利用三种抗体的发光氧通道免疫测定及其生产和使用方法与流程

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用。

背景

免疫测定技术被广泛用于医疗诊断领域中。商业使用的免疫测定的一个实例是诱导发光免疫测定法，诸如但不限于LOCI®发光氧通道免疫测定技术(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY)。诱导发光免疫测定法描述于美国专利号5,340,716(1994年8月23日授权给Ullman等人)。目前可用的LOCI®技术涉及这样的免疫测定法，其使用几种试剂且需要使这些试剂中的两种(称为“sensibead”和“chemibead”)彼此密切接近以得到信号。在暴露于特定波长(诸如，但不限于，680 nm)的光后，sensibead释放单线态氧，并且如果两个珠粒密切接近，则单线态氧被转移至chemibead；这引起化学反应，其导致所述chemibead发出光，所述光可以在不同的波长(诸如，但不限于，612 nm)测量。

然而，该技术存在障碍。具体而言，免疫测定法依赖于用作被分析物检测机制的一种或多种抗体的灵敏度和动态范围。例如，目前免疫测定(包括中央实验室和/或临床护理环境中使用的免疫测定)中使用的某些市售抗体具有有限的灵敏度。此外，当使用灵敏度有限的抗体的诱导发光免疫测定技术被应用于开发利用微流体芯片的临床护理(POC)测定时，利用更小样品体积的测定形式进一步损害测定的灵敏度。因此，POC测定无法满足所需的测定灵敏度目标。

被分析物检测免疫测定的灵敏度依赖于测定构架中采用的一种或多种抗被分析物抗体的亲和力：抗体的亲和力越高，免疫测定的灵敏度越高。因此，期望具有高灵敏度的抗被分析物抗体用于开发被分析物特异性的诱导发光免疫测定。遗憾的是，当相比于现有抗体时，相对于现有抗体表现出显著改进灵敏度的抗体通常还具有窄得多的动态测定范围。

在一个具体、非限制性实例中，需要诱导发光免疫测定法(诸如，但不限于，POC诱导发光免疫测定法)检测的一种特定被分析物是心脏肌钙蛋白I (cTnI)。心脏肌钙蛋白被视为用于检测心肌损伤的最灵敏和最具特异性的生物化学标志物。欧洲心脏病协会和美国心脏病学会(European Society of Cardiology and American College of Cardiology, ESC/ACC)对急性心肌梗死(AMI)的重新定义建议，心脏肌钙蛋白水平的增加应该被定义为高于参考组的第99百分位数值的测量值(Alpert, J. Am. Coll. Cardiol., 36:959-69 (2000))。此外，ESC/ACC建议要求在第99百分位数决定限值的总不精密度为10％或更低(表1)。

心脏肌钙蛋白测定的这些新性能标准需要新的免疫测定设计方法，以实现定量和精确测量存在于轻度或早期心肌损伤中的极低水平的肌钙蛋白。已经提出各种免疫测定构架、抗体和检测技术以实现并超越这些新的性能标准。

抗体选择对于满足上述新的性能目标是至关重要的。选择标准必须不仅考虑肌钙蛋白I结合的特异性，还须考虑结合亲和力，这决定检测极限和测定时间。与其他心脏和骨骼肌钙蛋白以及其他心血管生物标志物的交叉反应必须是不明显的。

此外，测量患者样品中心脏特异性肌钙蛋白I的总量对于最大分析灵敏度是至关重要的。因为心脏肌钙蛋白I(cTnI)以游离形式和与心脏肌钙蛋白C(cTnC)并在更小程度上与心脏肌钙蛋白T(cTnT)的复合形式存在，选择结合cTnI表位的抗体是重要的，所述cTnI表位不依赖于与其他心脏肌钙蛋白的复合而表达。在其中所用样品类型是EDTA血浆的情况下，结合cTnI的游离形式和复合形式的能力也是重要的。cTnI和cTnC之间的结合常数在Ca²⁺存在的情况下更强。EDTA螯合Ca²⁺，导致样品中游离cTnI的比例增加。此外，游离和复合的cTnI的比例在一定程度上由cTnI和cTnC蛋白水解的程度调节。

仔细选择抗体对于确保在通过存在于坏死心肌和患者血浆中的蛋白酶的蛋白水解之后回收cTnI是必要的。降解程度因个体患者而异。cTnI蛋白水解的表现导致市售的cTnI方法之间样品稳定性的明显差异和样品之间的稳定性差异。cTnI的样品稳定性取决于cTnI测试系统中抗体所识别的特定表位。

cTnI诱导发光免疫测定中使用的前几代市售抗cTnI抗体在其引入时具有足够的灵敏度；然而，一旦AMI的定义在2000年改变(如上文所述)，市售抗cTnI抗体现在于cTnI测定的增加的性能要求水平上具有有限的灵敏度。因此，具有有限灵敏度的这些抗体无法提供诱导发光免疫测定形式(包括中央实验室和/或临床护理形式)中所需的测定灵敏度目标。此外，具有有限灵敏度的抗体是开发利用微流体芯片的临床护理(POC)测定的甚至更大的障碍，因为POC测定形式中利用的更小样品体积进一步损害测定的灵敏度。

设计用于替换目前的有限灵敏度的抗体的新鉴定的抗体(即，高亲和力绵羊单克隆抗cTnI抗体)表现出相对于现有抗体的显著改进的灵敏度；然而，该新抗体具有窄得多的动态测定范围。在高于20 ng/ml的cTnI浓度观察到信号平台，并且使用该新高亲和力抗体的增强cTnI测定不具有目前商业cTnI测定所需的动态范围。

因此，期望在大动态范围上具有高灵敏度的新的和改进的基于抗体的诱导发光免疫测定法和测定构架。本公开和要求保护的发明概念涉及这样的测定法以及与之相关的组合物、试剂盒、装置和方法。

附图的若干视图的描述

图1图示比较已知现有技术心脏肌钙蛋白I (cTnI)免疫测定的灵敏度和动态范围与根据本公开和要求保护的发明概念构建的免疫测定的灵敏度和动态范围。

图2举例说明现有技术的诱导发光免疫测定构架的两个实施方案。

图3举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的诱导发光免疫测定构架。

图4含有cTnI的各个表位区域的图谱。

图5举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的第一个实施方案。

图6举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的另一个实施方案。

图7举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的另一个实施方案。

图8举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的另一个实施方案。

图9举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的另一个实施方案。

图10举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的又另一个实施方案。

图11举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的另外的实施方案。

图12举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的基本构架的又另外的实施方案。

图13含有根据图6中显示的基本装置构架构建的微流体装置的摄影图像。

图14含有根据图11中显示的基本装置构架构建的微流体装置的摄影图像。

图15含有cTnI表位图谱，其举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的cTnI免疫测定中利用的一组三种抗体所识别的表位的第一个实例。

图16含有cTnI表位图谱，其举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的cTnI免疫测定中利用的一组三种抗体所识别的表位的第二个实例。该组三种抗体识别三个表位：由两种检测抗体识别的两个重叠表位和由捕获抗体识别的第三表位，其中所述第三表位不与其他两个表位重叠。

图17含有cTnI表位图谱，其举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的cTnI免疫测定中利用的一组三种抗体所识别的表位的第三个实例。

图18含有BNP表位图谱，其举例说明根据本公开和要求保护的发明概念构建的BNP免疫测定中利用的一组三种抗体所识别的表位的第一个实例。

详述

在通过示例性附图、实验、结果和实验室程序的方式详细解释发明概念的至少一个实施方案之前，应理解的是，所述发明概念在本申请中不限于以下描述中记载和附图、实验和/或结果中举例说明的组分的构建和排列的细节。本发明概念能够有其他实施方案或者能够以各种方式实施或进行。因此，本文中使用的语言意在给予尽可能广泛的范围和含义；并且所述实施方案意图为示例性的，而非穷尽的。此外，应理解的是，本文采用的措辞和术语用于描述目的并且不应被视作限制性的。

除非本文另有定义，与本公开和要求保护的发明概念结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。根据制造商的说明或如本领域通常所完成或如本文所述，进行酶促反应和纯化技术。通常根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更具体参考文献中所述，进行前述技术和方法。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学结合使用的命名法，和其实验程序和技术，是本领域众所周知且常用的。

本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物表明本公开和要求保护的发明概念涉及的本领域技术人员的技术水平。本申请的任何部分中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物全部明确地通过引用并入本文，其程度等同于特别并且个别地指明通过引用并入每一专利或出版物。

本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以根据本公开内容在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本公开和要求保护的发明概念的组合物和方法已经在优选实施方案方面进行描述，但对于本领域技术人员明显的是，在不背离本公开和要求保护的发明概念的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法和方法的步骤或步骤顺序进行变化。所有这种对本领域技术人员显而易见的类似替代和修饰被视为在所附权利要求定义的发明概念的精神、范围和概念之内。

