口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中化学成分测定的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法，含量测定方法是采用高效液相色谱质谱联用检测方法，在所建立的检测方法下对口服热淋清颗粒后尿液和粪便中两种成分没食子酸和原儿茶酸进行含量测定。本发明含量测定方法的精密度高，重现性好，稳定性好，测定结果准确，可对有效评价热淋清颗粒中的没食子酸和原儿茶酸在生物体内的排泄情况。
【专利说明】口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中化学成分测定
【技术领域】
[0001] 本发明属于中成药体内代谢研究【技术领域】，具体涉及及一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法。
【背景技术】
[0002]热淋清颗粒是以苗药头花寥为原料制成的单方制剂，收载于《中国药典》2010版。具清热解毒、利尿通淋的功效。用于湿热蕴结，小便黄赤，淋漓涩痛之症，尿路感染，肾盂肾炎见上述证候者。对泌尿系统感染具有确切的疗效。“热淋清颗粒”为国家中药保护品种、国家社保药物，并为唯一进入2010版《中国药典》的苗药，获国家发改委单独定价权。
[0003]根据文献报道，热淋清颗粒中主要的化学成分为酚酸类化合物和黄酮类化合物。现热淋清颗粒收载于《中国药典》2010版，该标准【含量测定】项以没食子酸为指标成分。为明确热淋清颗粒中中主要有效成分在体内的代谢过程，必须建立合理的尿液和粪便中热淋清颗粒主要有效成分的含量测定方法，以利于有效评价热淋清颗粒主要有效成分的排泄情况，为热淋清颗粒的更深入开发提供依据。
[0004]本发明以热淋清颗粒中的主要化学成分没食子酸和原儿茶酸为指标，建立了大鼠尿液和粪便中没食子酸和原儿茶酸的含量测定方法，并用该方法对大鼠口服热淋清颗粒后没食子酸和原儿茶酸在尿液和粪便中的排泄情况进行了研究。
[0005]通过文献发现，目前对于没食子酸在动物体内的排泄研究都是在对其代谢产物的定性研究，而关于其在尿液和粪便中含量测定方法研究未见文献报道。对于原儿茶酸的排泄研究，有文献(黄勇等，UPLC-ES1-MS/MS法研究注射用复方荭草在大鼠体内的排泄，中成药，2012)对其在尿液中的含量测定方法进行了研究，但对其在粪便中的含量测定方法文献中没有描述。本发明所建立的尿液中原儿茶酸含量测定方法与文献的区别在于以下两个方面:
[0006](I)在尿液样品处理方法上，文献采用的是直接沉淀蛋白法，而本发明对直接沉淀蛋白和液液萃取两种方法进行了比较，发现液液萃取提取效果较好，峰形较好，无基质干扰(见表2)。
[0007](2)在线性范围方面，文献中的线性范围是31~7470ng/mL，而本发明是10~1000ng/mL，可以看出本方法的定量限更低，相对文献而言，能更客观地反应原儿茶酸在大鼠尿液中的排泄情况。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于:提供一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法。本发明通过对口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分没食子酸及原儿茶酸进行含量测定研究，为研究热淋清颗粒中没食子酸及原儿茶酸的排泄过程提供依据。
[0009]本发明是这样实现的:[0010]提供一种大鼠口服热淋清颗粒后尿液和粪便中两种成分的测定方法，其包括以下步骤:
[0011](I)尿液测试样品的制备:
[0012](a)取热淋清颗粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg ；
[0013](b)分别在O?48h采集大鼠尿液，记录尿量，将尿液样品3000?5000r/min转速离心5?30min后，取上层液转移至新空白EP管中；
[0014](c)加入内标岩白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液与乙酸乙酯的体积比为1:4?1:8，萃取时间2?5min，涡旋混匀30?60s后，在O?10°C恒温下以10000?12000r/min 离心 5 ?15min ；
[0015](d)上层液转移至新空白EP管中，于30?50°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，润旋混勻30?60s后,在O?10°C恒温下以10000?12000r/min离心5?15min,取上清液即为尿液供试品溶液；
[0016](e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的空白尿液进行处理，得到尿液空白溶液；
[0017](2)粪便测试样品的制备:
[0018](a)取热淋清颗粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg ；
[0019](b)分别收集48h内大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，将样品3000?5000r/min转速离心5?30min后，取上层液转移至新空白EP
管中；
[0020](c)加入内标岩白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液与乙酸乙酯的体积比为1:4?1:8，萃取时间2?5min，涡旋混匀30?60s后，在O?10°C恒温下以10000?12000r/min 离心 5 ?15min ；
[0021](d)上层液转移至新空白EP管中，于30?50°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，润旋混勻30?60s后,在O?10°C恒温下以10000?12000r/min离心5?15min,取上清液即为粪便供试品溶液；
[0022](e)按步骤(b)至步骤⑷的方法对未服用药物的空白粪便进行处理，得到粪便空白溶液；
[0023](f)对照品溶液的制备:分别精密称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01?Img,各自加纯甲醇定容至IOml,即得三种母液,分别取三种母液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至所需浓度，即为对照品溶液；
[0024](3) LC-MS/MS分析的色谱条件和检测条件:
[0025]色谱柱为反相色谱柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O?20:80?100 (体积比)为流动相，流速为0.1?0.5mL/min,柱温为20?40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000?3000V，雾化温度为300?500°C，鞘气压力为30?50mTorr，辅助气压力为5?15mTorr，毛细管温度为200?400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.05%?0.5 %，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合);
[0026](4)测定法:分别精密吸取对照品溶液、尿液空白溶液、粪便空白溶液、尿液供试品溶液、粪便供试品溶液5?20 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
[0027]根据本发明的方法，其中步骤(I)之(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4ml。
[0028]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4ml。
[0029]根据本发明的方法，其中步骤⑴之(b)中，分别在2h，12h，24h后采集大鼠尿液。
