一种基于脂质体信号放大的超敏c-反应蛋白检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括R1试剂、R2试剂和校准品；所述R1试剂为甘氨酸缓冲体系；所述R2试剂为CRP抗体致敏颗粒悬浮液；所述校准品含6支CRP的重组蛋白浓度不同、溶质及其含量均相同的牛血清基质。本发明的试剂盒是一种利用乳胶增强免疫比浊法的试剂盒，CRP抗体通过化学键结合于脂质体表面。与现有市售产品相比，本发明超敏C-反应蛋白检测试剂盒具有更高灵敏度、更宽的线性。
【专利说明】一种基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，具体涉及 一种以脂质体为信号放大载体的CRP检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 超敏 C 反应蛋白（hypersensitive3C_reactive protein，hs-CRP)是血楽中的一 种C反应蛋白。C反应蛋白是由肝脏合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物， 是心血管事件危险最强有力的预测因子之一。hs-CRP超敏C反应蛋白是区分低水平炎症状 态的灵敏指标，血清hs-CRP水平与动脉粥样硬化及急性脑梗死（ACI)的发生、严重程度及 预后密切相关。临床实验室通过超敏感检测技术，准确的检测低浓度C反应蛋白，提高了试 验的灵敏度和准确度。近年来，随着检测技术的进步，大量的文章研究显示，它在冠心病、中 风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用。
[0003] CRP在健康的人体中只含有微量，在新的刺激出现前，其浓度可保持长期稳定，半 衰期长（约18?20小时），且不受性别、食物或昼夜的影响。当出现感染性疾病，血清中 CRP在感染发生后5?8小时即开始升高，48小时达到峰值，且高峰值可达正常的数百倍。 随着感染控制，它可在24?48小时迅速下降，1周内恢复正常。CRP的水平和持续时间与 感染程度呈正相关，当CRP持续升高或再度升高时，提示临床应重视病情的变化。
[0004] 有研究显示，在急性脑梗死老年患者中，CRP升高者预后不佳；hs-CRP含量与梗死 面积、神经功能缺损程度相关，是脑梗死患者病变程度的指标之一；而且CRP也参与了血栓 形成和动脉硬化的病理过程，是脑卒中的危险因素之一。动脉粥样硬化斑块的炎症反应是 斑块破裂和不稳定的重要原因，在动脉粥样硬化斑块的形成过程中，CRP补体复合物和泡 沫细胞等沉积在动脉壁内，CRP可与脂蛋白结合，激活补体系统，产生大量炎症介质，释放氧 自由基，造成血管内膜损伤，血管痉挛及不稳定斑块脱落，加重动脉粥样硬化所致的管腔狭 窄以及ACI的发生。越来越多的证据表明，低水平CRP与心血管疾病的其他危险因素密切 相关，如高血压、高脂血症；同时CRP升高可增加高血压患者心脏病、脑卒中的发病率；因此 CRP是与动脉粥样硬化发生、演变和发展都有关的促炎因子。流行病学调查也显示，hs-CRP 水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍，发生心肌梗死的几率是正常者的 3倍。2003年欧洲高血压防治指南（ESH/ESC)正式推荐，高血压患者需检测hs-CRP水平。
[0005] 超敏C反应蛋白的临床指导作用主要表现在对心血管疾病，新生儿细菌感染，肾 移植等方面。
[0006] 目前，市场上的CRP检测试剂盒，存在着灵敏度低，线性范围窄，本底高的缺点。这 主要是因为CRP检测试剂需要同时具备较高的灵敏度和线性范围，常规的乳胶增强免疫比 浊法采用聚苯乙烯微球包被，由于聚苯乙烯微球为乳白色不透明小球，光透过性比较差，因 此具有很难同时保证同时具备高灵敏度和线性。而脂质体作为均相的小球，具有透明度高， 与抗体结合力强，制备简易等优点。但是目前国内还没有有关采用脂质体作为免疫比浊法 信号放大系统的报道。本发明国内首次采用透明的脂质体作为抗体包被载体具有本底低、 抗体包被率高的优点，采用脂质体作为包被载体具有高灵敏度和高线性特点。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于脂质体信号放大的超敏 C-反应蛋白（hs-CRP)检测试剂盒，建立一种胶乳增强比浊法来测定人体血清中CRP的含量 的方法，运用该方法的试剂应具有操作简单，准确度高，重复性好，灵敏度高，且能够在全自 动生化分析仪或者特种蛋白仪以及分光光度计上使用。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明提供一种基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白（hs-CRP)检测试剂盒， 包括R1试剂、R2试剂和校准品；
[0010] 所述R1试剂为甘氨酸缓冲体系；
[0011] 所述R2试剂为基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒悬浮液；所述脂质体为磷脂酰 胆碱与合成磷脂的1 : (1?20)混合物；所述合成磷脂由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷 脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种合成；
[0012] 所述校准品含6支CRP的重组蛋白浓度不同、溶质及其含量均相同的牛血清基质。
[0013] 优选地，所述甘氨酸缓冲体系，溶剂为10?50mM、pH6. 0?6. 5甘氨酸缓冲液，溶 质及其在所述甘氨酸缓冲体系中的含量为NaCl 200?400mM，Tween20 0. 5?1. 5ml/L， EDTA 100 ?200mM，加速剂 200 ?500mM，防腐剂 0· 1 ?2%〇。
