自供能量的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种自供能量的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法。本发明提供的制备方法，包括如下步骤：(1)利用激酶制备激酶球；(2)按照如下1)或2)的步骤分别制备激酶球-微管复合物或激酶球-驱动蛋白复合物；(3)按照如下1)或2)的步骤即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系；1)将所述激酶球-微管复合物、酪蛋白和驱动蛋白进行混合即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系；2)将激酶球-驱动蛋白复合物和微管进行混合即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系。本发明的微管-驱动蛋白运输体系能够自供给能量，无需额外加入ATP，尤其有利于封闭的纳米器件体系。
【专利说明】自供能量的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种自供能量的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法。
【背景技术】
[0002]生命在于运动，机体的一切活动，从肌肉收缩、细胞内部的物质运输、遗传物质(DNA)的复制、一直到细胞的分裂等，追踪到分子水平，都是源于具有马达功能的蛋白质大分子做功推动的结果，因此它们称为分子马达或马达蛋白。在目前马达蛋白的研究中，以驱动蛋白(kinesin)的研究最为广泛。kinesin以ATP为能量来源,沿着微管(microtubule)运动。鉴于这种马达分子运动的强健性和高效性，在构筑微米或纳米级尺度上的活性仿生体系时，驱动蛋白kinesin成为一种理想的驱动部件，吸引了越来越多科学家的兴趣。最近的研究把它们成功地应用到了一些体外人造的器件中，并实现了它们在体外作为纳米机器人的构想。例如微管装载微球的运动、表面成像、分子自组装、生物传感器、操纵DNA链段以及蛋白组装体的粒度分选等。在这些纳米器件的构筑中，能量ATP的供给是至关重要的。一些研究者通过紫外光、电场或微流控技术等，成功实现了 kinesin-microtubule运输体系中ATP的供给,但是紫外光和电场会对kinesin和microtubule蛋白造成损伤,活性降低，并且不能实现能量的持续供给；而微流控技术则需要反复更换ATP缓冲液来实现能量的持续供给，操作步骤繁琐。更值得一提的是，由于kinesin运动的同时将ATP转化成ADP，体系中的ADP的浓度逐渐升高，对kinesin的活性有抑制的作用。因此，随着ATP的消耗，体系中的ADP的浓度越来越高,kinesin在microtubule表面的运动速度越来越低,运动长度也减少。因此，需要制备一种ATP再生系统，缓冲ATP的浓度，保证ATP的浓度在一定的范围内，从而为kinesin-microtubule运输体系持续提供能量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种自供能量的微管-驱动蛋白运输体系及其制备方法，本发明运输体系可将体系中产生的ADP转化成ATP，实现ATP的再生，从而缓冲ATP的浓度，保证ATP的持续供给。
[0004]本发明所提供的自供能量的微管-驱动蛋白运输体系的制备方法，包括如下步骤:
[0005](I)利用激酶制备激酶球，所述激酶球为激酶微米球或激酶纳米球；
[0006](2)按照如下I)或2)的步骤分别制备激酶球-微管复合物或激酶球-驱动蛋白复合物:
[0007]I)将所述激酶球分散到链霉亲和素的水溶液中进行吸附，得到链霉亲和素修饰的激酶球，将所述链霉亲和素修饰的激酶球分散到生物素修饰的微管水溶液中，即得到所述激酶球-微管复合物；
[0008]2)将所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl缓冲溶液中，静置后继续加入至驱动蛋白的水溶液中，即得到所述激酶球-驱动蛋白复合物；[0009](3)按照如下I)或2)的步骤即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系；
[0010]I)将所述激酶球-微管复合物、酪蛋白和驱动蛋白(kinesin)进行混合即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系；
[0011]2)将所述激酶球-驱动蛋白复合物和微管进行混合即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系。