[0030]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(b)中，分别在24h、48h后采集大鼠粪便。
[0031]根据本发明的方法，其中步骤(I)之(b)中，将尿液样品于低速离心机4000r/min离心IOmin0
[0032]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(b)中，将尿液样品于低速离心机4000r/min离心IOmin0
[0033]根据本发明的方法，其中步骤(I)之(C)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%?2%酸，例如添加0.5%?1%酸。在一个实施方案中，所述的酸选自甲酸、乙酸及其组合。在一个实施方案中，所述的酸是甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸。
[0034]根据本发明的方法，其中步骤⑵之(C)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%?2%酸，例如添加0.5%?1%酸。在一个实施方案中，所述的酸选自甲酸、乙酸及其组合。在一个实施方案中，所述的酸是甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸。
[0035]根据本发明的方法，其中步骤⑴之(C)中，尿液与乙酸乙酯(优选地该乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸)的体积比为1:6，萃取时间4min。
[0036]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(C)中，尿液与乙酸乙酯(优选地该乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸)的体积比为1:6，萃取时间4min。
[0037]根据本发明的方法，其中步骤(I)之(C)中，萃取后涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速 12000r/min,离心 lOmin。
[0038]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(C)中，萃取后涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速 12000r/min,离心 lOmin。
[0039]根据本发明的方法，其中口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中检测的两种成分是没食子酸和原儿茶酸。
[0040]根据本发明的方法，其中步骤(I)之(d)中，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干。
[0041]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(d)中，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干。
[0042]根据本发明的方法，其中步骤(I)之(d)中，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混勻 60s 后 12000r/min, 4°C恒温,离心 IOmin0
[0043]根据本发明的方法，其中步骤(2)之(d)中，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混勻 60s 后 12000r/min, 4°C恒温,离心 IOmin0
[0044]根据本发明的方法，其中步骤(3)中，色谱柱为C18色谱柱。
[0045]根据本发明的方法，其中步骤(3)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.1%。
[0046]根据本发明的方法，其中步骤(3)中,流速为0.2ml/min，柱温为30°C。
[0047]根据本发明的方法，其中步骤(3)中，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr，毛细管温度为300°C。
[0048]根据本发明的方法，其中步骤(3)中，使用梯度洗脱，洗脱液的变化为:开始时，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%，稳定3min ;接着至第IOmin时，酸性乙腈相线性增加至10%，酸性水溶液相90% ;第10.1min时，酸性乙腈相改为2 %，酸性水溶液相98%，稳定7min。
[0049]根据本发明的方法，其中步骤(4)中，各溶液的进样量均为10yL。
[0050]根据本发明的方法，其中尿液供试品溶液包括以下操作步骤:取热淋清颗粒0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4mL，分别在2h，12h，24h后采集大鼠尿液，将尿液于低速离心机4000r/min离心IOmin后，取上层液体转移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min，涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心lOmin，重复3次，合并上清液，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心IOmin后取10 μ L进样，空白尿液按同样方法处理。
[0051]根据本发明的方法，其中粪便供试品溶液包括以下操作步骤:取热淋清颗粒
0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4mL，分别在24h、48h采集大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，于低速离心机4000r/min离心IOmin后,取上层液体转移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min，涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心lOmin，重复3次，合并上清液，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心IOmin后取10 μ L进样，空白粪便按同样方法处理。
[0052]根据本发明的方法，以上处理好的样品，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行:
[0053]色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1% )水=O?20:80?100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.2mL.min—1，柱温为30°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为300°C ；
[0054]对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品
0.01?lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10mL，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
[0055]测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
[0056]前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的变化为:开始时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定3min ;第IOmin时，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定7min。
