一种基于dna酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法
【专利摘要】一种基于DNA酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法，本发明属于分析化学和DNA生物传感器【技术领域】，涉及一种基于类过氧化物酶链G-DNA修饰电极在双氧水体系中催化氧化1-萘酚并实现对1-萘酚的检测。具体的以金电极为载基，将巯基修饰的含G结构的DNA修饰到电极表面，并将其浸没到含K+及hemin溶液的体系中使其形成具有类过氧化物酶催化活性的G-DNA结构，通过在电极表面催化双氧水氧化1-萘酚引起的阻抗变化从而实现对1-萘酚的检测。该电化学DNA生物传感器制备方法简单，检测周期短，响应时间快，稳定性好且具有高灵敏等优点。
【专利说明】-种基于DNA酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学和DNA生物传感器【技术领域】，涉及一种类过氧化物酶链 G-DNA修饰的电化学生物传感器催化双氧水氧化1-萘酚及对1-萘酚的检测方法，此方法能 快速实现对水中1-萘酚的检测。
【背景技术】
[0002] 多环芳煙（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)由于其典型的"致癌"、"致 畸"和"致突变"作用而引起人们的极大关注。萘作为挥发性最高的PAHs，无论是在一般人 群还是在职业暴露环境人群中的浓度均高于其它PAHs。萘进入人体后会在体内的酶的活化 作用下代谢为1-萘酚，研究发现1-萘酚的细胞毒性要比萘更强，在体内会引起DNA突变， 诱发癌症等恶性疾病，对人类的健康危害极大。在工业上，1-萘酚用途非常广泛，是合成医 药、染料、香料、合成橡胶抗氧剂、农药的原料，还是西维因农药的水解产物。进入环境中的 1-萘酚会对环境造成污染，是一类重要的环境污染物，因此也是灌溉水、自来水和井水环境 监测的重要项目。到目前为止，用于1-萘酚的分析检测方法有很多种，如红外光谱法、双波 长紫外分光光度法、直接荧光光度法、毛细管区带电泳法、共振光散射法、催化光度法、示差 脉冲伏安法、固相微萃取-气相色谱法、高效液相色谱法、免疫检测法等，这些传统的萘酚 检测方法存在仪器设备昂贵、需专业技术人员操作、操作费时、样本需要衍生处理和不能实 现在线监测等缺陷，因此建立检测1-萘酚新方法有着重要的现实意义。
[0003] 随着电化学技术和生物传感技术的发展，DNA生物传感器作为一种新型的检测技 术越来越多的应用于检测环境污染物，如Yang等采用酸变性单链DNA修饰的玻碳电极实现 了 1-萘酚的检测，这种基于鸟嘌呤氧化电流为信号的DNA生物传感器对1-萘酚具有较高 的灵敏性。但是到目前为止，应用DNA生物传感器对萘酚的检测还比较少，其检测的基础主 要是基于DNA与萘酚分子间的非特异性相互作用，因此开发具有特殊结构DNA的生物传感 器实现对1-萘酚检测具有十分重要的意义。研究发现，G-DNA是一类特殊的富含鸟嘌呤（G) 的DNA片段，与hemin作用后形成的G-DNA结构具有类过氧化物酶的催化活性，该G-DNA结 构具有催化双氧水的特性，且响应时间快，专一性高。基于G-DNA的这一特性，Liu课题组 通过设计含G-DNA序列的凝血酶及ATP的适体链，在凝血酶及ATP小分子诱导下形成G-DNA 结构，根据G-DNA催化双氧水的还原电流而实现了对凝血酶及ATP的检测。但是到目前为 止，应用G-DNA催化双氧水氧化的作用对1-萘酚化合物的检测还未见报道，而与DNA修饰 固体电极式传感器方法相比，此法检测的响应速度明显提高。
[0004] 综上所述，建立、完善和发展1-萘酚污染物的分析方法是分析化学和环境化学的 热点研究课题，具有重要的研究意义。同时开发一种新的高灵敏、低成本的检测方法对完善 现有检测技术手段亦具有重要意义和较好的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于DNA酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种基于DNA酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法，包括以下步骤：
[0008] 1)电极的预处理与活化：
[0009] 将直径为1mm的金电极在鹿皮抛光布上用直径为0. 05?2 μ m的骨状α -A1203抛 光至镜面，抛光后洗去表面污物，并依次在乙醇和超纯水中超声清洗，每次2?3min，重复 三次；然后在〇. 1?2. Omol/L H2S04溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用超纯水冲洗干 净，氮气吹干，得到表面干净的金电极；
[0010] 2) G-DNA溶液的配制：
[0011] 将固体G-DNA序列用5?50mM Tris-NaC104缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混匀，静 置于室温下4h备用；
[0012] 3) G-DNA修饰电极的制备：
[0013] 将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的G-DNA溶液中，静置 于室温下。巯基修饰的G-DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，从而得到G-DNA修饰 电极。
[0014] 4)酶活性G-DNA修饰电极的制备：
[0015] 将上述步骤3)制备的G-DNA修饰的金电极依次浸泡在Tris-NaC104缓冲溶液配制 的KC10 4、hemin溶液中各lh，从而得到具有类过氧化物酶催化活性的G-DNA酶修饰电极。
[0016] 优选地，上述步骤2)中所述G-DNA序列中形成G-DNA结构部分的碱基数为17。
[0017] 优选地，上述步骤2)中所述G-DNA浓度为1-10 μ M。
[0018] 优选地，上述步骤4)中所述Κ+浓度为2-40mM。
[0019] 优选地，上述步骤4)中所述hemin浓度为1-20 μ Μ。
[0020] 本发明中，所使用的G-DNA序列是本领域人员所熟悉的，其获得可以通过供应商 获得。
[0021] 本发明的另一方面，涉及应用如上述制备方法得到的G-DNA修饰电极对1-萘酚 的检测方法，其具体检测方法为：以钼丝电极为对电极，银/氯化银（饱和KC1溶液）为 参比电极，以G-DNA修饰的金电极为工作电极构筑三电极体系，先将G-DNA修饰电极在 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用Tris-NaC10 4缓冲溶液淋 洗，然后置于缓冲溶液配制的不同浓度的含过氧化氢的1-萘酚溶液中，再进行电化学阻抗 测定，比较作用前后阻抗值的变化。