如根据本分开所使用，除非另有说明，下列术语应理解为具有下列含义：

当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，词语“一个(种)(a)”或“一个(种)(an)”的使用是指“一个(种)(one)”，但它也与“一个(种)或多个(种)(one or more)”、 “至少一个(种)(at least one)”和“一个(种)或多于一个(种)(one or more than one)”的含义一致。单数形式 “一个(种)(a)”、“一个(种)(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有清楚指出。因此，例如，提及“一个(种)化合物”可以指1个(种)或多个(种)、2个(种)或更多个(种)、3个(种)或更多个(种)、4个(种)或更多个(种)或更多数目的化合物。术语“多个(种)(plurality)”是指“两个(种)或更多个(种)”。权利要求中的术语“或”的使用用于指“和/或”，除非明确指出仅指替代品或替代品是相互排斥的，尽管公开内容支持仅指替代品和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用来表明值包括装置的固有误差变异，用于测定该值的方法，或研究受试者中存在的变异。例如但不通过限制的方式，当利用术语“约”时，所指值可以与规定值相比变化± 20%或± 10%、或± 5%、或± 1%、或± 0.1%，因为这样的变化对于进行公开的方法是合适的，并且如本领域普通技术人员所理解。术语“至少一个(种)”的使用将理解为包括一个(种)以及超过一个(种)的任何数量，包括但不限于，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100等个(种)。术语“至少一个(种)”可扩展至100或1000或更多，这取决于其相关的术语；此外，100/1000的量不应考虑为限制性的，因为更高限制也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个(种)”的使用将被理解为包括单独的X、单独的Y和单独的Z，以及 X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅仅用于区分两项或更多项的目的，并不意在暗示例如一项相对于另一项的任何序列或顺序或重要性或添加的任何顺序。

如本说明书和权利要求中所用，术语“包含”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(omprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(和含有(containing)的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性或开放式的，并且不排除额外的、未记载的要素或方法步骤。

如本文中所用，术语“或其组合”是指该术语之前所列项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意在包括下列中的至少一个(种)：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定上下文中的顺序是重要的，还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解，通常对任何组合中的项目或术语的数目无限制，除非另外从上下文中显而易见。

如本文中所用，术语“基本上”意味着随后描述的事件或情况完全发生或随后描述的事件或情况在很大的程度或度上发生。例如，术语“基本上”意味着随后描述的事件或情况至少90%的时间或至少95%的时间或至少98%的时间会发生。

如本文中所用，短语“与……结合”包括两个部分与彼此的直接结合以及两个部分与彼此的间接结合。结合的非限制性实例包括例如：一个部分通过直接键或通过间隔基共价结合另一个部分，一个部分直接地或借助结合该部分的特异结合对成员非共价结合另一个部分，诸如通过将一个部分溶解于另一个部分中或通过合成将一个部分引入另一个部分中，和将一个部分涂覆于另一个部分上。

如本文中所用，术语“纯化的”是指实现相比于起始材料或天然材料的至少一个数量级的纯化，例如但不通过限制的方式，起始材料或天然材料的两个、三个、四个或五个数量级的纯化。因此，如本文中所用，术语“纯化的”不必意味着该材料是100％纯化的，因此这样的术语并不排除纯化组合物中存在的其他材料的存在。

术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，是指在其作为给定化合物的结构中包含相同基本碳骨架和碳官能度的物质，但也可以含有对其的一个或多个取代。如本文中所用，术语“取代”将被理解为是指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中，R可以包括H，羟基，硫醇，选自氟化物、氯化物、溴化物或亚碘酸盐(iodite)的卤化物，选自下列之一的C1-C4化合物：任选取代的直链、支链或环状烷基，直链支链或环状烯基，其中任选的取代基选自一种或多种烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基，其中每个是任选取代的，其中所述任选的取代基选自下列中的一种或多种：烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)2、羧基和-C(O))-烷基。

如本文中所用，术语“样品”将被理解为包括可以根据本公开和要求保护的发明概念利用的任何类型的生物样品。可以利用的生物样品的实例包括，但不限于，全血或其任何部分(即，血浆或血清)、唾液、痰液、脑脊髓液(CSF)、皮肤、间质液、泪液、粘液、尿液、拭子、组合等。

如本文中所用，术语“结合伴侣”将被理解为是指能够与另一分子结合的任何分子。例如但不通过限制的方式，结合伴侣可以是抗体(包括多克隆或单克隆抗体)，抗体片段(诸如但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、Fd、双抗体、单链抗体和保留完整抗体的可变区的至少一部分的抗体片段)、受体、配体、适配子、抗体替代蛋白或肽(即，工程改造的结合蛋白/肽)、分子印迹聚合物(即，无机基质)或其组合或衍生物，以及能够特异性结合被分析物的任何其他分子。

术语“抗体”以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性。因此，术语“抗体”或“抗体肽”是指全长免疫球蛋白分子(即，完整抗体)，或其与完整抗体竞争特定抗原结合的结合片段。结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(诸如但不限于，NANOBODIES® (Ablynx, Zwijnaarde, Belgium))和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。参见，例如，Hudson等人 (Nature Med., 9:129-134 (2003))。

如本文中所用，术语抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”是指保留结合抗原的能力的一种或多种抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合片段”内包括的结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(诸如但不限于，NANOBODIES® (Ablynx, Zwijnaarde, Belgium))、分离的CDRH3和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。这些抗体片段使用常规重组和/或酶促技术获得，并且可以与完整抗体相同的方式筛选抗原结合。

术语“CDR”及其复数“CDRs”是指抗体或抗体片段的互补决定区(CDR)，其决定抗体或抗体片段的结合特征。在大多数情况下，三个CDR存在于轻链可变区（CDRL1、CDRL2和CDRL3）中，并且三个CDR存在于重链可变区（CDRH1、CDRH2和CDRH3）中。CDR参与抗体分子的功能活性，并且通过包含支架或构架区的氨基酸序列分开。在各种CDR中，CDR3序列，特别是CDRH3是最多样的，并且因此对抗体特异性具有最强贡献。存在至少两种用于测定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法(即，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. (1987))；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Chothia等人, Nature, 342:877 (1989))。

如本文中所用，术语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在某些实施方案中，表位是抗原的被抗体特异结合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，诸如但不限于氨基酸、糖侧链、 磷酰基和/或磺酰基。在某些实施方案中，表位可以具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。

如本文中所用，术语“表位”将被理解为包括线性表位以及构象表位。线性表位由抗原的氨基酸的连续序列形成，因此包含抗原的一级/线性肽/蛋白结构。构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续部分形成，并且基于抗原的三级结构的三维表面特征和/或形状。

一个表位被定义为与另一个表位“相同”，如果特定抗体同时特异性结合这两个表位。在某些实施方案中，具有不同一级氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可以具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争结合相同表位，则它们被称为结合该相同表位。

当抗体优先识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中的抗原时，则其“特异结合”该抗原。在某些实施方案中，抗体包含特异结合特定表位的抗原结合位点。在某些这样的实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要所述不同的抗原均包含该特定表位或密切相关的表位。在某些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白可以包含相同表位。在某些实施方案中，抗体以不大于10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M、10^-11 M、10^-12 M或10^-13 M的解离常数特异性结合抗原。

"分离的"抗体是已从产生其的环境的组分中分离和/或回收的抗体。其产生环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在某些实施方案中，如至少三种不同的方法所测量，抗体将被纯化至：(1)如通过Lowry方法所测定，按抗体的重量计，大于50重量％，诸如超过75重量％或超过85重量％或超过95重量％或超过99重量％；(2)足以通过使用转杯式测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少10个残基，诸如序列的至少15个残基的程度；或(3)均质，通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为产生抗体的环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。此外，“分离的抗体”基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，分离的抗体可以与其他相关抗原具有一定的交叉反应性。

如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指从特异性结合相同表位的基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成群体的各个抗体除了可少量存在的可能天然存在的突变以外是相同的(尽管可以存在各个抗体的糖基化模式的变化)。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体是游离的，因为在一种生产方法中，它们可通过杂交瘤培养来合成，因此未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表明抗体从抗体的基本上同质群体获得的特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，在一个实施方案中，根据本公开和要求保护的发明概念产生的单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein (Nature, 256:495 (1975))描述的杂交瘤方法来制备。

根据本公开和要求保护的发明概念利用的单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法来产生，包括，但不限于，主动免疫方案的结果；导致在疾病或癌症的过程中天然产生抗体的免疫应答的结果；噬菌体衍生的抗体；等。除了上面列出的杂交瘤产生方法以外，本公开和要求保护的发明概念的单克隆抗体可以通过其他各种方法来产生，诸如，但不限于，重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)；从噬菌体展示文库分离抗体片段(参见，例如Clackson等人, Nature, 352:624-628 (1991);和Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))；以及各种其他单克隆抗体产生技术(参见，例如，Harlow和Lane, Antibodies:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988))。

一旦已获得抗体，例如一旦已识别出个体B细胞和/或已产生单克隆抗体，就可以获得编码这些抗体的可变区的序列。可例如通过如下获得可变区序列：首先对杂交瘤、B细胞或噬菌体产生的抗体蛋白进行测序，并确定编码核酸序列。在一个实施方案中，也可以对免疫球蛋白可变区(VH和 VL) DNA或cDNA进行测序。当抗体衍生自杂交瘤细胞系或分离的B细胞时，可以使用PCR，通过例如Babcook等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996))和PCT公开号WO 92/02551中描述的方法对编码可变区的cDNA进行扩增。

本公开和要求保护的发明概念涉及新的诱导发光免疫测定构架，其相比于现有技术诱导发光免疫测定提供了改进的灵敏度，同时仍保持现有技术测定的动态范围。该新的免疫测定构架可以用于开发针对各种被分析物(包括，但不限于cTnI)的新的诱导发光免疫测定，并且可适于中央实验室和/或POC使用。在这种新的测定构架中，在夹心测定中使用了两种检测抗体，以替代目前cTnI测定构架中使用的单一检测抗体。一种更高亲和力抗体与相比于该更高亲和力抗体具有更低灵敏度、但更大动态范围的另一种抗体的组合解决了目前测定构架的灵敏度和动态范围问题。