[0057]前述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(Tube Lens Offset) 71V，碰撞压力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原儿茶酸 I52.918 — 109.244,补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(CollisionPressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,内标 326.922 — 192.167,补偿电压(Tube Lens Offset) 100V,碰撞压力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0058]根据本发明的方法，其基本上是提供了一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法，其特征在于:
[0059]取热淋 清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别在O~48h，采集大鼠尿液，将大鼠尿液样品3000~5000r/min转速离心5~30min后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10μ L,然后按1:4~1:8体积比乙酸乙酯萃取,萃取时间2~5min,润旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温,离心5~15min,上层液转移至新空白EP管中，重复萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有机相，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，润旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温,离心5~15min后取5~20 μ L进样,空白尿液按同样方法处理；
[0060]取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别收集48h大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.1~Ig样品加入5~10倍量水制成混悬液，3000~5000r/min转速离心5~30min后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ L，然后按1:4~1:8体积比乙酸乙酯萃取，萃取时间2~5min,润旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温，离心5~15min，上层液转移至新空白EP管中，重复萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有机相，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温,离心5~15min后取5~20 μ L进样，空白粪便按同样方法处理；
[0061]以上处理好的样品，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行:
[0062]色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸或乙酸0.05^^0.5%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5%)水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.1~0.5mL/min,柱温为20~40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000~3000V，雾化温度为300~500°C，鞘气压力为30~50mTorr，辅助气压力为5~15mTorr，毛细管温度为200~400°C ；
[0063]对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10mL，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
[0064]根据本发明的方法，其特征在于尿液和粪便样品按以下步骤操作:
[0065]取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别在O~48h采集大鼠尿液，记录尿量，将尿液样品4000r/min转速离心10min后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ L，然后按1:4体积比用乙酸乙酯萃取，萃取时间5min，涡旋混匀后12000r/min离心5min,上层液转移至新空白EP管中，重复3次，于40°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，4°C恒温，12000r/min离心10min后取10 μ L进样，空白尿液按同样方法处理；
[0066]取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别收集48h内大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，将样品4000r/min转速离心IOmin后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ L，然后按1:4体积比用乙酸乙酯萃取，萃取时间5min，涡旋混匀后12000r/min离心5min，上层液转移至新空白EP管中，重复3次，于40°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，4°C恒温，12000r/min离心IOmin后取10 μ L进样，空白粪便按同样方法处理。
[0067]根据本发明的方法，其特征在于色谱柱规格为2.1 X 150mm，填料粒径为1.7μπι，以甲酸0.1 %乙腈Α:甲酸0.1 %水B为流动相，按以下条件梯度洗脱:0?3min2%A, 3.0 ?3.1min2% A—10% A, 3.I ?10.0minl0% A, 10.0 ?10.1minl0% -2% A, 10.1 ?17.0min2% A。
[0068]根据本发明的方法，其特征在于质谱喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为350°C。
[0069]根据本发明的方法，其特征在于:质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为:没食子酸 169.181 — 125.268，原儿茶酸 152.918 — 109.244，内标 326.922 — 192.167。
[0070]以下是本发明人对口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定进行研究的过程:
[0071]一、口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定
[0072]本发明人对于有关热淋清颗粒及其原料药的文献进行了大量的研究，而且根据发明人所在课题组前期对头花寥展开的化学成分分析研究发现，没食子酸和原儿茶酸为头花寥中的生物活性成分，因此选取热淋清颗粒中的没食子酸和原儿茶酸为指标进行了 口服热淋清颗粒后大鼠尿液中和粪便中两种成分的确定研究。