[0014] 优选地，所述加速剂包括葡聚糖系列、PEG系列、PVP系列中的一种；更优选地，所 述加速剂为葡聚糖系列。
[0015] 优选地，所述防腐剂包括叠氮化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proclin-300、苯 酚中的一种或多种。
[0016] 优选地，所述CRP抗体致敏颗粒悬浮液，溶剂为10?50mM、pH6. 0?6. 5的甘氨酸 缓冲液，溶质及其在悬浮液中的含量为：基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒10?50mg/ L，乙二胺四乙酸二钠0· 5?5mmol/L，牛血清白蛋白（BSA)O. 1?4mg/L、NaN3 0· 1?2%〇 ; 所述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒中CRP抗体通过化学键结合于脂质体表面。
[0017] 优选地，所述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒悬浮液的制备方法为：将表 面带有化学基的150?300nm的脂质体与抗人CRP抗体以10 : 1.5的质量比混合，溶 于0. 02M、pH5. 0?6. 0的磷酸缓冲液，脂质体的体积百分比为0. 1?1. 5%，抗体的浓度 为10mg/L ;室温孵育半小时，再加入活化剂溶液活化，使活化剂在反应体系中的浓度达到 50?100 μ g/ml ;混合均匀，37°C结合8小时；透析除去未连接上的抗体，加入封闭液封闭2 小时，离心去上清，用PH6. 0?6. 5的含有0. 5?5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0. 1?4%牛 血清白蛋白（BSA)、0. 1?2% NaN3的甘氨酸缓冲液稀释；所述封闭液为含0. 1%牛血清白 蛋白的pH7. 4的M0PS0缓冲液。
[0018] 优选地，所述化学基包括羧基、羟基、氨基、磺酸基基团中的一种或几种。
[0019] 优选地，所述抗人CRP抗体为羊抗人CRP抗体、兔抗人CRP抗体、鼠抗人CRP抗体 中的一种或多种。
[0020] 优选地，所述活化的过程具体为：100ml 1 %浓度脂质体中，分别加入0. 15?1ml 戊二醛以及30mg活化剂，室温振荡1小时，透析除去多余的戊二醛和活化剂。
[0021] 优选地，所述活化剂包括碳化二亚胺（EDC)、EDCV (sulfo)NHS、Ν，Ν' -羰基二咪唑 (CDI)、对甲苯磺酰氯、溴化氰、Ν，Ν' -二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC)、双环氧基化合物、硼氢 化氰中的一种或多种。
[0022] 优选地，所述校准品中CRP的重组蛋白浓度不同具体是指CRP的重组蛋白在校准 品中的浓度分别为 Omg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml、160mg/ml、320mg/ml。
[0023] 优选地，所述校准品中的溶质及其在所述校准品中的体积含量为叠氮钠0. 2? 2. 2%。、吐温-20 1?10%、牛血清白蛋白（BSA)l?3%。
[0024] 脂质体（liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏 水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25?lOOOnrn不等。在碳二亚 胺的作用下，脂质体外层表面的羧基活化，活化后的羧基与蛋白通过形成酰胺而偶联。国 内试剂通常采用白色不透明的纳米乳胶微球包被抗体，纳米微球越大试剂的灵敏度就会越 高，但是同时，试剂透光性就会越差，造成了试剂本底越高，极大的受到了检测仪器的限制。 而采用脂质体具有透光性高的优点，因而可以使用直径比较大的脂质体进行包被。达到了 提1?灵敏度而不提1?试剂本底的有益效果。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0026] (1)本发明是一种基于脂质体信号放大的检测试剂盒，在保证高灵敏度的基础上， 明显扩大了检测线性范围，实现了 C反应蛋白检测试剂盒在高灵敏度和宽线性范围的统 一，符合hs-CRP临床测量的要求；
[0027] (2)微球偶联CRP多克隆抗体制备乳胶微球增强免疫比浊试剂，存在本底偏高，检 测灵敏度差的缺点，无法同时测定高浓度和低浓度水平下的CRP含量，而本发明将透明的 表面羧基化的150?300nm的脂质体与抗人CRP抗体通过化学交联制得R2试剂悬浮溶液， 攻克了试剂本底过高，检测灵敏度不够的难题；
[0028] (4)本发明采用脂质体包被CRP单克隆抗体，通过优化溶剂、溶质种类及含量，可 使包被率达95%以上，保证了抗体稳定性和试剂盒灵敏度，这是现有技术无法比拟的；
[0029] (5)本发明采用天然脂质体与合成脂质体混合制备包被CRP单克隆抗体，增强抗 体与载体的亲和性能、增加脂质体之间的动态平衡、增加包埋率，同时增强试剂盒试剂天然 属性，使其在检测样品中与样品不产生排斥，使得检测结果更准确。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0031] 图1为显示6种不同含量的hs-CRP参考标准的标准曲线；
[0032] 其中，每个点代表不同含量hs-CRP的参考标准，X轴表示hs-CRP的含量，Y轴表示 吸光度；
[0033] 图2为对本试剂盒的线性范围进行验证；
[0034] 其中，X轴表示的是本发明试剂实际测试结果，Y轴表示的是稀释理论浓度，相关 系数为 R2 = 〇· 9996,回归方程为 y = 1. 0218X+0. 6204。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0036] 实施例1
[0037] 本实施例涉及一种超敏C-反应蛋白（hs-CRP)检测试剂盒，其制备如下：