图1展示了本公开和要求保护的发明概念相比于现有技术增加的灵敏度和动态范围。在图1中，描述了两种现有技术免疫测定的剂量反应曲线，并且与本公开和要求保护的具体非限制性被分析物cTnI的测定进行比较。由圆形数据点表示的剂量反应曲线表示目前的商业cTnI测定，而由方形数据点表示的剂量反应曲线表示使用更高灵敏度抗cTnI抗体的测定。如可见，在使用高灵敏度抗cTnI抗体的测定的上部动态范围中观察到平台，而在目前的商业cTnI测定的下部动态范围中灵敏度丧失。相反，由三角形数据点表示的剂量反应曲线源自利用双检测抗体的本公开和要求保护的cTnI测定构架。相比于利用单一检测抗体的现有技术cTnI测定构架的剂量反应曲线，新的cTnI构架不仅提供所需cTnI测定灵敏度，还提供所需的cTnI测定动态范围。

图2和3提供本公开和要求保护的发明概念的诱导发光免疫测定构架与现有技术测定构架的比较。图2A举例说明现有技术免疫测定构架，其包括单一检测抗体(显示为在与含有被分析物的样品温育前与chemibead (CB)结合)和单一捕获抗体(显示为能够在温育步骤期间与sensibead (SB)结合)。在图2B中，描述了另一种现有技术免疫测定构架；在该结构中，利用双重检测抗体替代图2A中的单一检测抗体(其中两种检测抗体都能够与单一CB结合)。然而，该测定构架要求三种抗体(即，两种检测抗体和单一捕获抗体)都必须结合单一被分析物用于其检测。

相反，且如图3中所示，本公开和要求保护的发明概念的测定结构利用两种检测抗体(Ab1和Ab2，其分别举例说明为与CB1和CB2结合)，其与彼此竞争结合被分析物。也就是说，两种检测抗体结合至少部分重叠的表位，由此两种检测抗体不能都结合单一被分析物分子。检测抗体之一(Ab1)可以具有高灵敏度与有限的动态范围，而另一检测抗体(Ab2)可以具有更低水平的灵敏度与更大的动态范围。以该方式使用这两种检测抗体导致这样的免疫测定，其在足够的动态范围和检测极限上表现出期望的灵敏度水平，如图1中所示。

现在转向本要求保护和公开的发明概念的具体实施方案，公开了测定组合物以及含有其的试剂盒和装置及其生产和使用方法。在一些测定实施方案中，信号产生系统(sps)成员包括敏化剂，诸如，例如，光敏剂和化学发光组合物，其中所述敏化剂活化的产物激活化学发光组合物。一个sps成员通常生成可检测信号，该信号涉及结合和/或未结合的sps成员的量，即，结合或未结合所检测被分析物或反映待检测的被分析物的量的试剂的sps成员的量。本公开和要求保护的发明概念基于的测定平台的一个示例性实施方案是诱导发光免疫测定法(LOCI®)。诱导发光免疫测定法描述于美国专利号5,340,716。

本公开和要求保护的发明概念包括含有化学发光检测系统的组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含至少三种组分。第一组分包含包括可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第一抗体或其结合片段的组合物，其中所述第一抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的第一表位的检测抗体，由此所述可由单线态氧激活的化学发光化合物能够经由所述第一抗体或其结合片段间接结合所述被分析物。第二组分包含包括可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第二抗体或其结合片段的组合物，其中所述第二抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的第二表位的检测抗体，由此所述可由单线态氧激活的化学发光化合物能够经由所述第二抗体或其结合片段间接结合所述被分析物，且其中所述第一和第二表位至少部分重叠，使得所述第一和第二抗体或其结合片段不能同时结合单个被分析物分子。第三组分包含包括第三抗体或其结合片段的组合物，所述第三抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的不与所述第一和第二表位重叠的第三表位的捕获抗体，由此单一被分析物分子可以结合第三抗体或其结合片段和第一和第二抗体或其结合片段之一，并且其中所述第三抗体或其结合片段能够与能够在其激发状态生成单线态氧的敏化剂结合，由此第三抗体或其结合片段与敏化剂的结合允许敏化剂与被分析物的间接结合。

所述第一、第二和第三表位可以都是线性表位，因此识别被分析物的氨基酸序列的线性部分。或者，所述第一、第二和第三表位可以都是构象表位或线性和构象表位的混合物。也就是说，第一表位可以是线性表位，而第二表位可以是构象表位(或反之亦然)；以这种方式，第一和第二抗体/结合片段可以不必识别被分析物的线性氨基酸序列的重叠部分；相反，两种抗体/结合片段可以识别被分析物的氨基酸序列的三级结构的重叠部分。

在某些实施方案中，第三组分还可以包括与第三抗体或其结合片段结合的敏化剂。或者，所述组合物还可以包含第四组分，所述第四组分包括敏化剂。

敏化剂是用于生成用于活化化学发光化合物的活性中间产物诸如例如单线态氧的分子，通常是化合物。在一些实施方案中，所述敏化剂是光敏剂。通过示例而非限制方式，可以化学活化（通过,例如酶和金属盐）的其他敏化剂包括，借助外部光源的活化或较不优选地不借助外部光源的活化而可以产生单线态氧的其他物质和组合物。例如，某些化合物已经显示催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他敏化剂物质和组合物的非限制性实例包括碱土金属Ca、Sr和Ba的氧化物；d⁰构型中的3A、4A、SA和6A族的元素的衍生物；锕系元素和镧系元素的氧化物；和氧化剂CIO^-、BrO^-、Au³⁺、IO₃^-和IO₄^-；并且具体而言，钼酸根、过氧钼酸根、钨酸根和过氧钨酸根离子，以及乙腈。下列参考文献提供了关于也落入本公开和要求保护的发明概念的范围内的敏化剂物质和组合物的进一步公开内容：Aubry, J. Am. Chem. Soc., 107:5844-5849 (1985); Aubry, J. Org. Chem., 54:726-728 (1989); Böhme和Brauer, Inorg. Chem., 31:3468-3471 (1992); Niu和Foote, Inorg. Chem., 31:3472-3476 (1992); Nardello等人, Inorg. Chem., 34:4950-4957 (1995); Aubry和Bouttemy, J. Am. Chem. Soc., 119:5286-5294 (1997); 和Almeida等人, Anal. Chim. Acta, 482:99-104 (2003)。

光敏剂的范围内还包括不是真的敏化剂、但在热、光、电离辐射或化学活化的激发下将释放单线态氧分子的化合物。这类化合物的成员包括例如，内过氧化物，诸如1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物和5,6,11,12-四苯基萘5,12-内过氧化物。加热这些化合物或这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。

光敏剂是用于通过例如用光激发生成单线态氧而激活光活性化合物的敏化剂。光敏剂是可光激活的，且包括例如染料和芳族化合物，并且通常是由共价键合的原子构成的化合物，通常具有多个共轭的双键或三键。所述化合物应当吸收在200至1,100 nm或300至1,000 nm或450至950 nm的波长范围内的光，在激发波长时，其最大吸光率时的消光系数大于500 M^-1 cm^-1，或大于5,000 M^-1 cm^-1，或大于50,000 M^-1 cm^-1。光敏剂应当是相对光稳定的，且优选不与单线态氧有效反应。光敏剂的实例，通过示例而非限制的方式，包括例如丙酮、苯甲酮、9-噻吨酮、伊红、9,10-二溴蒽、亚甲基蓝、金属卟啉类诸如血卟啉、酞菁、叶绿素、玫瑰红和巴克敏斯特富勒烯以及这些化合物的衍生物。

化学发光化合物（化学发光剂）是可化学激活且作为这种激活的结果会发射特定波长的光的化合物。化学发光剂的实例，通过举例说明而非限制的方式，包括例如：能够与单线态氧或过氧化物反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷（dioxetane）的烯烃类；可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷；可以与单线态氧反应以形成二酮类的乙炔类；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类，诸如鲁米诺；和可以形成内过氧化物类的芳族化合物。作为激活反应的结果，化学发光剂直接或间接引起发光。

在某些实施方案中，可由单线态氧激活的化学发光化合物可以是这样的物质，其经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可分解，同时或随后发光。包含可由单线态氧激活的化学发光化合物的组合物可以通过本领域已知的任何方法与目标被分析物相结合；例如但不通过限制的方式，所述组合物可以具有与之结合的第二被分析物特异性结合伴侣，其允许化学发光化合物与目标被分析物的间接结合。包含化学发光化合物的组合物可通过激活的化学发光化合物直接激发；或者，所述组合物还可包含至少一种荧光分子，所述荧光分子由激活的化学发光化合物激发。可以根据本公开和要求保护的发明概念利用的化学发光化合物和光敏剂的具体、非限制性实例记载于美国专利号5,340,716 (Ullman, 等人)。

本公开和要求保护的组合物包括存在两种可由单线态氧激活的化学发光组合物，并且上文描述或本文另外设想的任何可由单线态氧激活的的组合物可作为第一和第二可由单线态氧激活的的组合物发挥功能。在某些实施方案中，可能期望两种可由单线态氧激活的化学发光组合物是相同的可由单线态氧激活的化学发光组合物。例如，在图1中图示描述的测定中，相同的可由单线态氧激活的化学发光组合物与两种检测抗体/结合片段结合，并且因此在单一波长检测到信号。在其他实施方案中，可能期望两种可由单线态氧激活的的组合物彼此不同。当组合物彼此不同时，可在不同波长检测到第一和第二抗体/结合片段的结合。例如，第一波长可用于检测曲线的低端，而不同波长可用于检测曲线的高端。

根据本公开和要求保护的发明概念利用的敏化剂能够经由与链霉亲和素的结合间接结合目标被分析物。以该方式，生物素与第一被分析物特异性结合伴侣结合，且链霉亲和素和生物素的结合，以及第一被分析物特异性结合伴侣与目标被分析物的结合，导致敏化剂与目标被分析物的间接结合。在一个非限制性实例中，敏化剂可以是光敏剂，使得通过用光照射而激活敏化剂。

