一种色质联用的昆虫体内保幼激素JHII的检测方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于液相色谱质谱联用的昆虫体内保幼激素JHII的检测方法，利用提取、净化前处理过程，液相色谱分离，三重四级杆质谱检测的分析化学技术手段对昆虫体内的保幼激素JH II含量进行检测的方法。

背景技术：

昆虫是世界上最繁盛的动物，在生物圈中扮演了重要角色。研究昆虫的生长规律、生理功能，对控制、管理昆虫具有重要意义。保幼激素是由昆虫咽侧体合成并分泌到血淋巴中的一种倍半萜化合物。它能调整昆虫的很多生理功能，包括生长、繁殖、多态性、滞育和产生信息素等。鉴于保幼激素对昆虫的广泛影响，建立一种检测保幼激素的稳定可靠的方法，可以为昆虫的研究提供有利工具。

最早的保幼激素检测方法是生物测定法，其利用了正在更新的真皮细胞对保幼激素提取物具有高敏感性，对组织块或血淋巴提取物中保幼激素的活性进行检测。但是该方法不能区分生物样品中出现的是何种保幼激素，而且很难控制定量的准确性。放射性免疫法是利用抗体与3种保幼激素产生特异性的结合，可以对保幼激素进行简便的测试。要区分不同种类的保幼激素，需要不同的抗体，这一缺陷限制了放射性免疫法的使用。随着近年来色谱技术的发展，越来越多的学者采用色谱技术对保幼激素进行检测。气相色谱质谱联用技术能够对保幼激素进行准确的定性，Bergot等人报道称其检测下限达到了1-2ng/g，然而，这种方法需要繁琐的前处理步骤。液相色谱质谱联用技术采用液相分离、质谱定性定量，其中，液相色谱-三重四级杆质谱联用技术，可以通过液相色谱分离，两级质谱的选择离子扫描，只针对目标保幼激素的子离子进行检测，最大限度地排除基质干扰。文献中大多是关于检测JH III的报道，至今，尚未见到将液液提取、固相萃取与液相色谱-三重四级杆联用质谱技术结合对昆虫体内保幼激素JH II检测的相关报道。

技术实现要素：

本发明针对现有昆虫体内保幼激素JH II检测灵敏度低等技术不足，提出了利用液液萃取提纯、固相萃取净化，液相色谱分离及三重四级杆质谱检测昆虫体内保幼激素JH II的方法，该方法可以排除昆虫体内其他物质对保幼激素JH II检测的干扰，具有重复性好、灵敏度高等特点，适用于昆虫体内保幼激素JH II的检测、研究。

本发明的技术方案如下：

(1)取昆虫样本50-200mg，称量后，放入研磨球，加入250μL的乙腈、250μL的2％氯化钠水溶液及500μL溶解1ng/mL烯虫酯的正己烷，研磨2min，4℃下12000g离心5min，提取上清正己烷层，加入500μL的正己烷，研磨提取上清，再重复一次，将粗提物合并入收集瓶，涡旋1min，低速离心2000g，氮气缓慢吹干，得昆虫样本粗提物；内标烯虫酯在整个实验过程中与目标物保幼激素JH II的变化趋势相似，能够很好的监测整个分析检测过程中保幼激素JH II的变化，保证了整个检测方法对保幼激素JH II的定量准确性。

(2)用200μL含60％体积乙腈的水溶液复溶昆虫样本粗提物，涡旋1min，然后将复溶液过固相萃取柱(其中固相萃取柱事先用1mL甲醇预洗两次)，再用200μL乙腈洗脱3次，取出收集盒中的洗脱液，涡旋1min，低速离心2000g，氮吹干，得昆虫样本精提物；

(3)用100μL含60％体积乙腈的水溶液复溶昆虫样本精提物，涡旋1min，备液相色谱质谱联用仪分析。

液相色谱分离条件为：PFP色谱柱，规格为100mm×2mm×1.7μm，流速0.2mL/min，柱温45℃，进样体积为20μL。液相色谱流动相A相为含1mM乙酸铵、0.2％体积乙腈的水溶液，B相为含1mM乙酸铵的95％体积乙腈的水溶液，采用梯度程序，起始流动相为40％B，在8min内线性升到80％B，在随后2min内升高到100％，10.1min恢复到40％B并平衡5min。

质谱采用三重四级杆串联质谱，质谱检测条件为：采用ESI源正离子模式，离子源接口电压4.0kV，雾化气、干燥气同为氮气，分别为3L/min及10L/min，加热气为空气10L/min，碰撞气为氩气，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，MRM采集参数为，保幼激素JHII定量离子对281.1>294.35，碰撞能-8V，定性离子对281.1>147.2，碰撞能-13V，内标烯虫酯定量离子对279.3>191.3，碰撞能-11V，定性离子对279.3>237.3，碰撞能-10V。

本方法综合利用了分析化学的提纯净化技术-液液提取、固相萃取，并采用了高效液相色谱-三重四级杆串联质谱技术，在很大程度上排除昆虫体内其他物质对保幼激素JH II检测的干扰，且仪器灵敏度高，检测限达到0.2pg。采用的内标烯虫酯在整个提取过程中与保幼激素JH II变化一致：将保幼激素JH II配置成的各浓度点作为横坐标，各浓度点对应的仪器响应与内标响应的比值做为纵坐标，线性相关系数R²>0.99；向昆虫样品中加入低、中、高浓度保幼激素JH II，加标回收率能够达到72.7％-87.4％。文献报道仅有日本Shiotsutki等人采用衍生化方法检测JH II，其余均为检测JH III的方法，且多数是采用初提取，再净化后进样。与已有方法相比，本方法预处理简单，灵敏度高，抗基质干扰能力强，重复性好，可以为昆虫各时期体内保幼激素JH II变化规律的研究提供帮助。