[0073]取热淋清颗粒0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4mL，分别分别在2h，12h，24h后采集大鼠尿液，将尿液于低速离心机4000r/min离心IOmin后,取上层液体转移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min,润旋均勻30s后4°C恒温离心,转速12000r/min,离心IOmin,重复3次，合并上清液，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混勻60s后12000r/min,4°C恒温,离心IOmin后取10 μ L进样，空白尿液按同样方法处理。
[0074]取热淋清颗粒0.5?4g用5?10倍水溶解，配成水溶液，通过灌胃给药方式给大鼠(230?270g)热淋清颗粒水溶液2?4mL，分别在给药后24h、48h收集大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，将粪便于低速离心机4000r/min离心IOmin后，取上层液体转移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min，涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心lOmin，重复3次，合并上清液，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心IOmin后取10 μ L进样，空白粪便按同样方法处理。
[0075]以上处理好的样品，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行:
[0076]色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1 % )水=O?20:80?100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.2mL/min,柱温为30°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为300°C ；
[0077]对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01?lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10mL，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
[0078]测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
[0079]前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的变化为:开始时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定3min ;第IOmin时，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定7min。
[0080]前述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181 — 125.268，补偿电压(Tube Lens Offset) 71V，碰撞压力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原儿茶酸 I52.918 — 109.244,补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(CollisionPressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,内标 326.922 — 192.167,补偿电压(Tube Lens Offset) 100V,碰撞压力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0081]测定结果如图1-7所示，从图可以看出，没食子酸和原儿茶酸为口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中存在的化学成分。
[0082]二、口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中没食子酸和原儿茶酸的含量测定方法的
建立
[0083]1、仪器与试药
[0084]TSQ Quantum超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，包括:三重四级杆质量分析器,ESI离子源,Xcalibur工作站,液相部分为Thermo Accela UPLC,包括:Accela PDA检测器，Accela自动进样器，ACCelal250输液泵(美国赛默飞世尔科技有限公司)、十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、KQ5200E型超声波清洗(昆明市超声仪器有限公司)。
[0085]乙腈(色谱纯，美国“天地”试剂公司)、甲醇(色谱纯，美国“天地”试剂公司)；水(重蒸水，临用前制备)；甲酸(色谱纯，美国Roe Scientific公司)、乙酸(色谱纯，美国 Roe Scientific 公司)；
[0086]没食子酸、原儿茶酸及岩白菜素对照品(中国药品生物制品检定所提供)。
[0087]2、仪器操作条件
[0088]液相色谱条件:PhenomenexKinetexXB_C18 色谱柱(2.1 X 150mm, 1.7 μ m),流动相A为乙腈(含0.1 %甲酸)，B为水(含0.1%甲酸)，梯度洗脱:0?3min2%A，3.0?
3.1min2 % A—10 % A, 3.I ?10.0minlO % A, 10.0 ?10.1minlO % -2 % A, 10.1 ?17.0min2% A，流速 0.2mL/min，进样量为 5 μ L,
[0089]质谱条件:采用ESI离子源；负离子检出模式；扫描方式为多反应监测方式(MRM);用于定量分析的监测离子见表I。离子源参数:鞘气流速:40Arb，辅助气流速:IOArb ;毛细管温度:350°C ;毛细管电压:30V ;雾化温度为350°C ;喷雾电压:2500V ;扫描频率:0.1s。[0090]表1以SRM模式优化GA、PA、内标(IS)形成稳定子离子所需碰撞能量
[0091]
【权利要求】
1.大鼠口服热淋清颗粒后尿液和粪便中两种成分的测定方法，其包括以下步骤: (1)尿液测试样品的制备: (a)取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg ； (b)分别在O~48h采集大鼠尿液，记录尿量，将尿液样品3000~5000r/min转速离心5~30min后，取上层液转移至新空白EP管中； (c)加入内标岩白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液与乙酸乙酯的体积比为1:4~1:8，萃取时间2~5min,润旋混匀30~60s后，在O~10°C恒温下以10000~12000r/min 离心 5 ~15min ； (d)上层液转移至新空白EP管中，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100μ L流动相溶解，润旋混匀30~60s后，在O~10°C恒温下以10000~12000r/min离心5~15min,取上清液即为尿液供试品溶液； (e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的空白尿液进行处理，得到尿液空白溶液； (2)粪便测试样品的制备: (a)取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg ； (b)分别收集48h内大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，将样品3000~5000r/min转速离心5~30min后，取上层液转移至新空白EP管中； (c)加入内标岩白菜素母液IOyL,然后用乙酸乙酯萃取，尿液与乙酸乙酯的体积比为1:4~1:8，萃取时间2~5min,润旋混匀30~60s后，在O~10°C恒温下以10000~12000r/min 离心 5 ~15min ； (d)上层液转移至新空白EP管中，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100μ L流动相溶解，润旋混匀30~60s后,在O~10°C恒温下以10000~12000r/min离心5~15min,取上清液即为粪便供试品溶液； (e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的空白粪便进行处理，得到粪便空白溶液； (f)对照品溶液的制备:分别精密称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~Img,各自加纯甲醇定容至IOml,即得三种母液,分别取三种母液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至所需浓度，即为对照品溶液； (3)LC-MS/MS分析的色谱条件和检测条件: 色谱柱为反相色谱柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，流速为0.1~0.5mL/min，柱温为20~40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000~3000V，雾化温度为300~500°C，鞘气压力为30~50mTorr，辅助气压力为5~15mTorr，毛细管温度为200~400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.05^-0.5%,所述酸选自甲酸、乙酸或其组合); (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液、尿液空白溶液、粪便空白溶液、尿液供试品溶液、粪便供试品溶液5~20 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
2.根据权利要求1的方法，其中: 步骤(1)之(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4m I ； 步骤(2)之(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4m I ； 步骤(1)之(b)中，分别在2h，12h，24h后采集大鼠尿液； 步骤⑵之(b)中，分别在24h、48h后采集大鼠粪便； 步骤(1)之(b)中，将尿液样品于低速离心机4000r/min离心10min ;和/或 步骤⑵之(b)中，将尿液样品于低速离心机4000r/min离心10min。
3.根据权利要求1的方法，其中: 步骤⑴之(c)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%~2%酸，例如添加0.5%~1%酸；例如，所述的酸选自甲酸、乙酸 及其组合；例如，所述的酸是甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸； 步骤⑵之(c)中，所述乙酸乙酯中添加0.2%~2%酸，例如添加0.5%~1%酸；例如，所述的酸选自甲酸、乙酸及其组合；例如，所述的酸是甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸； 步骤⑴之(c)中，尿液与乙酸乙酯(优选地该乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸)的体积比为1:6，萃取时间4min ； 步骤⑵之(c)中，尿液与乙酸乙酯(优选地该乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸)的体积比为1:6，萃取时间4min ； 步骤(1)之(c)中，萃取后涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心10min ；和/或 步骤(2)之(c)中，萃取后涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心10min。
4.根据权利要求1的方法，其中: 口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中检测的两种成分是没食子酸和原儿茶酸； 步骤(1)之(d)中，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干； 步骤(2)之(d)中，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干； 步骤⑴之⑷中，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心10min ;和/或 步骤⑵之⑷中，残留物用100 μ I流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min，4°C恒温，离心10min0
5.根据权利要求1的方法，其中: 步骤(3)中，色谱柱为C18色谱柱； 步骤(3)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.1% ； 步骤⑶中，流速为0.2ml/min，柱温为30°C ； 步骤(3)中，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为300°C ； 步骤(3)中，使用梯度洗脱，洗脱液的变化为:开始时，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%,稳定3min ;接着至第IOmin时,酸性乙腈相线性增加至10%,酸性水溶液相90% ;第.10.1min时，酸性乙腈相改为2%，酸性水溶液相98%，稳定7min ； 步骤(4)中，各溶液的进样量均为10 μ L。
6.根据权利要求1的方法，其中: 尿液供试品溶液包括以下操作步骤:取热淋清颗粒0.5~4g用5~10倍水溶解,配成水溶液，通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4mL，分别在2h，12h, 24h后采集大鼠尿液,将尿液于低速离心机4000r/min离心10min后,取上层液体转移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min，涡旋均匀30s后4°C恒温离心，转速12000r/min，离心10min，重复3次，合并上清液，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min, 4°C恒温，离心10min后取10 μ L进样，空白尿液按同样方法处理；和/或 粪便供试品溶液包括以下操作步骤:取热淋清颗粒0.5~4g用5~10倍水溶解，配成水溶液，通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4mL，分别在24h、48h采集大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，于低速离心机4000r/min离心10min后,取上层液体转移至新的空白EP管中，用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min,润旋均匀30s后4°C恒温离心,转速12000r/min,离心10min,重复3次，合并上清液，将上层清液于氮吹仪于40°C吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀60s后12000r/min,4°C恒温,离心10min后取10 μ L进样,空白粪便按同样方法处理。