在某些实施方案中，第一抗体/结合片段和第二抗体/结合片段表现出对于被分析物不同的亲和力。例如，所述两种抗体/结合片段之一可以对被分析物具有更低亲和力，而另一抗体/结合片段对被分析物具有更高亲和力。在一个具体、非限制性实例中，第一抗体/结合片段可以被认为是以10^-6 M至10^-10 M的范围内的解离常数特异性结合被分析物的低亲和力抗体，而第二抗体/结合片段可以被认为是以10^-10 M至10^-13 M的范围内的解离常数特异性结合被分析物的高亲和力抗体。

可以利用高亲和力抗体/结合片段与低亲和力抗体/结合片段的任何比率，只要该测定能够根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能，并提供所需的线性度和动态范围。在具体非限制性实施方案中，高亲和力抗体/结合片段可以占两种检测抗体/结合片段的组合的约5％至约20％，而低亲和力抗体/结合片段可以占存在的总检测抗体的约80％至约95％。可以利用的高亲和力抗体/结合片段与低亲和力抗体/结合片段比率的具体非限制性实例包括约5％(高)比约95％(低)、约10％(高)比约90％(低)和约20％(高)比约80％(低)。

可以任何形式提供第一、第二和第三抗体或其结合片段，所述形式允许这些抗体/结合片段根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能。例如，第一、第二和第三抗体/结合片段中的每一种都可以是多克隆抗体/结合片段或单克隆抗体/结合片段。此外，可以根据本公开和要求保护的发明概念利用不同类型的抗体/结合片段的任何组合。例如，第一和第二抗体/结合片段可以是单克隆抗体/结合片段，而第三抗体/结合片段是多克隆抗体/结合片段。或者，第一和第二抗体/结合片段可以是多克隆抗体/结合片段，而第三抗体/结合片段是单克隆抗体/结合片段。在又另一个替代方案中，第一和第二抗体/结合片段之一可以是多克隆抗体/结合片段，而另一者是单克隆抗体/结合片段。在本实例中，第三抗体/结合片段可以是多克隆或单克隆的。

所述抗体可以对于期望以该方式检测的任何被分析物是特异性的。本文考虑的被分析物的非限制性实例包括，但不限于，肌钙蛋白，诸如心脏肌钙蛋白I(cTnI)、CKMB、肌球蛋白、髓过氧化物酶、β-HCG、BNP、NT-proBNP、PCT、CRP和iPHT等。

当待检测的被分析物是cTnI时，三种抗体可以识别cTnI分子中的任何三个表位，只要所述表位如上文所述定位。也就是说，第一和第二表位必须至少部分彼此重叠，使得所述第一和第二抗体或其结合片段不能同时结合单个被分析物分子；此外，第三表位必须不与第一表位或第二表位重叠，由此第三抗体或其结合片段可以结合第一或第二抗体或其结合片段已结合的单个被分析物分子。cTnI的整个210氨基酸序列已在本文中被指定为SEQ ID NO:1。

图4含有cTnI序列中的各个表位区域的图谱，其举例说明可以根据本公开和要求保护的发明概念利用的各个表位中的一些。在本公开和要求保护的发明概念的某些非限制性实施方案中，待检测的被分析物是cTnI，并且第一和第二抗体/结合片段特异性结合图4的区域A、B、C、D、E和F (即，分别为SEQ ID NO:2-7)之一内的重叠表位，而第三抗体/其结合片段特异性结合不同区域内的表位。例如但不通过限制的方式：(a)第一和第二抗体/结合片段结合区域A(SEQ ID NO:2)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域B-F之一(即，SEQ ID NO:3-7之一)内的表位；(b)第一和第二抗体/结合片段结合区域B(SEQ ID NO:3)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域A和C-F之一(即，SEQ ID NO:2和4-7之一)内的表位；(c)第一和第二抗体/结合片段结合区域C(SEQ ID NO:4)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域A-B和D-F之一(即，SEQ ID NO:2-3和5-7之一)内的表位；(d)第一和第二抗体/结合片段结合区域D(SEQ ID NO:5)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域A-C和E-F之一(即，SEQ ID NO:2-4和6-7之一)内的表位；(e)第一和第二抗体/结合片段结合区域E(SEQ ID NO:6)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域A-D和F之一(即，SEQ ID NO:3-5和7之一)内的表位；且(f)第一和第二抗体/结合片段结合区域F(SEQ ID NO:7)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域A-E之一(即，SEQ ID NO:2-6之一)内的表位.在具体非限制性实例中，第一和第二抗体/结合片段结合区域A或区域B(分别为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)内的重叠表位，而第三抗体/结合片段特异性结合区域C(SEQ ID NO:4)内的表位。

在根据本公开和要求保护的发明概念的cTnI免疫测定中利用的cTnI表位/抗体组合的额外非限制性实例包括如下：(i)第一和第二抗体/其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11的任何表位，而第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:10的表位；(i)第一和第二抗体/其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8和9的表位，而第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:10的表位；(ii)第一和第二抗体/其结合片段特异性结合SEQ ID NO:9和11的表位，而第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:10的表位；且(iii)第一和第二抗体/其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12和13的表位，而第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:14的表位。表位的特定组合举例说明于图15-17中并且将在下面实施例中详细讨论。

当待检测的被分析物是B型利尿钠肽(BNP)时，三种抗体可以识别BNP分子中的任何三个表位，只要所述表位如上文所述定位(即，第一和第二表位至少部分彼此重叠，而第三表位不重叠第一和第二表位中的任一者)。BNP的32氨基酸序列已被指定为SEQ ID NO:15，并且与可根据本公开和要求保护的发明概念利用的表位组合的非限制性实例一起显示于图18中。在图18中描述(并且如以下实施例部分中详细描述的)的非限制性实例中，第一和第二抗体/其结合片段可特异性结合SEQ ID NO:16和17的表位，而第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:18的表位。

可以任何形式和/或制剂提供组合物/试剂盒/方法的试剂，所述形式和/或制剂允许它们根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能。例如但不通过限制的方式，所述组分可以是珠粒或类似制剂的形式。此外，在某些实施方案中，可能期望以单次使用冻干试剂的形式设置试剂。微流体装置中干燥试剂的使用详细描述于专利申请公开WO 2013/078130 A1。

在某些实施方案中，多种组分可以一起设置于单一珠粒或制剂中和/或冻干于单一颗粒中。例如但不通过限制的方式，单一珠粒可包括第一和第二组分；也就是说，单一珠粒可含有第一和第二抗体/结合片段以及与抗体/结合片段结合的可由单线态氧激活的化学发光化合物。含有两种组分的单一珠粒可以随后被冻干成单个颗粒或设置于另一制剂中。

此外，设置于分开珠粒/制剂中的两种或更多种组分可一起冻干。例如但不通过限制的方式，第一和第二组分(含有与可由单线态氧激活的化学发光化合物结合的第一和第二抗体/结合片段)可以一起冻干。在另一个非限制性实例中，第一和第二组分(含有与可由单线态氧激活的化学发光化合物结合的第一和第二抗体/结合片段)和第三组分(含有第三抗体/结合片段)可以作为单一颗粒一起冻干。此外，单一冻干颗粒可以含有多种类型的珠粒/制剂的组合；也就是说，单一冻干颗粒可以含有以下的混合物：(a)含有第一和第二组分的单一珠粒；(b)仅含有第一组分的珠粒；和(c)仅含有第二组分的珠粒。

上面所述或本文另外设想的任何组合物还可以包含额外组分，诸如但不限于，稀释剂、洗涤溶液和/或赋形剂(用于重构冻干试剂)。此外，上文所述或本文另外设想的任何组合物还可以包括其中设置有一种或多种上述组分的微流体装置。

本公开和要求保护的发明概念还包括可用于方便地进行用于测定被分析物的测定的试剂盒；所述试剂盒可含有上述组分/试剂(包括上文所述的组合物的任何实施方案)的任何组合；此外，所述试剂盒还可以含有用于进行本文所述或另外设想的任何具体测定的其他试剂。这些额外试剂的性质将取决于具体测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技术内。

所述组分/试剂可以各自被设置于分开的容器/隔室中，或者各种组分/试剂可以被组合于一个或多个容器/隔室中，这取决于所述组分/试剂的抗体结合常数/效率和/或稳定性的竞争性质。所述试剂盒还可以包括例如其他分开包装的用于进行测定的试剂，诸如额外的sbp成员、sps成员和辅助试剂。此外，所述试剂盒可包括其中设置有组分/试剂的微流体装置。

所述试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以大幅变化，以提供这样的组分/试剂的浓度，其显著优化测定方法期间需要发生的反应，并进一步显著优化测定的灵敏度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以干燥形式提供，诸如冻干颗粒(包括但不限于球体、微片、粉末、微点等)，并且所述试剂盒还可包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以该方式，从这些组分可获得具有用于进行根据本公开和要求保护的发明概念的方法或测定的适当浓度的试剂溶液。试剂盒可包括阳性和/或阴性对照。所述试剂盒还可包括解释如何使用试剂盒的一组书面说明。具有该性质的试剂盒可用于本文描述或另外设想的任何方法中。

本公开和要求保护的发明概念还涉及其中设置有上文描述的组合物的微流体装置。所述微流体装置可具有与之相关的一种或多种手动功能(即，其中需要用移液管添加一种或多种试剂和/或在两个隔室之间移动混合物)；或者，所述微流体装置可以是全自动、封闭系统，其中在微流体装置的构建期间将必要试剂设置于各个隔室中(其中各个隔室连续流体连通(或能够连续流体连通))，因此，在将样品添加至微流体装置之后，不需要手动操作样品和/或试剂用于进行测定。所述微流体装置包括一个或多个隔室，其含有上文描述的三种或四种组分(即，含或不含敏化剂的三种含有抗体的组合物；当敏化剂存在时，其可以单独提供，或者其可以与含有第三抗体的组合物结合)。所述装置可以提供任何数量的隔室、任何排列的隔室以及三种或四种组分在其之间的任何分布，只要所述装置能够根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能；装置结构的非限制性实例仅出于说明性目的而提供于图中。当提供为多个隔室时，所述隔室可与彼此完全分开，或者一个或多个隔室能够与彼此流体连通。

