一种动态过程中微生物氧消耗速率的测定方法与流程

本发明属于生物发酵领域，更具体地，本发明涉及一种动态过程中微生物氧消耗速率的测定方法。

背景技术：

氧消耗速率(Oxygen uptake rate，OUR)是指生物发酵过程中的氧气的摄入量，其是以单位体积发酵液单位时间内摄入的氧的量来计算，又称为耗氧速率或氧摄取速率。OUR能够反应发酵过程中微生物的状态，是一种用于表征菌体呼吸代谢强度的重要参数。作为特征参数，氧消耗速率的控制成为很多工业过程最优化生产的目标之一。菌体耗氧速率的大小一方面决定了细胞进行特定生理代谢反应所消耗的氧气(降低还原度)的量，也取决于发酵环境中氧气(溶解氧)的充裕程度。发酵过程中，一个难点为计算菌体在周期性溶氧波动情况下的呼吸强度和其他生理代谢变化。

传统的OUR计算方法利用进出反应器的总氧元素守恒来实现。传统的OUR计算方法可以较为简便地计算阶段内的OUR值，但其假设无法适用于短时快速变化的环境，从而在原理上无法实现短时动态变化的OUR计算。

针对短时(秒级)的动态过程的OUR计算，近来过来也有所报道，但其方法涉及的步骤繁琐，采用复杂的数学模型来模拟，模拟前还需要对实际发酵的硬件条件(包括管道长度，尾气分析仪类型，进气系统等)进行参数拟合，在实际发酵过程中的应用难度较大。

使用混合空气或切换进气组分来控制反应器溶氧水平的方法已有报道。然而目前尚无准确的方法来计算在溶氧水平变化过程中的实际菌体耗氧水平，因此也鲜有针对动态过程的溶氧考察，更多的是基于控制不同溶氧浓度下的(拟)稳态研究。

近来报道的针对高度动态变化过程的OUR计算的方法较好地从原理出发，重建了OUR的计算。然而，其方法存在着过于复杂，系统拟合存在误差等多方面的缺点，使得其应用难度大大增加。同时，相关文献报道也仅仅将该方法应用于底物(糖)的一次性补加及周期性补加试验中，并没有应用在与溶氧相关的系列试验中。

综上，本领域需要开发新型的适用于在动态过程中测定微生物氧消耗速率的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种动态过程中微生物氧消耗速率的测定方法。