[0012]2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述激酶微米球的粒径为4~Iym,具体可为 l~3.6ym、lym、2ymj|^3.6ym;
[0013]所述激酶纳米球的粒径为800~200nm。
[0014]上述的制备方法中，步骤(1)中，可利用模板法、共沉淀法、层层自组装、乳液法或盐析法制备所述激酶球；
[0015]所述激酶可为肌酸激酶、丙酮酸激酶或磷酸甘油酸激酶，可以催化ADP和相应底物产生ATP的酶。
[0016]上述的制备方法中，步骤(1)中，在制备所述激酶球的过程中添加聚电解质、蛋白质、多糖、药物或次氮基三乙酸，从而装载不同的物质。
[0017]上述的制备方法中，步骤(1)中，在所述激酶球的表面连接聚电解质、蛋白质、多糖、药物或次氮基三乙酸。 [0018]上述的制备方法中，所述生物素修饰的微管为购自Cytoskeleton有限公司的商品目录号分别为T333P的商品。
[0019]上述的制备方法中，步骤(2)1)中，在将所述激酶球分散到链霉亲和素的水溶液中进行吸附之前，所述方法还包括将激酶球分散到聚烯丙基铵盐酸盐水溶液中的步骤。
[0020]上述的制备方法中，步骤(2)2)中，在将所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl缓冲溶液中之前，所述方法还包括将所述激酶球分散到聚烯丙基铵盐酸盐水溶液中的步骤。
[0021]本发明还进一步提供了由上述方法制备得到的自供能量的微管-驱动蛋白运输体系，所述微管-驱动蛋白运输体系还包括激酶底物和ADP。
[0022]在本发明提供的自供能量的微管-驱动蛋白运输体系中，所述激酶球与所述微管或所述驱动蛋白通过静电作用、共价键、氢键或其他特异性识别作用连接在一起，形成复合物。
[0023]本发明具有如下优点:
[0024](I)本发明的微管-驱动蛋白运输体系能够自供给能量，无需额外加入ATP，尤其有利于封闭的纳米器件体系。
[0025](2)本发明中的激酶球不仅可以为微管-驱动蛋白运输体系持续提供能量，还能作为载体运输不同的物质。
[0026](3)本发明中的微管-驱动蛋白运输体系能够实现局部控制(即只有在有激酶球的区域，微管可以运动，没有激酶球的区域，微管不能运动)微管-驱动蛋白运输体系。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为本发明实施例1制备的肌酸激酶微球的扫描电子显微图(图1 (a))和激光共聚焦显微图(图1(b))。[0028]图2为实施例1中MT-CPK微球复合物在kinesin修饰的表面上滑动时，ATP浓度随时间变化曲线图。
[0029]图3为实施例1中MT-CPK微球复合物在kinesin修饰的表面上滑动时，微管运动的速度-时间关系曲线。
[0030]图4为实施例1制备的微管-肌酸激酶微球复合物在驱动蛋白修饰的表面上运动的激光共聚焦显微图。
【具体实施方式】
[0031 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]下述实施例中，所用的流体池是按照如下方法制备的:
[0034]普通流体池由载玻片，盖玻片和双面胶组成(Scotch3M，0.1mm厚)。载玻片和盖玻片先在饱和KOH溶液中超声IOmin,然后用乙醇和去离子水清洗,再用液氮吹干。如无特殊说明，实验用的都是普通流体池。
[0035]硅烷化的流体池的制备方法与以上面制备普通流体池的方法一样，只是需要预先将载玻片和盖玻片进行硅烷化处理。制备氨基硅烷化的盖玻片:将20μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷(5wt%)的丙酮溶液滴加在干净的载玻片上，立即加盖另一个干净的载玻片。5min后，清水冲洗载玻片，液氮吹干载玻片。这样就得到了两片氨基硅烷化的盖玻片。用上述2片盖玻片制备流体池。
[0036]下述实施例中，所用的罗丹明标记的生物素修饰的微管的制备方法为:罗丹明标记的微管、生物素修饰的微管和未修饰的微管(体积比1:1:2)混合好后分散于4mMMgCl2、ImM GTP (三磷酸鸟苷)和5wt% DMSO的BRB80缓冲液中，总蛋白浓度为2.5mg/ml ;然后放入370C的水浴中孵育30min后，加入4 μ L的含20 μ M taxol (紫杉醇)的BRB80缓冲液中，即可得到罗丹明标记的生物素修饰的微管。
[0037]其中，罗丹明标记的微管、生物素修饰的微管和未修饰的微管均购自Cytoskeleton有限公司，商品目录号分别为TL590M、T333P和TL238。
[0038]下述实施例中，所用的驱动蛋白是按照如下方法制备的:全长黑腹果蝇C端组氨酸标记的kinesin重链以及轻链的kinesin质粒在大肠杆菌Escherichia coli (购自于中美泰和生物技术有限公司)中表达。然后用镍一氨基三乙酸琼脂糖树脂(nickel-nitrilotriacetic acid agarose resin, N1-NTA)柱和憐酸纤维素柱提纯表达的蛋白。