所述微流体装置还可包括样品施加室和/或入口通道，其中可施加/设置样品。样品施加室和/或入口通道能够与微流体装置的一个或多个隔室流体连通。此外，当微流体装置提供有样品施加室和入口通道时，所述样品施加室能够与入口通道流体连通，而入口通道能够与其中设置试剂的一个或多个隔室流体连通。

样品可直接施加于含有测定试剂的隔室中，或者样品可在进入含有测定试剂的隔室之前通过样品施加室/入口通道。当样品在到达测定隔室之前穿过一个或多个隔室时，基本上所有样品均可穿过，因此在到达测定隔室后基本上保持完整。或者，只有部分样品可到达测定隔室。在一个实施方案中，仅仅因为测定隔室上游的隔室的尺寸、重量和/或体积限制，这就可以发生；在另一个实施方案中，微流体装置可以在样品施加室、入口通道、测定隔室上游的隔室和/或其之间的任何连接中含有一个或多个结构，其允许从整个样品分离出样品的某些组分和/或将所述组分递送至测定隔室。

在一个实施方案中，将三种或四种试剂设置于微流体装置的单个隔室中。在另一个实施方案中，微流体装置可以含有至少两个隔室；第一隔室可以含有前三种组合物(即，与可由单线态氧激活的组合物结合的第一和第二抗体/结合片段以及第三抗体/结合片段)，而第二隔室含有敏化剂。此外，包括两个隔室的这种微流体装置还可以包括入口通道，可通过所述入口通道施加样品；在该配置中，第一隔室能够与入口通道流体连通，而第二隔室能够与入口通道和第一隔室中的至少一个流体连通。在另一个实施方案中，微流体装置可以含有至少三个隔室；第一、第二和第三隔室可分别含有第一、第二和第三组分。此外，可以期望的是，第一抗体/结合片段(存在于第一组分中)以高亲和力结合目标被分析物，而第二抗体/结合片段(存在于第二组分中)以低亲和力结合目标被分析物。以这种方式，所述更高亲和力抗体/结合片段先于所述更低亲和力抗体/结合片段与被分析物接触。

可以密封微流体装置的任何隔室，以便将其中设置的试剂保持于基本上气密的环境中，直至其使用；例如，可以密封含有冻干试剂的隔室以防止试剂的任何意外重构。入口通道和一个隔室，以及两个隔室，可被描述为“能够与彼此流体连通”；该短语表明仍然可密封隔室，但两个隔室能够在刺穿其中或其之间形成的密封后在其之间具有流体流动。

本公开和要求保护的发明概念的微流体装置可以提供有本领域已知或本文另外设想的任何其他所需特征。例如，但不通过限制的方式，本公开和要求保护的发明概念的微流体装置还可以包括读取室；读取室可以是含有测定组分中的一种或多种的隔室，或者读取室可以与含有测定试剂的一个或多个隔室流体连通。所述微流体装置还可以包括含有其他溶液的一个或多个隔室，所述其他溶液诸如但不限于，洗涤溶液、稀释剂、赋形剂、干扰溶液、阳性对照、阴性对照、质量对照、其任何组合等。例如，所述微流体装置可以包括含有稀释剂的一个或多个隔室，并且这些隔室能够与所述装置的任何其他隔室流体连通。在另一个实例中，所述微流体装置还可以包括含有用于重构一种或多种冻干试剂的至少一种赋形剂的一个或多个隔室，并且所述隔室能够与所述装置的任何其他隔室(诸如含有冻干试剂的隔室)流体连通。此外，所述微流体装置还可以包括含有洗涤溶液的一个或多个隔室，并且所述隔室能够与所述装置的任何其他隔室流体连通。

此外，本文描述或另外设想的任何试剂盒/微流体装置可以包括复用在单个试剂盒/装置中的多个测定。当提供有多个测定时，所述测定两者均可以如本文所述构建和发挥功能。或者，如本文所述的测定可以与本领域已知的任何其他类型的诱导发光免疫测定(例如，但不限于，美国专利号5,340,716和美国临时申请号61/787,735；61/788,194；和61/788,692中描述的LOCI®免疫测定技术；都在2013年3月15日申请)复用，也就是说，能够包含于本公开和要求保护的发明概念的试剂盒/微流体装置内。当多个测定存在于单个试剂盒/微流体装置中时，两个或更多个测定可以同时和/或依次(包括完全或部分依次)运行。当两个或更多个测定同时运行时，可能期望利用两种不同的可由单线态氧激活的化学发光化合物。当两个或更多个测定平行(无论完全或部分依次)运行时，可以在两个测定中利用相同的可由单线态氧激活的化学发光化合物，并且在不同时间点读取两个测定。

当在单个微流体装置中提供多个测定时，多个入口通道可以连接至样品施加室。在某些实施方案中，部分样品可以从样品施加室穿过至多个入口通道，而不考虑其内容物。或者，可以在样品施加室、入口通道和/或其之间的连接中提供结构，其允许从整个样品分离出某些组分并将所述组分递送至不同测定。可以根据本公开和要求保护的发明概念利用的样品分配装置的非限制性实例详细描述于2013年3月15日申请的题为“Microfluidic Distributing Device”的临时申请号61/790,580。

本公开和要求保护的发明概念还涉及用于检测样品(诸如但不限于，全血、裂解的全血细胞，或红血细胞)中的目标被分析物的存在和/或浓度的方法。在一个实施方案中，所述方法包括同时或完全或部分依次组合以下的步骤：疑似含有特定被分析物的样品；包含与第一和第二抗体/结合片段结合的可由单线态氧激活的化学发光化合物的两种组合物；含有第三抗体/结合片段和敏化剂的第三组合物。所述混合物在允许三种抗体/结合片段结合样品内的被分析物的条件下温育；这导致形成两种夹心复合物：包含一种被分析物分子且其中含有第一抗体/结合片段的组合物和含有第三抗体/结合片段的组合物与所述被分析物结合的第一夹心复合物，以及包含另一种被分析物分子且其中含有第二抗体/结合片段的组合物和含有第三抗体/结合片段的组合物与所述被分析物结合的第二夹心复合物。如果敏化剂尚未与含有第三抗体/结合片段的组合物结合，则混合物的温育还导致敏化剂经由夹心复合物中存在的含有第三抗体/结合片段的组合物而与所述第一和第二夹心复合物结合，因此使敏化剂紧密靠近含有第一和第二抗体/结合片段的组合物中的化学发光化合物。

然后激活敏化剂以生成单线态氧，其中第一和第二夹心复合物中存在的敏化剂的激活引起第一和第二夹心复合物中存在的化学发光化合物的激活。然后测定由第一和第二夹心复合物中存在的激活的化学发光化合物生成的化学发光的量。结合/温育、激活和/或测定步骤可以任选地重复所需次数。通过分析如此产生的化学发光的量来检测所述被分析物的存在和/或浓度，其中化学发光的量与样品中的被分析物的量成正比。

如上所提及，组合(同时或依次)提供所述方法的样品和各种组分。当依次添加所述方法的样品和各种组分时，可以改变样品/组分的添加顺序；本领域普通技术人员可确定向测定添加样品/不同组分的具体所需顺序。最简单的添加顺序当然是同时添加所有物质，并测定由其产生的信号。或者，可以依次组合样品和每种组分或组分组。在某些实施方案中，可以在添加样品和/或每种组分之后涉及温育步骤。

当敏化剂是光敏剂时，激活步骤可以进一步限定为经由光照射激活该光敏剂。当第一和第二组合物中的至少一种还包含由激活的化学发光化合物激发的至少一种荧光分子时，所述方法还可以包括测量由荧光分子发射的光的量以测定样品中的被分析物的量的步骤。

可以在与任何测定试剂组合前将所述样品暴露于分离步骤。例如但不通过限制的方式，可能期望在开始测定前从全血样品分离血浆、血清或特定细胞类型(诸如但不限于，红血细胞)，使得全血样品中存在的组分不影响测定的灵敏度、动态范围和/或检测极限。

可能期望在激活传感器前稀释从培养/温育步骤形成的混合物，因此所述方法还可以包括将稀释剂添加至样品和试剂的温育混合物的步骤。存在多种可以有助于背景信号的因素，诸如但不限于：(1)两种测定组合物与彼此的非特异性结合，和(2)存在仅仅彼此紧密靠近的两种未附接的测定组合物。由于这些原因，可能期望在光暴露之前稀释最终反应混合物以解离非特异性结合的组合物并增加未结合的组合物之间的平均颗粒距离。

现在转向附图中显示的具体实施方案，图5和6描述“开放系统”微流体装置，其中需要一种或多种手动功能用于进行测定(即，需要用移液管添加一种或多种试剂和/或在两个隔室之间移动混合物)。

图5描述根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置。微流体装置通过一般参考数字10表示，并包括壳体12，所述壳体12包括隔室14。隔室14含有预定量的以下中的每种：第一组合物16(其含有与第一抗体/结合片段结合的可由单线态氧激活的化学发光化合物)、第二组合物18(其含有与第二抗体/结合片段结合的可由单线态氧激活的化学发光化合物)和第三组合物20(其含有第三抗体/结合片段)。第三组合物20还可以包含与第三抗体/结合片段结合的敏化剂，或者隔室14还可以含有预定量的与第三组合物20分开的敏化剂22。此外，尽管四种组合物16、18、20和22被描述为单独组分，但这些单独组分中的两种或更多种可以被一起冻干成单个颗粒。