在本发明的第一方面，提供一种微生物氧消耗速率的测定方法，所述方法包括：

(1)以生物反应器进行微生物发酵，以溶氧电极监控过程溶氧浓度，采集溶氧数据(DO)；

(2)以式8进行溶氧电极响应动力学回归计算；

(3)将获得的相对溶氧浓度(％)换算为绝对溶氧浓度(mol/kg)；

(4)计算溶氧随时间的微分值；

(5)以式6计算，获得微生物氧消耗速率；

式8；

式6；

其中，C_O2,me为溶氧电极显示的溶氧百分比(％)；

C_O2,L为实际发酵液中的溶氧百分比(％)；

为溶氧电极平均响应时间(s)；

C_O2为绝对溶氧浓度(mol/kg)；

k_La为比氧传质系数(1/h)；

C_O2^*为饱和溶解氧浓度(mol/kg)；

OUR表示氧消耗速率(mol/kg/h)。

在一个优选例中，步骤(1)中，采集溶氧后，还对数据进行降噪处理。

在另一优选例中，对于溶解氧周期性波动的发酵过程，采用快速傅里叶变换的方法获得降噪。

在另一优选例中，对于溶解氧非周期性波动的发酵过程，使用曲线拟合获得平滑的溶氧值。

在另一优选例中，步骤(3)中，以式9计算绝对溶氧浓度；

式9；

其中，p_fermentor为反应器内的绝对压力(bar)；

H_O2为标准状态下的氧亨利系数(kg.bar/mol)；

f_O2,air为空气中的氧气分压。

在另一优选例中，所述的氧亨利系数H_O2在标准状态下(25℃水溶液)为769.23kg(H₂O).bar/mol(O₂)。

在另一优选例中，所述的饱和溶解氧浓度(C_O2^*)变化符合亨利定律。

在另一优选例中，步骤(4)中，以式7计算溶氧随时间的微分值；

式7。

其中，C_O2|t_n为t_n时刻的溶氧值；

C_O2|t_n+1为t_n+1时刻的溶氧值；

C_O2|t_n-1为t_n-1时刻的溶氧值；

t_n+1为溶氧记录的时间轴中的第n+1个离散点的时刻；

t_n-1为溶氧记录的时间轴中的第n-1个离散点的时刻。

在另一优选例中，所述的饱和溶解氧通过在特定过程中将OUR限定为0得到；较佳地，以式11计算；

式11。

在另一优选例中，反应过程采用pH电极反馈控制pH值。

在另一优选例中，通过控制通气气体种类而不改变通气总量来控制发酵过程的溶氧梯度的定量变化；较佳地，所述的气体包括但不限于：氧气、空气、氮气、二氧化碳。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、一种用于计算短时高度动态生物过程中菌体耗氧速率的方法的计算流程。

图2、基于新型方法与传统方法计算的OUR数值比较。

图3、根据本发明的实现的单位周期内实测溶氧变化曲线与数学处理后的溶氧曲线。实际测定溶氧(蓝色实线)；经傅里叶变换降噪后的曲线(黑色虚线)；经溶氧电极一级动力学回归后的溶氧曲线(黑色实线)。

图4、单周期内d(C_O2)/dt的变化曲线。使用未经降噪处理的溶氧作为数据源(黑色虚线)，使用经过降噪处理的溶氧作为数据源(黑色实线)。

图5、发酵液饱和溶氧在120s周期内的变化趋势。

图6、利用本发明的方法计算的短周期快速变化下，菌体OUR在120s周期内的变化值。

具体实施方式

在生物反应过程中，一大难点是检测在溶氧波动情况下对于菌体实际耗氧水平的检测。鉴于此，本发明人经过深入研究后，建立了一种简便的新型反 应器耗氧速率计算方法，实现了传统耗氧速率计算方法无法应用的高度动态生物过程的氧消耗速率计算。本方法具有低硬件依赖性，计算过程简便，操作性强等特点。本发明的方法可以应用于对大型生物反应器实际生产过程中由于混合不均匀导致的氧梯度进行研究，对工业放大的优化研究有较大的价值。

除非另外说明，本发明中，所有溶氧相对值/百分比均以标准环境(25摄氏度，1个大气压)下纯水在标准空气(氧气含量20.95％(v/v))中的饱和溶解氧的值为100％。

本发明的方法通过控制通气气体种类而不改变通气总量来控制发酵过程的溶氧梯度的定量变化，是一种基于溶氧数据的OUR计算方法，所述方法的优点是：

(1)针对简单过程(进气成分无波动，尾气成分变化不剧烈)，可以直接通过过程测定的溶氧值计算菌体耗氧速率，其结果与传统方法一致，验证了方法的准确性。同时，能够降低计算OUR所需的硬件成本。

(2)针对短时高度动态过程(进气成分剧烈波动，发酵系统不稳定，尾气成分剧烈变化)，传统方法由于假设不成立无法进行计算，而本发明的方法可以准确计算其OUR值，实现了从无法计算到有办法计算。

(3)针对OUR计算，应用了一系列溶氧、尾气信号预处理方法，包括但不限于：基于人工设定阈值的快速傅里叶变换；基于曲线拟合的数据重构；基于一级动力学的电极信号回归；基于零级动力学与一级动力学的尾气测定信号回归。

