以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法
【专利摘要】本发明提高了一种以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，包括以下步骤：种植玉米、高粱、小麦和水稻，取发育不同天数的颖果进行实验；体式显微镜观察颖果的大小、形态与色泽变化，并观察胚乳组织的位置与分布变化；荧光显微镜观察颖果不同组织的荧光特性，分析其成分；光镜观察颖果与胚乳组织发育的显微结构变化；扫描电镜观察细胞壁、淀粉体、蛋白体和糊粉粒的立体形态结构与分布；透射电镜观察细胞内亚细胞结构的特征与变化。本发明以四种主要谷物为实验材料，通过各种形态学观察技术分析并探明谷物胚乳的发育全过程，揭示了胚乳在颖果发育中的重要作用，且通过比较不同谷物胚乳的结构性差异来为谷物进化提供重要的资料。
【专利说明】以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物科学与农业科学理论与【技术领域】，是一套切实可行的植物形态学研究方案。
【背景技术】
[0002]形态学观察技术是植物学、动物学及医学等领域非常重要的研究手段，国内比较常见的有体式显微镜观察、荧光显微镜观察、光镜观察、扫描电镜观察与透射电镜观察等。但是，国内能综合利用这几种观察技术对特殊植物组织进行层次分明、逻辑严密的深入探究的几乎是凤毛麟角。
[0003]玉米、高粱、小麦和水稻是四种主要谷物，它们的颖果被广泛用于人类食物、禽畜饲料和工业原料。胚乳是谷物颖果内重要的养分运输与贮藏组织，对颖果的发育具有重要的作用。然而，如今对胚乳发育的研究并不深入，特别是胚乳的分化过程。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，以四种主要谷物为实验材料，通过各种形态学观察技术分析并探明谷物胚乳的发育全过程，揭示了胚乳在颖果发育中的重要作用，且通过比较不同谷物胚乳的结构性差异来为谷物进化提供重要的资料。
[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0006]一种以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，包括以下步骤:
[0007](I)种植玉米、高粱、小麦和水稻，取发育不同天数的颖果进行实验；
[0008](2)体式显微镜观察颖果的大小、形态与色泽变化，并观察胚乳组织的位置与分布变化；
[0009](3)荧光显微镜观察颖果不同组织的荧光特性，分析其成分；
[0010](4)光镜观察颖果与胚乳组织发育的显微结构变化；
[0011](5)扫描电镜观察细胞壁、淀粉体、蛋白体和糊粉粒的立体形态结构与分布；
[0012](6)透射电镜观察细胞内亚细胞结构的特征与变化。
[0013]本发明的有益效果是:
[0014]本发明与常规研究相比，具有以下优点:
[0015]本发明对玉米、高粱、小麦和水稻这四种主要谷物同时进行比较性研究，这在国内很少见。另外，从谷物进化角度来看，这四种谷物很具有代表性，玉米和高粱为C4植物，而小麦和水稻为C3植物。
[0016]本发明采用了多种观察方式，从宏观上颖果的形态、色泽与大小等特征至微观上胚乳细胞内细胞器的超微结构，都进行了系统地研究，层次分明地揭示了胚乳发育的规律及其对颖果发育的影响。
[0017]本发明对胚乳组织进行了更加细致而合理的分类，并对各种组织发育过程中的结构变化规律进行了全面的观察研究，这就大大深化了胚乳分化的研究。
[0018]本发明通过比较不同谷物胚乳组织的结构差异，进一步分析了各种胚乳组织的功能特性，同时为谷物进化研究提供了丰富的证据与资料。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是玉米(A?C)，高粱(D?F)和小麦(G?I)颖果的剖面图；
[0020]图2是玉米(A，B)，高粱(C，D)和小麦(E，F)颖果下半部发育早中期的显微结构图；
[0021]图3是玉米(A, D, G)，高粱(B, E, H)和小麦(C，F，I)胚乳传递细胞的显微结构图；
[0022]图4是水稻颖果内不同部位的胚乳组织的显微结构图；