当使用图5的微流体装置10时，将样品直接手动施加(即，移液)入隔室14中。如果利用稀释剂，也可以将稀释剂人工施加(即，移液)入隔室14中，诸如但不限于，在添加样品和/或温育反应混合物之后。隔室14可以作为混合/温育室和作为读取室发挥功能，由此在隔室14中激活敏化剂，且从隔室14直接测量如此生成的化学发光。或者，隔室14可以简单地作为混合和/或温育室发挥功能，并且将反应混合物可以从隔室14移取并添加至其中进行激活和/或读取步骤的另一个装置。也就是说，所述测定可能需要使用两个装置(芯片)：装置10以及不与装置10连接的单独装置。以这种方式，将反应混合物在装置10的隔室14之外温育并转移至所述单独装置。

图6描述微流体装置10a，除了如下文所述的不同之外，其类似于图5的微流体装置10。微流体装置10a包括壳体12a，其包括第一隔室14a；然而，壳体12a还包括第二隔室24和第三隔室26。第一组合物16a、第二组合物18a、第三组合物20a和敏化剂22a可以分散于三个隔室14a、24和26之中。仅出于说明的目的，第一和第二组合物16a和18a被描述为设置于第一隔室14a中，而第三组合物20a被设置于第二隔室24中，敏化剂22a被设置于第三隔室26中。然而，应理解的是，可以利用隔室14a、24和26之间的组合物16a、18a、20a和22a(或者当敏化剂22a被包含在第三组合物20a中时，16a、18a和20a)的任何分散顺序，只要该测定能够根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能。此外，尽管四种组合物16a、18a、20a和22a被描述为单独组分，但所述单独组分中的两种或更多种可以被一起冻干成单个颗粒。

当使用图6的微流体装置10a时，将样品直接手动施加(即，移液)入隔室14中并允许其与其中设置的组合物16a和18a温育。然后将来自隔室14a的反应混合物从隔室14a移取，并直接施加至隔室24，并允许其与组合物20a温育。然后将来自隔室24的反应混合物从隔室24移取，并直接施加至隔室26，并允许其与敏化剂22a温育。然后将来自隔室26的反应混合物从隔室26移取，并直接施加至读取室28，其中在读取室28中激活敏化剂22a，并从读取室28直接测量如此生成的化学发光。

应理解的是，图5和6中描述的开放系统微流体装置内温育/混合隔室的数目和测定试剂的设置顺序仅为了说明的目的，而不应被解释为限制性的。尽管图5和6描述含有其中设置测定试剂的一个或三个温育/混合隔室的微流体装置，但应理解的是，在本公开和要求保护的发明概念的范围内充分设想了含有其中设置测定试剂的一个、两个、三个或四个温育/混合隔室的装置。此外，当所述装置含有两个或更多个温育/混合隔室时，可以在所述两个或更多个温育/混合隔室之间以任何所需顺序分散测定试剂，只要该测定可以如本文所述发挥功能。此外，无论存在的温育/混合隔室的数目，最终温育/混合隔室也可以是读取室；或者，除了一个、两个、三个或四个温育/混合室以外，微流体装置中也可以存在读取室。此外，所述微流体装置还可以含有一个或多个额外结构，诸如但不限于，在添加至一个或多个隔室前可以在其中设置赋形剂和/或稀释剂的额外隔室。

图7-12描述“封闭系统”微流体装置，其中在微流体装置的各个隔室中在其构建期间设置必要的测定试剂。这些微流体装置包含全自动、封闭系统，其中在将样品添加至微流体装置之后不需要手动功能即可进行测定。

图7描述根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的另一个实施方案。微流体装置40包括壳体42，所述壳体42包括隔室44，所述隔室44含有第一组合物46、第二组合物48和第三组合物50。第三组合物50可以包含与第三抗体/结合片段结合的敏化剂，或者隔室44还可以含有预定量的与第三组合物50分开的敏化剂52。此外，尽管四种组合物46、48、50和52被描述为单独组分，但任何单独组分均可以被一起冻干成单个颗粒。

壳体42还包括样品施加室54和将样品施加室44连接至隔室44的入口通道56。样品(诸如，但不限于，血液样品)可以施加至样品施加室54，所述样品施加室54与(或能够与)入口通道56流体连通。入口通道56与(或能够与)隔室44流体连通。隔室44可以作为混合/温育室且作为读取室发挥功能。

入口通道56可以简单地将部分样品转移至隔室44，或入口通道56可以含有一个或多个结构，所述一个或多个结构允许从整个样品分离出某些组分(即，提供从施加至样品施加室54的全血样品分离出血浆、血清或红血细胞的分离过滤器)和/或检测样品中的降解(诸如，不限于，溶血)。

可为本文描述或另外设想的任何微流体装置提供含有其他试剂/溶液的额外隔室。例如，图8描述类似于图7的微流体装置40的微流体装置40a，不同之处在于微流体装置40a还包括与(或能够与)入口通道56a和/或第一隔室44a流体连通的第二隔室58；第二隔室58含有预定量的至少一种试剂60，诸如赋形剂、稀释剂、洗涤溶液等。例如，但不是通过限制的方式，当组合物50a、52a、54a和/或56a为干燥试剂的形式时，样品本身可用于重构干燥试剂；或者，可为所述微流体装置提供含有赋形剂的一个或多个隔室，所述隔室可与(或能够与)含有所述试剂的隔室流体连通。

可以密封本文描述或另外设想的任何微流体装置的任何隔室，以便将其中设置的试剂保持于基本上气密和/或基本上不透光的环境中，直至其使用；例如，可以密封含有冻干试剂的隔室以防止试剂的任何意外重构和/或任何试剂暴光。入口通道和一个第一隔室，以及两个隔室，可被描述为“能够与彼此流体连通”；该短语表明所述隔室仍然可密封，但能够在刺穿其中形成的密封后在其之间具有流体流动。

此外，应理解的是，还可为本文描述或另外设想的任何微流体装置提供额外隔室和/或其他流体环路。例如，但不是通过限制的方式，任何微流体装置均可以额外含有混合室和/或设置于两个试剂室之间的流体环路。

图9描述根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的另一个实施方案。微流体装置通过一般参考数字80表示且类似于图5-8的微流体装置10、10a、40和40a，不同之处在于微流体装置80含有两个隔室，并且所述测定试剂可以分散在这两个隔室中。

微流体装置80包括壳体82，所述壳体82包括样品施加室84、入口通道86、第一隔室88和第二隔室90。样品(诸如，但不限于，血液样品)可以施加至样品施加室84，所述样品施加室54与(或能够与)入口通道86流体连通。入口通道86与(或能够与)第一隔室88流体连通。第一隔室88被举例说明为含有预定量的第一组合物92和第二组合物94中的每一种，并且还可以含有预定量的第三组合物96。第二隔室90与(或能够与)第一隔室88流体连通；第二隔室90被举例说明为含有预定量的敏化剂98。尽管第三组合物96在图9中被描述为设置于第一隔室88中，但应理解的是，第三组合物96可以替代地设置于第二隔室90中。此外，尽管第三组合物96和敏化剂98在图9中被描述为两种单独组分，但应理解的是，可在第二隔室90中提供同时含有第三组合物96和敏化剂98的单一组合物。

隔室88和90中的试剂92、94、96和98的设置顺序仅为了示例的目的，而不应被解释为限制性的。试剂92、94、96和98可以任何所需顺序设置于隔室88和90中。此外，尽管四种组合物92、94、96和98被描述为单独组分，但任何单独组分均可以被一起冻干成单个颗粒并设置于隔室88和90中的任一者中。

还可为微流体装置80提供含有额外试剂(诸如但不限于，稀释剂、赋形剂、洗涤溶液等)的一个或多个额外隔室。当提供一个或多个额外隔室时，所述隔室可以与(或可以能够与)第一隔室88和/或第二隔室90流体连通。

在某些实施方案中，含有敏化剂的微流体装置的隔室(诸如图9的微流体装置80的第二隔室90)可以作为读取室发挥功能。或者，可以提供与(或能够与)含有敏化剂的隔室流体连通的额外隔室，并且该额外隔室充当读取室。例如，图10举例说明包括壳体112的微流体装置110，所述壳体112包括样品施加室114、入口通道116、第一隔室118、第二隔室120、读取室122和额外隔室132。样品(诸如，但不限于，血液样品)可以施加至样品施加室114，所述样品施加室114与(或能够与)入口通道116流体连通。第一隔室118与(或能够与)入口通道116流体连通，而第二隔室120与(或能够与)第一隔室118流体连通。第一和第二隔室118和120被举例说明为含有测定组合物124、126、128和130，如下文更详细描述。读取室122与(或能够与)第二隔室120流体连通。额外隔室132与(或能够与)入口通道116、第一隔室118、第二隔室120和/或读取室122中的一个或多个流体连通。额外隔室132含有预定量的至少一种试剂134，诸如赋形剂、稀释剂、洗涤溶液等。

仅为了示例的目的，第一隔间118被举例说明为含有预定量的第一组合物124、第二组合物126和第三组合物128中的每一种，并且第二隔室120被举例说明为含有预定量的敏化剂130。然而，应理解的是，四种组合物124、126、128和130可以任何顺序设置于微流体装置110中，只要微流体装置110能够根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能。例如但不通过限制的方式，第三组合物128可以替代地设置于第二隔室120中。此外，尽管第三组合物128和敏化剂130被描述为两种单独组分，但应理解的是，第三组合物128和敏化剂130可以在被设置于微流体装置110内前彼此结合。此外，尽管四种组合物124、126、128和130被描述为单独组分，但所述单独组分中的两种或更多种可以被一起冻干成单个颗粒并设置于隔室118或120中的任一者中。