(4)相比于传统方法，本方法基于完整的物质守恒，从而避免了基于假设而造成个别发酵过程不适用的情况。就具体而言，该计算方法成功地实现了针对进气成分(出气成分，溶解氧值)剧烈变化的生物过程(即实例2)的OUR计算。

(5)相比于传统方法，基于本方法计算OUR对于尾气中氧气信息并非必须，从而降低了对于简单过程的OUR计算的硬件要求。并且验证了其与传统OUR计算方法得到结果的一致性。

(6)相比于现有文献所列举的针对短时间高度动态生物过程的方法，本方法实现较为简便，不需要对当前整个发酵硬件设备进行充分的数学模型定义。存在普遍适应性。

(7)利用该种策略可以定量准确的研究短时间溶氧波动情况下菌体的呼吸代谢响应水平，对于工业规模溶氧梯度的对生产的影响具有指导意义。

本发明的OUR计算方法，从原理出发，在适当应用相关理论基础的同时也规避了繁复的数学模型。从实际数据出发，经过适当的数学处理后即可获得该阶段的OUR参数，实现了针对短时动态环境变化下的OUR简易计算。同时该方法可以实现在没有尾气中氧气信息的条件下近似估计OUR，大大降低了OUR计算的硬件基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、OUR的获得方法

现有技术中，针对OUR的计算基于反应器气相部分的氧分子守恒(式1)，液相部分的氧分子守恒(式2)，以及液相-气相间的氧传递(式3)。

式1

式2

式3

其中，V_head为反应器顶部体积(L)，F_g,in/out为绝对进气/出气通气量(mol/h)，f_O2,in/out为进气/出气中氧气比例(-)，M_broth为发酵装液体积(kg)，OUR为单位体积发酵液耗氧速率(mol/kg/h)，k_La为反应条件下的比氧传质系数(1/h)，C_O2^*为饱和溶解氧浓度(mol/kg)，C_O2为溶解氧浓度(mol/kg)。T_O2为气液两相间的氧气传递速率(mol/h)，其中“(-)表示无量纲(即百分比)”。

对于传统的OUR计算公式，假设溶解氧变化及尾气中O₂分压变化是忽略不计的(即)，则由(式1)-(式3)可得：

式4

式5

f_N2,in为进气中惰性气体比例(-)，f_N2,out为出气中惰性比例(-)。

其中进气与尾气体积可以通过通气中的惰性气体部分(需要满足该气体组分不参与生物过程反应，此处以氮气为例)进行校准(式5)。显然，对于剧烈变化的动态过程或瞬时变化(即对于)，上述等式并不成立。同时考虑到溶氧电极及尾气采集的响应脉冲，因此无法利用该方法实现OUR的计算。

鉴于此，本发明人经过深入的研究和反复的试验，提出在已知溶氧浓度的变化(C_O2随时间变化曲线)及比氧传质系数k_La的情况下，仅仅通过(式2)与(式3)计算得到OUR值。即：