7.根据权利要求1的方法，其中: 处理好的样品，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行: 色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸0.1%)乙腈:酸性(甲酸.0.1% )水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.2mL.min—1，柱温为30°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为IOmTorr,毛细管温度为300°C ； 对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~lmg，精密称定，加纯甲醇定容至10mL，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得； 前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的变化为:开始时，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，稳定3min ;第IOmin时，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min时，甲酸乙腈相2 %，甲酸水溶液相98 %，稳定7min ； 前述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸 169.181 — 125.268，补偿电压(Tube Lens Offset) 71V，碰撞压力(CollisionPressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原儿茶酸 152.918 — 109.244,补偿电压(Tube Lens Offset) 75V,碰撞压力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV，内标 326.922 — 192.167，补偿电压(Tube Lens Offset) 100V,碰撞压力(Collision Pressure) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV0
8.根据权利要求1的方法，其中: 取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别在O~48h，采集大鼠尿液，将大鼠尿液样品3000~5000r/min转速离心5~30min后,取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ L,然后按1:4~1:8体积比乙酸乙酯萃取,萃取时间2~5min,润旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温,离心5~15min,上层液转移至新空白EP管中，重复萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有机相，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min，O~10°C恒温，离心5~15min后取5~20 μ L进样，空白尿液按同样方法处理； 取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别收集48h大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.1~Ig样品加入5~10倍量水制成混悬液，3000~5000r/min转速离心5~30min后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素IOyL,然后按1:4~1:8体积比乙酸乙酯萃取，萃取时间2~5min,润旋混匀30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒温，离心5~15min,上层液转移至新空白EP管中，重复萃取I~3次，合并乙酸乙酯部分有机相，于30~50°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min，O~10°C恒温,离心5~15min后取5~20 μ L进样,空白粪便按同样方法处理； 以上处理好的样品，采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行: 色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (体积比)为流动相，梯度洗脱，流速为0.1~0.5 mL/min,柱温为20~40°C，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000~3000V，雾化温度为300~500°C，鞘气压力为30~50mTorr，辅助气压力为5~15mTorr，毛细管温度为200~400°C ； 对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~lmg，精密称定，加纯甲 醇定容至10mL，即得母液，工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。
9.根据权利要求1的方法，其中: 取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别在O~48h采集大鼠尿液，记录尿量，将尿液样品4000r/min转速离心10min后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10yL，然后按1: 4体积比用乙酸乙酯萃取,萃取时间5min,润旋混匀后12000r/min离心5min,上层液转移至新空白EP管中，重复3次，于40°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，4°C恒温，12000r/min离心10min后取10 μ L进样,空白尿液按同样方法处理； 取热淋清颗粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg，分别收集48h内大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，将样品4000r/min转速离心10min后，取上层液体转移至新空白EP管中，加入内标岩白菜素10 μ L，然后按1:4体积比用乙酸乙酯萃取，萃取时间5min，涡旋混匀后12000r/min离心5min，上层液转移至新空白EP管中，重复3次，于40°C氮气流吹干，残留物用100 μ L流动相溶解，4°C恒温，12000r/min离心10min后取10μ L进样，空白粪便按同样方法处理。
10.根据权利要求1的方法，其中: 所述色谱柱规格为2.1 X 150mm,填料粒径为1.7 μ m ; 以甲酸0.1 %乙腈A:甲酸0.1 %水B为流动相，按以下条件梯度洗脱:0~3min2%A, 3.0 ~3.lmin2% A—10% A, 3.1 ~10.0minl0% A, 10.0 ~10.1minl0% -2% A, 10.1 ~。17.0min2% A ； 所述质谱喷雾电压为2500V，雾化温度为350°C，鞘气压力为40mTorr，辅助气压力为.1OmTorr,毛细管温度为350°C ； 所述质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为:没食子酸169.181 — 125.268，原儿茶酸 152.918 — 109.244，内标 326.922 — 192.167。
【文档编号】G01N30/88GK103983750SQ201410249780
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】周欣, 龚小见, 陈华国, 马风伟, 赵杨, 梁斌, 杨槐, 张丽艳 申请人:贵州威门药业股份有限公司