图7-9的微流体装置40、40a和80举例说明单一隔室中的四种测定组合物的设置，而图10的微流体装置10举例说明四种测定组合物在两个隔室中的散布；然而，应理解的是，四种测定组合物可以分散在三个或更多个隔室中。例如，图11举例说明微流体装置110a，除了如下文所述的不同之外，其类似于图10的微流体装置110。微流体装置110a包含壳体112a，所述壳体112a包括样品施加室114a、入口通道116a、第一隔室118a、第二隔室120a、第三隔室136、读取室122a和额外隔室132a。第一、第二和第三隔室118a、120a和136与(或能够与)彼此流体连通，如图中所举例说明，并且隔室118a、120a和136被举例说明为含有测定组合物124a、126a、128a和130a，如下文更详细描述。第三隔室136与(或能够与)读取室122a流体连通。额外隔室132a与(或能够与)入口通道116a、隔室118a、120a和136和/或读取室122a中的一个或多个流体连通。额外隔室132a含有预定量的至少一种试剂134a，诸如赋形剂、稀释剂、洗涤溶液等。

仅为了示例的目的，第一隔间118a被举例说明为含有预定量的第一和第二组合物124a和126a中的每一种，第二隔室120a被举例说明为含有预定量的第三组合物128a，且第三隔室136被举例说明为含有预定量的敏化剂130a。然而，应理解的是，四种组合物124a、126a、128a和130a可以任何顺序设置于微流体装置110a中，只要微流体装置110a能够根据本公开和要求保护的发明概念发挥功能。此外，尽管第三组合物128a和敏化剂130a被描述为两种单独组分，但应理解的是，第三组合物128a和敏化剂130a可以在被设置于微流体装置110a内前彼此结合。此外，尽管四种组合物124a、126a、128a和130a被描述为单独组分，但所述单独组分中的两种或更多种可以被一起冻干成单个颗粒并设置于隔室118a、120a或36中的任一者中。

如上文所述，上文所述的任何测定结构可以与额外测定复用于单个微流体装置中。图12描述根据本公开和要求保护的发明概念构建的微流体装置的另一个实施方案。微流体装置通过一般参考数字200表示且类似于图5-11的微流体装置10、10a、40、40a、80、110和110a，不同之处在于微流体装置200含有多个隔室，所述多个隔室提供复用测定形式。微流体装置200包括壳体202，所述壳体202包括样品施加室204、第一入口通道206、第二入口通道208、第一隔室210和第二隔室212。样品(诸如，但不限于，血液样品)可以施加至样品施加室204，所述样品施加室204与(或能够与)入口通道206和208流体连通。第一入口通道206与(或能够与)第一隔室210流体连通。第一入口通道206和第一隔室210表示如上文详细描述的测定结果，且图12举例说明其最简单的实施方案(即，其中第一隔室210含有第一、第二和第三组合物214、216和218，以及敏化剂220)。尽管这种所述测定结构类似于图7中描述的测定结构，但应理解的是，上述描述或本文另外设想的任何其他测定结构均可以用于复用测定微流体装置中。

微流体装置200还提供第二入口通道208，所述第二入口通道208与(或能够与)第二隔室212流体连通。第二入口通道208和第二隔室212被简单地描述以举例说明第二测定结构的存在；应理解的是，任何测定结构/构架均可以与本文描述或另外设想的任何测定复用，因此必要时可以存在多个隔室以提供与第二测定相关的所需结构。此外，还应理解的是，可为第二隔室212提供类似于第一隔室210中存在的那些的试剂，使得在同一微流体装置中提供通过相同测定机制检测不同被分析物的多种测定。或者，第二隔室212可表示完全不同的测定形式；唯一要求是，该第二测定形式能够与本文所述的测定之一复用。

实施例

下文提供实施例。然而，本公开和要求保护的发明概念应被理解为在本申请中不限于具体实验、结果和实验室程序。相反，所述实施例只是作为各种实施方案之一而提供，并且意在是示例性的，而不是穷尽的。

实施例1

图13含有根据本公开和要求保护的发明概念构建的开放系统微流体装置的一个实施方案的照片。图13中显示的微流体装置含有与图6中描述的微流体装置10a的基本构架类似的基本构架。图13中标记为“光学室”的隔室表示微流体装置10a的读取室28，而“含有冻干试剂的反应孔”表示微流体装置10a的第一、第二和第三隔室14a、24和26。

将样品手动添加至第一反应孔，并与其中含有的测定组分温育，然后将所得反应/温育混合物手动转移至另一孔，用于与其中含有的测定组分温育。然后将最终反应/温育混合物手动转移至用于激活敏化剂的光学室。可以在任何点(或多个点)将稀释剂手动添加至反应/温育混合物；即，可以将稀释剂添加至任何反应孔和/或光学室。

实施例2

图14含有根据本公开和要求保护的发明概念构建的封闭系统微流体装置的一个实施方案的照片。图14中显示的微流体装置含有与图11中描述的微流体装置110a的基本构架类似的基本构架。图14中标记为“光学室”的隔室表示微流体装置110a的读取室122a，而“反应孔中包装的冻干试剂球”表示微流体装置110a的第一、第二和第三隔室118a、120a和136中设置的组合物124a、126a、128a和130a。此外，标记为“稀释剂”的隔室表示含有试剂134a的额外隔室132a。

此外，图14举例说明额外结构的存在，所述额外结构被置于测定试剂的上游，并允许从整个样品分离出样品的某些组分和/或将所述组分递送至测定隔室。这些组分包括血浆分离隔室(其可以作为图11中的样品施加室114a的部分而包括在内)和计量通道(其可以作为图11中的入口通道116a的部分而包括在内)。

实施例3

本实施例提供根据本公开和要求保护的发明概念用于利用三种抗体/结合片段的cTnI免疫测定中的表位组合。在某些实施方案中，期望三个表位位于cTnI序列的内部(核心部分)，因为cTnI分子的N末端和C末端经受坏死心肌和患者血浆中存在的蛋白酶的蛋白水解。

图15中举例说明的cTnI免疫测定中，第一和第二抗体/结合片段结合图4的区域B内的重叠表位(即，SEQ ID NO:3)，而第三抗体/结合片段结合图4的区域C内的表位(即，SEQ ID NO:4)。具体而言，第一抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:8的表位，而第二抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:9的表位。SEQ ID NO:8和9的表位均为各自由cTnI的连续氨基酸序列形成的线性表位。SEQ ID NO:8和9从线性观点来看彼此重叠，且当特异性识别SEQ ID NO:8的抗体/结合片段结合cTnI时，特异性结合SEQ ID NO:9的抗体/结合片段不能与之结合；同样地，当特异性识别SEQ ID NO:9的抗体/结合片段结合cTnI时，特异性结合SEQ ID NO:8的抗体/结合片段不能与之结合。第三抗体或其结合片段特异性地结合SEQ ID NO:10的线性表位。SEQ ID NO:10不与SEQ ID NO:8或9任一者重叠，使得结合SEQ ID NO:8或9任一者的表位的抗体/结合片段不干扰另一抗体/结合片段与SEQ ID NO:10的表位的结合；因此，第三抗体/结合片段以及第一和第二抗体/结合片段之一均可以结合单个cTnI分子。

实施例4

本实施例提供根据本公开和要求保护的发明概念用于利用三种抗体/结合片段的cTnI免疫测定中的另一表位组合。图16中举例说明的cTnI免疫测定中，第一和第二抗体/结合片段结合图4的区域B内的重叠表位(即，SEQ ID NO:3)，而第三抗体/结合片段结合图4的区域C内的表位(即，SEQ ID NO:4)。具体而言，第一抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:9的表位，而第二抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:11的表位。SEQ ID NO:9和11的表位均为各自由cTnI的连续氨基酸序列形成的线性氨基酸表位。SEQ ID NO:9和11从线性观点来看彼此重叠，且当特异性识别SEQ ID NO:9的抗体/结合片段结合cTnI时，特异性结合SEQ ID NO:11的抗体/结合片段不能与之结合；同样地，当特异性识别SEQ ID NO:11的抗体/结合片段结合cTnI时，特异性结合SEQ ID NO:9的抗体/结合片段不能与之结合。第三抗体或其结合片段特异性地结合SEQ ID NO:10的线性表位。SEQ ID NO:10不与SEQ ID NO:9或11任一者重叠，使得结合SEQ ID NO:9或11任一者的表位的抗体/结合片段不干扰另一抗体/结合片段与SEQ ID NO:10的表位的结合；因此，第三抗体/结合片段以及第一和第二抗体/结合片段之一均可以结合单个cTnI分子。

实施例5

本实施例提供根据本公开和要求保护的发明概念用于利用三种抗体/结合片段的cTnI免疫测定中的又另一表位组合。在图17中举例说明的cTnI免疫测定中，第一抗体/结合片段特异性结合图4的表位区域A(即，SEQ ID NO:2)中的SEQ ID NO:12的表位，第二抗体/结合片段特异性结合图4的表位区域F(即，SEQ ID NO:7)中的SEQ ID NO:13的表位，且第三抗体或其结合片段特异性结合图4的表位区域B(即，SEQ ID NO:3)中的SEQ ID NO:14的表位。尽管SEQ ID NO:12和13的表位从线性结构观点来看可以不重叠，但这两个表位可在cTnI分子的三维构象结构中重叠。