附图说明

图1为保幼激素JH II和内标烯虫酯的标准样品谱图；

图2为保幼激素JH II和内标烯虫酯在昆虫样品中检出的谱图；

图3保幼激素JH II线性标准曲线。

具体实施方式

实施例一基于液相色谱质谱联用检测昆虫体内保幼激素JH II方法的评价

将浓度为1mg/mL保幼激素JH II标样用体积浓度60％乙腈稀释成一系列不同浓度的溶液(20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，1ng/mL，0.5ng/mL，0.1ng/mL，0.05ng/mL，0.025ng/mL，0.01ng/mL)。然后分别取200μL不同浓度标样溶液，加入20μL内标烯虫酯溶液(浓度为50ng/mL)混匀，待仪器分析。采用上述加入内标的不同浓度的标样溶液进行液相色谱质谱分离分析,考察仪器方法的线性，以保幼激素JH II的浓度和峰的相对面积为坐标绘制线性标准曲线，线性相关系数R²为0.9974(图3)，线性满足分析要求。

将棉铃虫样本8份，分别加入研磨球、250μL的乙腈、250μL的2％氯化钠水溶液、500μL含1ng/mL内标烯虫酯的正己烷，研磨2min，4℃下12000g离心5min，提取上清正己烷层，再向提取上清后的残留物中加入500μL纯正己烷再次研磨、提取上清，重复研磨、提取两次(共提取三次)，经过上述液液提取方法得含粗提物的正己烷溶液，合并所有8份正己烷溶液混合均匀，然后平均分成8份，每组2份，共4组。1，2份作为空白对照组；3，4份加入5pg标样，作为组2；5，6份加入10pg标样，作为组3；7，8份加入20pg标样，作为组4。再分别经过200μL60％乙腈复溶、固相萃取、100μL60％乙腈复溶进行液相色谱质谱分离分析，加标回收率分别为87.4％，72.7％和76.4％，回收率满足分析要求。

实施例二4龄期棉铃虫样本检测

取4龄期棉铃虫样本4头，加入2mL Eppendorf管中，称量得质量191.8mg，加入研磨球，按次序加入250μL的乙腈、250μL的2％氯化钠水溶液、500μL含1ng/mL内标烯虫酯的正己烷，研磨2min，4℃下12000g离心5min，提取上清正己烷层，再向残留物中加入500μL的纯正己烷，研磨，提取上清，再用纯正己烷重复提取一次，将粗提物合并入2mL Eppendorf管，涡旋1min，低速离心15s，氮气缓慢吹干，得粗提物；向粗提物中加入200μL60％乙腈复溶，涡旋1min，然后将复溶液过事先用1mL甲醇预洗两次的固相萃取柱，用200μL乙腈洗脱3次，将收集盒中的洗脱液取出，并用200μL乙腈冲洗收集盒一次，与洗脱液一起入2mLEppendorf管，低速离心15s，氮吹干，得精提物；最后，用100μL60％乙腈复溶精提物，涡旋1min，装入1.5mL带衬管的进样瓶，进行液相色谱质谱联用仪分析。

色谱分离采用PFP色谱柱，规格为：100mm×2mm×1.7μm，流速0.2mL/min，柱温45℃，进样体积为20μL，A相为含1mM乙酸铵、0.2％乙腈，B相为含1mM乙酸铵、95％乙腈， 流动相起始为40％B，0-8min,40％B-80％B，8-10min，80％B-100％B，10.1min回到40％B，平衡5min。质谱检测采用ESI源正离子模式，离子源接口电压4.0kV，雾化气3L/min，干燥气10L/min，加热气10L/min，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，MRM采集参数为，保幼激素JH II定量离子对281.1>294.35，内标烯虫酯定量离子对279.3>191.3。

采用上述分析方法，得到的保幼激素JH II和内标烯虫酯的标准样品谱图见图1，在昆虫样品中检出的保幼激素JH II和内标烯虫酯的谱图见图2。采用内标法定量，在4龄期棉铃虫样本中检测到的保幼激素JH II的含量约为0.17pg/mg。

实施例三3龄期棉铃虫样本检测

取3龄期棉铃虫样本6头，称量得质量127.2mg，加入研磨球、250μL的乙腈、250μL的2％氯化钠水溶液、500μL含1ng/mL内标烯虫酯的正己烷，研磨2min，4℃下12000g离心5min，提取上清正己烷层，再用500μL纯正己烷重复提取两次，将粗提物合并入2mL Eppendorf管，涡旋1min，低速离心15s，氮吹干；向氮吹干后的粗提物中加入200μL60％乙腈，涡旋1min，再将复溶液过固相萃取柱入收集盒，用200μL乙腈洗脱3次，将收集盒中的洗脱液取出，并用200μL乙腈冲洗收集盒一次，与洗脱液一起入2mL Eppendorf管，低速离心15s，氮吹干；用100μL60％乙腈复溶精提物，涡旋，移入1.5mL带衬管的进样瓶，经液相色谱质谱联用仪分析及计算，采用内标法定量，在3龄期棉铃虫样本中检测到的保幼激素JH II的含量约为0.10pg/mg。