[0039]实施例1、制备微管-驱动蛋白运输体系
[0040](I)制备肌酸激酶(CPK)微球
[0041 ] 取Na2CO3水液和CPK水溶液于圆底烧瓶中，随后一次性快速加入等体积的CaCl2水溶液于烧瓶中，立即搅拌20s，静置约2min，取沉淀物离心，3次水洗，得到CPK微球。
[0042]上述制备的CPK微球的扫描电子显微图如图1(a)所示，激光共聚焦显微图如图1 (b)所示，由该图可知，本实施例制备的CPK微球的粒径为3.6 μ m。
[0043](2)制备微管-肌酸激酶(MT-CPK)微球复合物
[0044]将步骤(I)制备的肌酸激酶微球分散到聚烯丙基铵盐酸盐(PAH)水溶液中，吸附30min后，离心，水洗三次。再将得到的微球分散到50 μ M链霉亲和素的水溶液中，吸附30min，离心，水洗三次。将链霉亲和素修饰的肌酸激酶微球分散液逐滴加入到罗丹明标记的生物素修饰的微管水溶液中，室温下轻摇30min，得到MT-CPK微球复合物。
[0045](3)MT-CPK微球复合物在kinesin修饰的表面上的滑动
[0046]首先，将酪蛋白(lmg/mL)溶液注入流体池中，吸附5min。然后将kinesin水溶液(20nM)注入流体池中，吸附5min。
[0047]然后，在MT-CPK微球复合物的分散液中添加ADP、磷酸肌酸(CP)和除氧剂，除氧剂中各成分的浓度为:20mM的葡萄糖、0.02mg/mL的葡萄糖氧化酶、0.008mg/mL的过氧化氢酶和0.5wt% β -巯基乙醇。将上述分散液缓慢注入流体池中。
[0048]将流体池用硅胶密封起来，移至共聚焦显微镜下观察。记录下MT-CPK微球复合物随时间的运动图像，如图4所示，由该图可知，随着时间的推移，MT-CPK微球复合物可以成功地在kinesin修饰的表面上滑动，滑动速度为62nm/s。
[0049]上述运动过程中，ATP浓度随时间的变化曲线如图2所示，由该图可知，随着反应时间的增加，ATP的浓度逐渐增多。
[0050]上述运动过程中，微管运动的速度与时间的关系曲线如图3所示，由该图可知，随着反应时间的增加，微管在kinesin修饰的表面上的滑动速度越来越快，也证明了随着反应时间的增加，ATP浓度也在增加。
[0051]实施例2、制备微管-驱动蛋白运输体系
[0052]本实施例的步骤和参数与实施例1中基本相同，区别在于:在制备肌酸激酶微球时，在Na2CO3水溶液或CaCl2水溶液中加入了药物模型(异硫氰酸荧光素_葡聚糖(FITC-Dextran))，共沉淀得到了肌酸激酶-药物复合微球。因此，本实施例中制备的复合微球不仅可以为微管-驱动蛋白运输体系持续提供ATP，还能作为载体运输药物或其他物质。
[0053]实施例3、制备微管-驱动蛋白运输体系
[0054](I)制备丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)微胶囊
[0055]首先，将粒径为2 μ m的碳酸锰粒子分散到含有0.1M氯化钠的PAH溶液中，振荡吸附30min后，离心分离，充分洗涤后，再分散到含有0.1M氯化钠的4mg/mL PK的Tris-HCl缓冲溶液(pH = 7.5)中吸附30min，离心分离，水洗3次。至此完成一个组装周期。依次重复吸附PAH、PK的操作，直到所需的层数。其中作为模板的碳酸锰粒子可以用0.1M的乙二胺四乙酸二钠盐溶液溶除。最后将组装好的微胶囊离心、洗涤3次后，得到(PAH/PK)nPAH微胶囊，粒径为2 μ m。
[0056](2)制备微管-丙酮酸激酶(MT-PK)微胶囊复合物
[0057]将得到的(PAH/PK)nPAH微胶囊分散到50 μ M链霉亲和素的水溶液中，吸附30min，离心，水洗三次。将链霉亲和素修饰的(PAH/PK)nPAH微胶囊分散液逐滴加入到罗丹明标记的生物素修饰的微管溶液中，室温下轻摇30min，得到MT-PK微胶囊复合物。
[0058](3)MT-PK微胶囊复合物在kinesin修饰的表面上的滑动
[0059]首先，将酪蛋白(lmg/mL)溶液注入流体池中，吸附5min。然后将kinesin溶液(20nM)注入流体池中，吸附5min。在MT-PK微胶囊复合物的分散液中添加ADP、磷酸烯醇式丙酮酸和除氧剂，除氧剂的各成分的浓度为:20mM的葡萄糖、0.02mg/mL的葡萄糖氧化酶、0.008mg/mL的过氧化氢酶和0.5wt% β-巯基乙醇。将上述分散液缓慢注入流体池中。
[0060]将流体池用硅胶密封起来，移至共聚焦显微镜下观察。记录下MT-PK微胶囊复合物随时间的运动图像，由图像可观察到随着时间的推移，MT-PK微胶囊复合物成功地在kinesin修饰的表面上滑动，滑动速度为87nm/s。
[0061]实施例4、制备微管-驱动蛋白运输体系
[0062](I)制备磷酸甘油酸激酶(PGK)微球