式6

其中：

式7

其中，C_O2|t_n为t_n时刻的溶氧值；

C_O2|t_n+1为t_n+1时刻的溶氧值；

C_O2|t_n-1为t_n-1时刻的溶氧值；

t_n+1为溶氧记录的时间轴中的第n+1个离散点的时刻；t表示某一

时刻(时间点)，n代表大于等于1的正整数，t₀时刻表示开始点；

t_n-1为溶氧记录的时间轴中的第n-1个离散点的时刻。

然而，直接使用原始数据通过差分法(式7)计算溶氧微分会引入较大的误差，原因包括：

1)电极信号的采集、传输噪声；

2)发酵液的饱和溶解氧浓度也会随尾气变化而变化；

3)由于考察的时间区间为秒级，因此溶氧值还需要针对使用的溶氧电极进行响应时间(通常为秒级)的校准。

因此，在使用(式6)计算OUR之前，对原始溶氧数据进行处理以降低误差。相对应的措施包括：

1)针对周期性的波动，采用快速傅里叶变换(FFT)的方法进行降噪。对于非周期性的波动，使用曲线拟合获得平滑的溶氧值。

2)将所有相对溶解氧浓度(％)换算为绝对溶氧浓度(mol/kg)。相对溶氧浓度(％)与绝对溶氧浓度(mol/kg)之间的转换遵循亨利定律(式9)：

式9

其中，C_O2,L为实际发酵液中的溶氧百分比(％)，f_O2,air为空气中的氧气分压(0.2095)，p_fermentor为反应器内的绝对压力(bar)，H_O2为标准状态(25摄氏度水溶 液)下的氧亨利系数(769.23kg(H₂O).bar/mol(O₂))。

发酵液中的饱和溶解氧浓度(C_O2^*)变化同样符合亨利定律，即：

式10

f_O2,offgas指尾气中氧气浓度数据。此处用于计算特定条件下的绝对溶氧浓度，在确定亨利常数(此处H_O2＝769.23kg(H₂O).bar/mol(O₂))下p_fermentor，H_O2均为常数，f_O2,offgas为测定值。

3)降噪后的溶氧值利用一级动力学方程(式8)回归电极的动力学响应。

式8

其中，C_O2,me为溶氧电极显示的溶氧百分比(％)，C_O2,L为实际液体中的溶氧百分比(％)，为溶氧电极平均响应时间(s)。

最终的该方法使用策略见图1。图1中，尾气中的氧气分压采集、降噪、质谱响应动力学回归等流程(该部分处理不涉及微分，因此尾气部分校准对后期的计算影响不大)如下：

(i)尾气中的氧气分压采集使用过程质谱仪/尾气分析仪直接采集。

(ii)降噪使用方法与溶氧曲线的降噪方法一致。

(iii)动力学回归包含一个零级动力学延迟及一个一级动力学延迟。

a)一级动力学延迟与溶氧的动力学延迟公式(式8)一致。

式11

b)零级动力学延迟表示为一个纯粹的时间延迟，即

式12

其中，f_{O2,offgas,raw}为尾气分析仪/过程质谱仪采集的原始信号，τ_delay,offgas为由于通气管道产生的尾气信号净延迟时间(s)，τ_r,offgas为由于在尾气分析仪/过程质谱仪气体收集腔的气体混合产生的尾气信号平均响应时间(s)。

实施例2、发酵过程中OUR测定实例

2.1材料与方法

本实施例中，以产黄青霉(Penicillium chrysogenum)生物合成青霉素(Penicillin)为例。

实验阶段分为批培养阶段与O₂波动实验阶段。

2.1.1菌株

用于发酵的菌株是：Penicillium chrysogenum Wis54-1255，购于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

2.1.2培养基

批发酵培养基成分包括：

O₂波动阶段实验采用连续培养方式进行，连续培养培养基成分同批发酵培养基，但其中PAA浓度增加至0.8g/L。

2.1.3反应过程控制策略

接种使用产黄青霉的孢子悬液。反应器体积为5L，通气量转速控制随发酵阶段的变化而变化。发酵罐压力维持在1.5bar。反应过程中使用电化学溶氧电极监控过程溶氧浓度，使用玻璃pH电极反馈控制发酵pH在6.5，使用2mol/kg NaOH溶液作为碱液。

批培养采取逐步增加转速的策略，以控制溶氧不低于100％常压饱和氧浓度为准。此时通气量控制在1L/min。

在批培养结束后开始连续补料并通过出料控制体积在3kg，控制稀释率为0.051/h。同时开始O₂波动策略。以120秒为控制周期，120秒中以30s通入空气、90s通入氮气，增加通气量至3L/min并维持不变。与之对应的溶氧波动周期为120秒，振幅达到约60％空气饱和溶氧。在大约50小时后溶氧波动呈现高度一致性。