[0038] 试剂 R1 :
[0039]
【权利要求】
1. 一种基于脂质体信号放大的超敏c-反应蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括R1试 齐[J、R2试剂和校准品； 所述R1试剂为甘氨酸缓冲体系； 所述R2试剂为基于脂质体包被的CRP抗体致敏颗粒悬浮液；所述脂质体为磷脂酰胆碱 与合成磷脂的1: (1?20)混合物；所述合成磷脂由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰 乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种合成； 所述校准品含6支CRP的重组蛋白浓度不同、溶质及其含量均相同的牛血清基质。
2. 根据权利要求1所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特 征在于，所述甘氨酸缓冲体系，溶剂为10?50mM、pH6. 0?6. 5甘氨酸缓冲液，溶质及其在 所述甘氨酸缓冲体系中的含量为NaCl 200?400mM，Tween20 0. 5?1. 5ml/L，EDTA100? 200mM，加速剂200?500mM，防腐剂(λ 1?2%〇。
3. 根据权利要求2所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特 征在于，所述加速剂包括匍聚糖系列、PEG系列、PVP系列中的一种；所述防腐剂包括置氣化 钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proc 1 in-300、苯酚中的一种或多种。
4. 根据权利要求1所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特征 在于，所述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒悬浮液，溶剂为10?50mM、pH6. 0?6. 5的 甘氨酸缓冲液，溶质及其在悬浮液中的含量为：基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒10? 50mg/L，乙二胺四乙酸二钠0. 5?5mmol/L，牛血清白蛋白0. 1?4mg/L、NaN30. 1?2%。;所 述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒中CRP抗体通过化学键结合于脂质体表面。
5. 根据权利要求1所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特征 在于，所述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒悬浮液的制备方法为：将表面带有化学基 的150?300nm的脂质体与抗人CRP抗体以10 : 1. 5的质量比混合，溶于0. 02M、pH5. 0? 6. 0的磷酸缓冲液，脂质体的体积百分比为0. 1?1. 5%，抗体的浓度为10mg/L ;室温孵育 半小时，再加入活化剂溶液活化，使活化剂在反应体系中的浓度达到50?100 μ g/mL ;混合 均匀，37°C结合8小时；透析除去未连接上的抗体，加入封闭液封闭2小时，离心去上清，用 pH6. 0?6. 5的含有0. 5?5mmol/L乙二胺四乙酸二纳、0. 1?4 %牛血清白蛋白、0. 1? 2% NaN3的甘氨酸缓冲液稀释；所述封闭液为含0. 1 %牛血清白蛋白的pH7. 4的M0PS0缓冲 液。
6. 根据权利要求5所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特征 在于，所述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒悬浮液的制备方法中化学基包括羧基、羟 基、氨基、磺酸基基团中的一种或几种。
7. 根据权利要求5所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特征 在于，所述抗人CRP抗体包括羊抗人CRP抗体、兔抗人CRP抗体、鼠抗人CRP抗体中的一种 或多种。
8. 根据权利要求5所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特 征在于，所述基于脂质体包括的CRP抗体致敏颗粒悬浮液的制备方法中活化过程具体为： lOOmll %浓度脂质体中，分别加入0. 15?lml戊二醛以及30mg活化剂，室温振荡1小时， 透析除去多余的戊二醛和活化剂。
9. 根据权利要求5或8所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其 特征在于，所述活化剂为碳化二亚胺、EDty (sulfo) NHS、Ν，Ν' -羰基二咪唑、对甲苯磺酰氯、 溴化氰、Ν，Ν' -二琥珀酰亚胺基碳酸酯、双环氧基化合物、硼氢化氰中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的基于脂质体信号放大的超敏C-反应蛋白检测试剂盒，其特 征在于，所述校准品中CRP的重组蛋白浓度不同具体是指CRP的重组蛋白在校准品中的浓 度分别为 〇mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml、160mg/ml、320mg/ml ;所述校准品中的溶质 及其在所述校准品中的体积含量为叠氮钠0. 2?2. 2%。、吐温-201?10%、牛血清白蛋白 1 ?3%。
【文档编号】G01N33/531GK104215771SQ201410401483
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】李伟奇, 赵小凤, 房君江, 张秀文, 林清玉 申请人:上海睿康生物科技有限公司