[0063]取Na2CO3水溶液和PGK水溶液于圆底烧瓶中，随后一次性快速加入与Na2CO3水溶液和PGK水溶液等体积的CaCl2水溶液于烧瓶中，立即搅拌30s，静置约2min，取沉淀物离心，多次水洗，得到PGK微球，粒径为I μ m。
[0064](2)制备驱动蛋白-磷酸甘油酸激酶(Kinesin-PGK)微球复合物
[0065]将磷酸甘油酸激酶微球分散到聚烯丙基铵盐酸盐(PAH)溶液中，吸附30min后，离心，水洗三次。再将得到的微球分散到2mg/mL酪蛋白溶液的Tris-HCl缓冲溶液(pH =
7.2)中吸附30min，混合均匀，放在冰上静置30min。之后加入同体积的40nMkinesin溶液，充分混合，在冰上静置30min，得到Kinesin-PGK微球复合物。
[0066](3) Kinesin-PGK微球复合物在微管修饰的表面上的运动
[0067]向硅烷化的流体池中持续引入100μ I微管溶液，静置15min。然后注入酪蛋白(0.5mg/ml)溶液，中和未连接微管的氨基功能团。在Kinesin-PGK微球复合物的分散液中加入添加ADP、1，3- 二磷酸甘油酸和除氧剂，除氧剂各组分的浓度为:20mM的葡萄糖、
0.02mg/mL的葡萄糖氧化酶、0.008mg/mL的过氧化氢酶和0.5wt% β -巯基乙醇。将上述分散液缓慢注入流体池中。
[0068]将流体池用娃胶密封起来,移至共聚焦显微镜下观察并记录。记录下Kinesin-PGK微球复合物随时间的运动图像，由图像可观察到，随着时间的推移，Kinesin-PGK微球复合物成功地在固定好的微管阵列上运动，运动速度为103nm/s。
【权利要求】
1.一种自供能量的微管-驱动蛋白运输体系的制备方法，包括如下步骤: (1)利用激酶制备激酶球，所述激酶球为激酶微米球或激酶纳米球； (2)按照如下I)或2)的步骤分别制备激酶球-微管复合物或激酶球-驱动蛋白复合物: 1)将所述激酶球分散到链霉亲和素的水溶液中进行吸附，得到链霉亲和素修饰的激酶球，将所述链霉亲和素修饰的激酶球分散到生物素修饰的微管水溶液中，即得到所述激酶球-微管复合物； 2)将所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl缓冲溶液中，静置后继续加入至驱动蛋白的水溶液中，即得到所述激酶球-驱动蛋白复合物； (3)按照如下I)或2)的步骤即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系； 1)将所述激酶球-微管复合物、酪蛋白和驱动蛋白进行混合即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系； 2)将所述激酶球-驱动蛋白复合物和微管进行混合即得到所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述激酶微米球的粒径为4~Iμ m ; 所述激酶纳米球的粒径 为800~200nm。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，利用模板法、共沉淀法、层层自组装、乳液法或盐析法制备所述激酶球； 所述激酶为肌酸激酶、丙酮酸激酶或磷酸甘油酸激酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，在制备所述激酶球的过程中添加聚电解质、蛋白质、多糖、药物或次氮基三乙酸。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤⑴中，在所述激酶球的表面连接聚电解质、蛋白质、多糖、药物或次氮基三乙酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)I)中，在将所述激酶球分散到链霉亲和素的水溶液中进行吸附之前，所述方法还包括将激酶球分散到聚烯丙基铵盐酸盐水溶液中的步骤。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)2)中，在将所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl缓冲溶液中之前，所述方法还包括将所述激酶球分散到聚烯丙基铵盐酸盐水溶液中的步骤。
8.权利要求1-8中任一项所述方法制备的自供能量的微管-驱动蛋白运输体系。
9.权利要求8所述自供能量的微管-驱动蛋白运输体系在制备纳米器件中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104020298SQ201410261964
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】李峻柏, 贾怡, 李洁龄, 冯熙云, 董伟光 申请人:中国科学院化学研究所