MS 泵、Finnigan Surveyor 自动进样器、Xcaliburl. 3 工作站、LC Quan 数据处理软件(美国Thermo Finnigan公司)。电恒温水浴锅(广东省汕头市医用设备厂)，SY-1000E多用途恒温超声提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)，DZF-6051SH型真空干燥箱(益恒实验仪器有限公司),AL204 型电子天平(瑞士 Metter Toledo 公司)，Dragon-med 移液枪(Toppette 公司)，RE-3000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Anke TGL-16B离心机(海安亭科学仪器厂)。 TENS0R37 红外光谱仪(德国 Bruker 公司),Bruker AvanceI 11400MHz 核磁共振仪(德国Bruker公司)，LCMS-IT-T0F高分辨质谱仪(日本岛津公司)。甲醇(色谱纯，TEDIA公司)，乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，正丁醇(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)，醋酸(分析纯，广州化学试剂厂)，磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)，超纯水(PureLab Ultra超纯水系统,英国ELGA公司)。头花寥水提物由贵州威门药业股份有限公司提供，并且是参照2010年版中国药典第992页“热淋清颗粒”项中的制法得到的，即取头花寥加水煎煮二次，每次I. 5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，即得，收率10. 07%。实施例I :头花蓼水提粉末乙酸乙酯耜提物的制备取头花寥水提粉末150g，用10倍量的80%乙醇浸泡过夜，超声萃取30min，过滤，将滤液用旋转蒸发仪蒸干，加入150mL水溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至上层无色。将乙酸乙酯层合并，用旋转蒸发仪蒸干，得到头花寥水提粉末乙酸乙酯粗提物(浸膏)12. 7g，密封于干燥器中备用。实施例2 :头花蓼二次分离原料物的制备称取实施例I所得乙酸乙酯浸膏I. 0g，利用HSCCC溶剂系统正己烷乙酸乙酯甲醇水(I : 5 : I : 5)进行分离，收集53min至74min的流分，重复该操作四次，将所收集的流分合并，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到头花寥二次分离原料物0. 25g。实施例3 :高效液相色谱法测定试验品的纯度
高效液相色谱条件固定相为Venusil MP C18色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 ii m, AgelaTechnologie公司)，流动相为甲醇和0. 2%的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相的梯度比例如下5*% (Omin) 30% (5min) 65% (20min) 65% (24min) 5% (25min) 5%(30min)。检测波长为272nm，流速为I. OmL/min,柱温为室温，进样量为20 u L。用干HPLC纯度测定的头花藜二次分离原料物供试液的制备取实施例I所得头花寥水二次分离原料物0. 0150g，加50%甲醇水定容于IOmL容量瓶中，配成浓度为I. 50mg/mL的溶液，超声30min,经0. 45 y m的微孔滤膜滤过,滤液备用。对上述头花寥二次分离原料物供试液，以及HSCCC所得各流分进行检测，其中产物的纯度按面积归一化法计算，分析的典型HPLC图见图I。图I中的图A显示的是头花寥二次分离原料物以上述HPLC法测试的HPLC图，图中显示I和II两个色谱峰，其分别对应于组分I和组分II。图I中的图B显示的是HSCCC中的流分I以上述HPLC法测试的HPLC图，图中基本上仅显示了组分I的峰。图I中的图C显示的是HSCCC中的流分II以上述HPLC法测试的HPLC图，图中基本上仅显示了组分II的峰。实施例4 :高速逆流色谱分离条件的选择根据高速逆流色谱溶剂系统选择的黄金规则和待分离物质的性质，本研究考察了多个溶剂系统，根据分配系数公式K = CU/CL(CU为上相中待分离物质的浓度，CL为下相中 待分离物质的浓度)计算其分配系数K，结果见表I。表I
权利要求