[0023]图5是玉米颖果内的养分运输路径；
[0024]图6是本发明具体实施方案简图；
[0025]图中，AC.糊粉层细胞，ACC.糊粉输导细胞，AG.糊粉粒，CSE.中心胚乳淀粉贮藏细胞，Em.胚，ECC.胚乳输导细胞，ETC.胚乳传递细胞，ESR.胚周围胚乳细胞，LB.脂质体，Pb.蛋白体，SA.亚糊粉层，SG.淀粉体，ST.筛管，VB.维管束，W1.壁内突。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
[0027]实施例
[0028]实验材料与方法
[0029]种植玉米、高粱、小麦和水稻，取发育不同天数的颖果进行实验:
[0030](I)样品的体式显微镜观察
[0031]将颖果纵切或横切，取纵剖面直接或经TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)和I2-KI (碘-碘化钾)染色后进行体式显微镜(Leica MZ6)观察。
[0032](2)样品的荧光显微镜观察
[0033]将颖果徒手或采用冰冻切片机(Leica CMl 100)纵切，利用纤维素有自发荧光的原理，在荧光显微镜(Leica DMLB)下直接观察颖果组织的荧光特性。
[0034](3)样品的光镜和透射电镜观察
[0035]将颖果纵切，取所要观察的部位，先用质量浓度为2.5%的戊二醛前固定3小时，然后以PH为7.2的0.lmol/L的磷酸缓冲液清洗3次，再用质量浓度为0.5%的锇酸后固定3小时；以pH为7.2的0.lmol/L的磷酸缓冲液清洗后，乙醇系列脱水，环氧丙烷置换，用低粘性的Spurr树脂浸透与包埋；先切I μ m半薄切片，用质量浓度为0.5%的甲苯胺兰-O、质量浓度为0.5%的番红或质量浓度为1%的甲基紫染色，在光镜(Leica DMLS)下观察显微结构。在光镜观察的基础上，进一步作超薄切片(60nm);用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色，在透射电镜(Philips Tecnai 12)下观察切片的超微结构。
[0036](4)样品的扫描电镜观察
[0037]将颖果用液氮处理后纵向断裂，取所要观察的部位，在质量浓度为2.5%的戊二醛低温固定3小时后，以pH为7.2的0.lmol/L的磷酸缓冲液清洗3次；乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换，CO2零界点干燥；最后经过离子溅射镀金制样后，便可在扫描电镜(PhilipsXL-30 ESEM)下观察。
[0038]结果与分析:
[0039]各种胚乳组织的分化、生长与衰亡
[0040](I)颖果发育早期，胚乳传递细胞分化产生，其内部壁内突不断增加；颖果发育中期，它们成熟，其内部壁内突增至最多；颖果发育后期，它们逐渐衰亡，壁内突皱缩。
[0041](2)糊粉层细胞分化产生之后，细胞壁不断增厚，内部积累脂质体与糊粉粒，但核不凋亡。
[0042](3)颖果发育早期，胚乳输导细胞占据胚乳绝大部分；颖果发育中后期，它们逐渐衰亡减少。
[0043](4)胚周围胚乳细胞在胚发育早期包裹着胚，但随着胚的生长而快速衰亡。
[0044](5)随着颖果的发育，胚乳贮藏细胞的细胞核逐渐消亡，它们内部不断积累淀粉体和蛋白体。
[0045]不同谷物胚乳发育的比较
[0046](I)玉米胚乳传递细胞壁内突很多，高粱较少，小麦更少；玉米和高粱胚乳传递细胞几乎不积累养分，而小麦胚乳传递细胞外层积累糊粉粒，内层积累淀粉体；水稻没有胚乳传递细胞，仅有糊粉输导细胞。
[0047](2)玉米胚乳输导细胞又多又长，高粱胚乳输导细胞较短较少，小麦胚乳输导细胞更短更少；玉米和高粱的胚乳输导细胞比小麦衰亡慢。
[0048](3)玉米和高粱的胚周围胚乳细胞比小麦衰亡慢。
[0049](4)水稻胚乳内含复粒淀粉体，玉米、高粱和小麦胚乳内含单粒淀粉体。各种胚乳组织的功能特性
[0050](I)胚乳传递细胞具有壁内突结构，可以有效地促进来自维管束的养分进入胚乳。
[0051](2)糊粉层积累脂质体与糊粉粒；不断增厚的细胞壁可代替衰亡的果皮和珠被来保护胚和胚乳，使其免受物理损伤或病原菌侵害。