2.2针对稳定过程的OUR计算验证

2.2.1实验过程参数

实验过程中的参数设定为：

●F_g,in＝F_g,out＝1[L/min]

●M_broth＝4[kg]

●p_fermentor＝1.3[bar]

●k_La＝240[1/h]

●τ_r,CO2＝7.29[s]

●τ_r,offgas＝1.79[s]

●τ_{delay,offgas＝}3.35[s]

●H_O2＝769.23[kg(H₂O).bar/mol(O₂)]

2.2.2根据本发明的新方法的OUR计算

根据前述实施例1的揭示，实行步骤如下：

1.采集DO数据；

2.利用多元曲线拟合重构溶氧数据，降低信号采集噪声；

3.利用(式8)回归溶氧电极动力学响应的影响；

4.利用(式9)计算溶氧的绝对浓度；

5.利用(式7)计算溶氧随时间的微分值

6.由于进气中氧气分压不变(空气)，因此可以直接利用空气中氧气分压(20.95％)计算饱和溶解氧浓度C_O2^*；

7.利用(式6)计算OUR。

2.2.3根据传统方法的OUR计算

在应用本方法的同时，同时比较了基于传统OUR计算方法(式4)的结果，将检测参数(f_O2,in与f_O2,out)代入式4来计算。

2.2.4本发明方法与传统方法的OUR测定比较

前述2.2.2与2.2.3两种方法的比较结果如图2。

由图2结果可以发现，针对批发酵这样一个简单的拟稳态过程，基于新型方法计算的数值可以省略尾气中氧气浓度数据(f_O2,offgas)采集而使用理论公式推导得到，在使得整体数据更为连贯(对于多路同时检测的尾气分析仪，数据分析频率受检测气路数量影响，间隔大约为0.5-2小时)的同时降低了OUR计算的硬件要求，最终结果与传统方法也有较好的一致性。

2.3针对高度变化的OUR计算

实验过程中的参数设定为：

●F_g,in＝F_g,out＝3[L/min]

●M_broth＝4[kg]

●p_fermentor＝1.3[bar]

●k_La＝500[1/h]

●τ_r＝7.29[s]

●τ_r,offgas＝1.79[s]

●τ_{delay,offgas＝}1.10[s]

●H_O2＝769.23[kg(H₂O).bar/mol(O₂)]

考虑整个实验过程的周期性，选取周期变化中的任意一个周期作为计算时间区间，采用的实验数据处理方法与前述2.2中相同。

如图3所示，通过对原溶氧值进行了降噪和回归处理后，其信号与原数值相比发生较为明显的变化。

如图4所示，比较了使用了合适降噪(实线)与未使用降噪(虚线)对溶氧差分值与整体准确性的影响，证明了在该方法中对溶氧直接测定值做数学优化的必要性。

在该实例中由于进气成分随时间发生剧烈变化，即进气中氧气分压比例在0％(氮气)至20.95％(空气)之间波动，因此需要计算在一个周期(120s)内的饱和溶氧值(C_O2^*)的变化。

根据(式6)，饱和溶氧值(C_O2^*)可以通过在特定过程中将OUR限定为0得到，即(式11)。实际实验中通过在实验结束后对反应器内菌体进行灭活处理，使其在保证流变特性不变的前提下丧失耗氧能力，重复同样的供氧策略并测定周期内溶氧变化，以实现对饱和溶氧值(C_O2^*)的标定。最终饱和溶氧在120s周期内的变化结果如图5所示。

式11

基于上述数学处理及标定工作，获得了可以代入式(6)的与得到在该过程中菌体好氧水平的变化趋势。

如图6所示，OUR在达到一定高度后并没有继续随溶氧的增加而增加，也没有在之后随溶氧的降低而降低。与先前微生物过程检测中“临界溶氧浓度”一概念相符。该策略的应用，不仅仅成功实现了在120s短周期内的溶氧剧烈波动，同时也实现了在剧烈波动下对于OUR的数值计算。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。