1.从热淋清颗粒的原料例如头花寥水提物中提取短叶苏木酚和/或槲皮苷的方法，该方法包括以下步骤 (1)取头花寥水提物，用60 95%乙醇浸泡5 24小时，超声处理10 120min，过滤，滤液蒸发干燥，残余物用水溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至上层无色，将乙酸乙酯层合并，蒸发干燥，得到乙酸乙酯粗提物； (2)将步骤(I)所得乙酸乙酯粗提物加载到高速逆流色谱仪(HSCCC)中，用正己烷乙酸乙酯甲醇水(I 4 6 O. 8 I. 2 4 6)的混合物作为HSCCC溶剂系统进行分离，收集40 90min的流分；必要时重复此分离和收集的操作；将所述流分蒸除溶剂，得到头花寥二次分离原料物； (3)在分液漏斗中，按乙酸乙酯正丁醇O.008 O. 012mol/L的磷酸氢二钾溶液=3.36 5. 04 O. 64 O. 96 5的比例(体积比)配置约1500mL的两相溶剂系统，静置分层成上相(固定相)和下相(流动相)，超声脱气； (4)采用单线圈、头接尾的洗脱方式，首先使管路充满固定相(上相)，主机正转，然后泵入流动相，待流动相流出，两相溶剂在柱中达到平衡状态时，取步骤(2)所得头花寥二次分离原料物，溶于等体积的上下相中，用注射器进样； (5)用紫外检测器对流分进行检测，检测波长为250 290nm，同时记录色谱图，根据色谱图用流分收集器自动收集流分，每3min收集一管；分离时间在270min以上； (6)收集30 40min之间出峰的流分作为流分I，200 260min之间出峰的流分作为流分II ; (7)分别除去流分I和流分II的溶剂，流分I和流分II分别相应地得到组分I和组分II，任选地分别对组分I和组分I进一步精制，组分I为短叶苏木酚，组分II为槲皮苷。
2.根据权利要求I的方法，其中步骤(I)中，所用乙醇是70 90%乙醇。
3.根据权利要求I的方法，其中步骤⑴中，乙醇浸泡的时间是8-15小时。
4.根据权利要求I的方法，其中步骤(I)中，超声处理的时间是15-60min。
5.根据权利要求I的方法，其中步骤(2)中，所述HSCCC溶剂系统是正己烷乙酸乙酉旨甲醇水(I 4. 5 5. 5 O. 9 I. I 4. 5 5. 5)的混合物。
6.根据权利要求I的方法，其中步骤(2)中，收集45 80min的流分。
7.根据权利要求I的方法，其中步骤(3)中，所述两相溶剂系统的比例为3.78 4.62 O. 72 O. 88 5。
8.根据权利要求I的方法，其中步骤(3)中，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为O.009 O.011mol/L。
9.根据权利要求I的方法，其中步骤(4)中，主机正转的转速为700 lOOOrpm。
10.根据权利要求I的方法，其中步骤(4)中，向管路泵入流动相的流速为I 3mL/min0
11.根据权利要求I的方法，其中步骤(5)中，所述检测波长为260 280nm。
12.监测头花寥制剂例如热淋清颗粒制剂质量的方法，该方法包括使用短叶苏木酚作为对照品，使用高效液相色谱法进行检测，测定该制剂中短叶苏木酚的含量、或者不同批次制剂中短叶苏木酚含量的变异、或者每批产品的测定值与均值之间差异。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的高效液相色谱法的色谱条件是使用C18色谱柱，流动相为甲醇和O. 2%的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相(甲醇)的梯度比例如下5% (Omin) 30% (5min) 65% (20min) 65% (24min) 5% (25min) 5% (30min),检测波长为272nm。
14.根据权利要求12的方法，其中所述的高效液相色谱法的色谱条件是使用固定相为 Venusil MP C18色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m, AgelaTechnologie 公司)，流动相为甲醇和 .0.2%的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相的梯度比例如下5% (Omin) 30% (5min) .65% (20min) 65% (24min) 5% (25min) 5% (30min);检测波长为 272nm，流速为.1.OmL/min,柱温为室温，进样量为20 μ L。
全文摘要
本发明涉及从热淋清颗粒的原料例如头花蓼水提物中提取短叶苏木酚和/或槲皮苷的方法，还涉及使用短叶苏木酚对热淋清颗粒制剂进行质量监控的方法。本发明提取短叶苏木酚和/或槲皮苷的方法中使用高速逆流色谱仪(HSCCC)并且使用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶4～6∶0.8～1.2∶4～6)的混合物作为HSCCC溶剂系统进行分离。本发明以高纯度和高收率从热淋清颗粒的原料中获得短叶苏木酚，并且该成分可作为监控头花蓼制剂例如热淋清颗粒质量的方法中使用的对照品。
文档编号C07H17/07GK102659549SQ201210092489
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者万金志, 刘培庆, 唐靖雯, 张丽艳, 李孟林, 梁斌, 谢宇, 陈欣霞, 黄民 申请人:中山大学, 贵州威门药业股份有限公司