[0052](3)胚乳输导细胞是介于胚乳传递细胞和胚乳贮藏细胞之间的中间类型细胞，它们将胚乳传递细胞吸收的养分转运至胚乳贮藏细胞。胚乳输导组织的上部不断转化成胚乳贮藏组织，下部不断衰亡而为胚生长提供空间。
[0053](4)胚周围胚乳细胞在胚发育早期包裹着胚，保护胚并为其提供养分。
[0054](5)胚乳贮藏细胞是胚乳养分贮存的主体，主要积累淀粉和蛋白质。
[0055]讨论总结
[0056](I)谷物胚乳组织大致分为养分运输组织与养分贮藏组织两类，不同谷物(特别是C4与C3植物之间)的胚乳组织分类、结构与功能会存在一些差异。
[0057](2)在玉米、高粱和小麦中，养分运输组织包括胚乳传递细胞、胚乳输导细胞和胚周围胚乳细胞，养分贮藏组织包括糊粉层细胞、亚糊粉层细胞与中心胚乳贮藏细胞；在水稻中，养分运输组织包括糊粉输导细胞和胚周围胚乳细胞，养分贮藏组织包括糊粉层细胞、亚糊粉层细胞与中心胚乳贮藏细胞。
[0058](3)玉米和高粱的胚乳传递细胞与胚乳输导细胞相似，它们与小麦的有些不同。小麦胚乳传递细胞还留有类似于水稻的糊粉输导组织特性和中心胚乳贮藏细胞特性。
【权利要求】
1.一种以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)种植玉米、高粱、小麦和水稻，取发育不同天数的颖果进行实验； (2)体式显微镜观察颖果的大小、形态与色泽变化，并观察胚乳组织的位置与分布变化； (3)荧光显微镜观察颖果不同组织的荧光特性，分析其成分； (4)光镜观察颖果与胚乳组织发育的显微结构变化； (5)扫描电镜观察细胞壁、淀粉体、蛋白体和糊粉粒的立体形态结构与分布； (6)透射电镜观察细胞内亚细胞结构的特征与变化。
2.如权利要求1所述的以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，其特征在于:步骤(2)中，体式显微镜观察是将颖果纵切或横切，取纵剖面直接或经TTC和I2-KI染色后进行体视显微镜观察。
3.如权利要求1所述的以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，其特征在于:步骤(3)中，荧光显微镜观是将颖果徒手或采用冰冻切片机纵切，利用纤维素有自发荧光的原理，在荧光显微镜下直接观察颖果组织的荧光特性。
4.如权利要求1所述的以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，其特征在于:步骤(4)中，光镜观察是将颖果纵切，取所要观察的部位，先用质量浓度为2.5%的戊二醛前固定3小时，然后以pH为7.2的0.lmol/L的磷酸缓冲液清洗3次，再用质量浓度为.0.5%的锇酸后固定3小时；以pH为7.2的0.lmol/L的磷酸缓冲液清洗后，乙醇系列脱水，环氧丙烷置换，用Spurr树脂浸透与包埋；先切I μ m半薄切片，用质量浓度为0.5 %的甲苯胺兰-O、质量浓度为0.5%的番红或质量浓度为I %的甲基紫染色，在光镜下观察显微结构。
5.如权利要求4所述的以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，其特征在于:步骤(6)中，透射电镜观察是在光镜观察的基础上，进一步作超薄切片，所述超薄切片的厚度为60nm ;用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色，在透射电镜下观察切片的超微结构。
6.如权利要求1所述的以形态学方法对胚乳组织进行详细分类的研究方法，其特征在于:步骤(5)中，扫描电镜观察是将颖果用液氮处理后纵向断裂，取所要观察的部位，在.2.5%戊二醛低温固定3小时后，以pH为7.2的0.lmol/L的磷酸缓冲液清洗3次；乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换，CO2零界点干燥；最后经过离子溅射镀金制样后，便可在扫描电镜下观察。
【文档编号】G01N21/84GK104390978SQ201410693169
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】郑彦坤, 王 忠 申请人:扬州大学