[0022] 与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0023] 1.本发明所采用的G-DNA修饰电极，与传统的酶修饰电极相比具有成本较低的优 势；
[0024] 2.本发明所采用的G-DNA修饰电极是通过金-硫键作用将G-DNA自组装于金电极 表面，与传统的酶修饰电极相比具有稳定性高的优势；
[0025] 3.本发明所采用的G-DNA修饰电极具有高催化活性、高专一性的优点；
[0026] 4.本发明所制备的G-DNA修饰电极对1-萘酚的检测具有灵敏性高、响应速度快等 特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为金电极及G-DNA修饰的金电极的阻抗谱图；
[0028] 图2为使用本发明的G-DNA修饰电极分别与K+、hemin、lmMl-萘酚作用前后的尼 奎斯特阻抗谱图：G-DNA膜（〇），与K+作用（·）；与hemin作用（?);与1-萘酚作用 ();其中，横坐标代表电化学阻抗的实部（电阻），单位为Ω μπι2,纵坐标代表电化学阻 抗的虚部（电容），单位为Ω · cm2 ;
【具体实施方式】
[0029] 以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。
[0030] 实施例1
[0031] 1)将金电极在鹿皮抛光布上用0. 05 μ m的α -A1203粉末抛光至镜面，抛光后先洗 去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2?3min，重复三次；然后在lmol/ L H2S04溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面 干净的金电极；
[0032] 2)将活化处理的金电极浸泡在预先配制的1 μ Μ的G-DNA溶液中，静置于室温下 3-5天，即得到G-DNA修饰电极；
[0033] 3)将G-DNA修饰电极浸泡在Tris-NaC104缓冲溶液（20mM，pH = 7. 4)配制的20mM 的KC104、1 μ Μ的hemin溶液中各lh，得到具有酶催化活性的G-DNA修饰电极
[0034] 实施例2
[0035] 将制备的G-DNA修饰电极依次浸泡在Tris-NaC104缓冲溶液配制的KC10 4、hemin 溶液中各lh得到的具有酶催化活性的G-DNA修饰电极作为工作电极，以Ag/AgCl (饱和 KC1溶液）电极为参比电极，钼电极为对电极构筑三电极体系，应用PARSTAT2273电化学综 合测试系统对 Tris_NaC104 配制的浓度分别为 5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、 150]11]1〇1/]^、200111]1〇1凡及500111]1〇1凡的1-萘酚溶液中（含双氧水浓度为5以]\{)分别进行电 化学阻抗测定。
[0036] 表1G-DNA修饰电极与1-萘酚作用后的电化学阻抗变化（Λ Rct)
[0037]
【权利要求】
1. 一种基于DNA酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 电极的预处理与活化： 将直径为1mm的金电极在鹿皮抛光布上用直径为〇. 05?2 μ m的骨状α -A1203抛光至 镜面，抛光后洗去表面污物，并依次在乙醇和超纯水中超声清洗，每次2?3min，重复三次； 然后在0. 1?2. Omol/L H2S04溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用超纯水冲洗干净，氮气 吹干，得到表面干净的金电极； 2. G-DNA溶液的配制： 将固体G-DNA序列用5?50mM Tris-NaC104缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混勻，静置于 室温下4h备用； 3. G-DNA修饰电极的制备： 将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的G-DNA溶液中，静置于室 温下。巯基修饰的G-DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，从而得到G-DNA酶修饰电 极。 4) 酶活性G-DNA修饰电极的制备： 将上述步骤3)制备的G-DNA修饰的金电极依次浸泡在Tris-NaC104缓冲溶液配制的 KC104、hemin溶液中各lh，从而得到具有类过氧化物酶催化活性的G-DNA修饰电极。
2. 根据权利要求1所述的一种基于DNA酶催化作用的1-萘酚电化学测定方法，其特征 在于：所述Tris-NaC104缓冲溶液中KC10 4浓度为2?20mM，hemin浓度为1?50 μ M。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所使用的G-DNA为5'端含双硫 修饰的共26个碱基的单链DNA序列，共包含两部分：靠近G-DNA的5'端1?9的胸腺嘧 啶碱基为柔性间隔基团及可以形成G-DNA结构的10?26碱基部分。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述G-DNA的浓度为1?10 μ M。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：G-DNA的部分碱基数目为17。
6. -种应用如权利要求1-4中任一项所述制备方法得到的G-DNA修饰电极对1-萘 酚检测的方法，其特征在于具体步骤为：以钼丝电极为对电极，银/氯化银（饱和KC1溶 液）为参比电极，以G-DNA修饰金电极为工作电极构筑三电极体系，先将G-DNA修饰电极在 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用Tris-NaC10 4缓冲溶液淋 洗，然后置于缓冲溶液配制的不同浓度梯度的含过氧化氢的1-萘酚溶液中20min，然后再 进行电化学阻抗测定，比较作用前后阻抗值的变化。
7. 如权利要求6所述的G-DNA修饰的金电极在水中对1-萘酚的检测。
【文档编号】G01N27/327GK104062333SQ201410323752
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】刘新会, 梁刚, 巩文雯, 王娟, 刘冠男, 成登苗, 梁宝翠 申请人:北京师范大学