该表位组合提供获得cTnI免疫测定的更高灵敏度的替代方式。在该情况下，一种捕获抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:12的表位，其位于cTnI分子的不稳定、经加工的N-末端区段，而另一捕获抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:13的表位，其位于cTnI分子的不稳定、经加工的C-末端区段。然而，检测抗体/结合片段结合SEQ ID NO:14的表位，其位于该分子的稳定的核心部分。

实施例6

本实施例提供根据本公开和要求保护的发明概念用于利用三种抗体/结合片段的BNP免疫测定中的表位组合。图18描述BNP的32氨基酸序列(指定为SEQ ID NO:15)和此非限制性实例的三个表位。

具体而言，第一抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:16的表位，而第二抗体/结合片段特异性结合SEQ ID NO:17的表位。SEQ ID NO:16和17的表位均为各自由BNP的连续氨基酸序列形成的线性表位。SEQ ID NO:16和17彼此重叠，且当特异性识别SEQ ID NO:16的抗体/结合片段结合BNP时，特异性结合SEQ ID NO:17的抗体/结合片段不能与之结合；同样地，当特异性识别SEQ ID NO:17的抗体/结合片段结合BNP时，特异性结合SEQ ID NO:16的抗体/结合片段不能与之结合。第三抗体或其结合片段特异性地结合SEQ ID NO:18的线性表位。SEQ ID NO:18不与SEQ ID NO:16或17任一者重叠，使得结合SEQ ID NO:16或17任一者的表位的抗体/结合片段不干扰另一抗体/结合片段与SEQ ID NO:18的表位的结合。因此，第三抗体/结合片段以及第一和第二抗体/结合片段之一均可以结合单个BNP分子。

因此，根据本公开和要求保护的发明概念，已提供了包含化学发光系统的组合物，以及含有所述组合物的试剂盒和微流体装置及其使用方法，其完全满足上文记载的目标和优点。尽管本公开和要求保护的发明概念已结合上文记载的具体附图、实验、结果和语言进行描述，但显然许多替代、改良和变化将是本领域技术人员显而易见的。因此，其意在包括落入本公开和要求保护的发明概念的精神和广泛范围内的所有这样的替代、改良和变化。

说明性实施方案

下文提供说明性实施方案。然而，本公开和要求保护的发明概念应被理解为在本申请中不限于具体实验、结果和实验室程序。相反，所述示例性实施方案只是作为各种实施方案之一而提供，并且意在是示例性的，而不是穷尽的。

说明性实施方案1：含有针对特定被分析物的化学发光检测系统的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a) 第一组合物，其包含可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第一抗体或其结合片段，其中所述第一抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的第一表位的检测抗体，由此所述可由单线态氧激活的化学发光化合物能够经由所述第一抗体或其结合片段间接结合所述被分析物；

(b) 第二组合物，其包含可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第二抗体或其结合片段，其中所述第二抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的第二表位的检测抗体，由此所述可由单线态氧激活的化学发光化合物能够经由所述第二抗体或其结合片段间接结合所述被分析物，且其中所述第一和第二表位至少部分重叠，使得所述第一和第二抗体或其结合片段不能同时结合单个被分析物分子；和

(c) 第三组合物，其包含第三抗体或其结合片段，所述第三抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的不与所述第一和第二表位重叠的第三表位的捕获抗体，由此单个被分析物分子可以结合所述第三抗体或其结合片段以及所述第一和第二抗体或其结合片段之一，且其中所述第三抗体或其结合片段能够与能够在其激发状态生成单线态氧的敏化剂结合，由此所述第三抗体或其结合片段与所述敏化剂的结合允许所述敏化剂与所述被分析物的间接结合。

说明性实施方案2：说明性实施方案1的试剂盒，其还包括敏化剂。

说明性实施方案3：说明性实施方案2的试剂盒，其中所述第三组合物还包含与所述第三抗体或其结合片段结合的敏化剂。

说明性实施方案4：说明性实施方案2或3的试剂盒，其中所述第三抗体或其结合片段是生物素酰化的，并且其中所述敏化剂结合有链霉亲和素。

说明性实施方案5：说明性实施方案4的试剂盒，其还包括其中设置有(a)-(c)的微流体装置。

说明性实施方案6：说明性实施方案1-5中任一项的试剂盒，其还包括稀释剂。

说明性实施方案7：说明性实施方案1-6中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二组合物中的所述可由单线态氧激活的化学发光化合物是相同的。

说明性实施方案8：说明性实施方案1-6中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二组合物中的所述可由单线态氧激活的化学发光化合物是不同的。

说明性实施方案9：说明性实施方案1-8中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二组合物中的至少一种还包含由激活的化学发光化合物激发的至少一种荧光分子。

说明性实施方案10：说明性实施方案1-9中任一项的试剂盒，其中(a)-(c)中的至少一种被进一步限定为冻干试剂的形式。

说明性实施方案11. 说明性实施方案10的试剂盒，其中(a)和(b)被冻干在一起。

说明性实施方案12. 说明性实施方案10或11的试剂盒，其还包括用于重构所述冻干试剂的赋形剂。

说明性实施方案13：说明性实施方案1-12中任一项的试剂盒，其中所述第一、第二和第三抗体或其结合片段中的至少一种是多克隆抗体。

说明性实施方案14：说明性实施方案1-13中任一项的试剂盒，其中所述第一、第二和第三抗体或其结合片段中的至少一种是单克隆抗体。

说明性实施方案15：说明性实施方案1-14中任一项的试剂盒，其中所述被分析物是肌钙蛋白I。

说明性实施方案16：说明性实施方案15的试剂盒，其中满足下列中的至少一项：

(a) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:3-7之一内的表位；

(b) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:3内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2和4-7之一内的表位；

(c) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:4内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-3和5-7之一内的表位；

(d) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:5内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-4和6-7之一内的表位；

(e) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:6内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-5和7之一内的表位；和

(f) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:7内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-6之一内的表位。

说明性实施方案17：说明性实施方案15或16的试剂盒，其中满足下列中的至少一项：

(i) 所述第一抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11之一的表位，所述第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11之一的表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:10的表位；和

(ii) 所述第一抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12或13的表位，所述第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12或13的表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:14的表位。

说明性实施方案18：微流体装置，其包括：

至少一个隔室，其含有：

(i) 第一组合物，其包含可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第一抗体或其结合片段，其中所述第一抗体或其结合片段是特异性结合特定被分析物的第一表位的检测抗体，由此所述可由单线态氧激活的化学发光化合物能够经由所述第一抗体或其结合片段间接结合所述被分析物；

(ii) 第二组合物，其包含可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第二抗体或其结合片段，其中所述第二抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的第二表位的检测抗体，由此所述可由单线态氧激活的化学发光化合物能够经由所述第二抗体或其结合片段间接结合所述被分析物，且其中所述第一和第二表位至少部分重叠，使得所述第一和第二抗体或其结合片段不能同时结合单个被分析物分子；和

(iii) 第三组合物，其包含第三抗体或其结合片段，所述第三抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的不与所述第一和第二表位重叠的第三表位的捕获抗体，由此单个被分析物分子可以结合所述第三抗体或其结合片段和所述第一和第二抗体或其结合片段之一；和

(iv) 能够与所述第三抗体或其结合片段结合的敏化剂，所述敏化剂能够在其激发状态生成单线态氧，且其中所述第三抗体或其结合片段与所述敏化剂的结合允许所述敏化剂与所述被分析物的间接结合。

说明性实施方案19：说明性实施方案18的微流体装置，其中(i)-(iv)被设置于相同隔室中。

说明性实施方案20：说明性实施方案19的微流体装置，其中所述敏化剂与所述第三抗体或其结合片段结合。

说明性实施方案21：说明性实施方案18-20中任一项的微流体装置，其还包括入口通道，可以通过所述入口通道设置样品，其中所述至少一个隔室能够与所述入口通道流体连通。

说明性实施方案22：说明性实施方案18的微流体装置，其进一步限定为包括至少两个隔室，其中第一隔室含有(i)、(ii)和(iii)，并且其中第二隔室含有(iv)。

说明性实施方案23：说明性实施方案22的微流体装置，其还包括入口通道，可以通过所述入口通道设置样品，其中所述第一隔室能够与所述入口通道流体连通，并且其中所述第二隔室能够与所述入口通道和所述第一隔室中的至少一者流体连通。

说明性实施方案24：说明性实施方案18-23中任一项的微流体装置，其中所述第三抗体或其结合片段是生物素酰化的，并且其中所述敏化剂结合有链霉亲和素。

说明性实施方案25：说明性实施方案18-24中任一项的微流体装置，其中所述第一和第二组合物中的所述可由单线态氧激活的化学发光化合物是相同的。

说明性实施方案26：说明性实施方案18-24中任一项的微流体装置，其中所述第一和第二组合物中的所述可由单线态氧激活的化学发光化合物是不同的。

说明性实施方案27：说明性实施方案18-25中任一项的微流体装置，其中所述第一和第二组合物中的至少一种还包含由所述激活的化学发光化合物激发的至少一种荧光分子。

说明性实施方案28：说明性实施方案18-27中任一项的微流体装置，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的至少一种被进一步限定为冻干试剂的形式。

说明性实施方案29：说明性实施方案28的微流体装置，其中(a)和(b)被冻干在一起。

说明性实施方案30. 说明性实施方案28或29的微流体装置，其还包括能够与所述入口通道和所述至少一个隔室流体连通的至少一个额外隔室，其中所述至少一个额外隔室含有用于重构所述至少一种冻干试剂的赋形剂。

说明性实施方案31：说明性实施方案18-30中任一项的微流体装置，其还包括能够与所述入口通道和所述至少一个隔室中的至少一者流体连通的至少一个额外隔室，且其中所述至少一个额外隔室含有稀释剂。

说明性实施方案32：说明性实施方案18-30中任一项的微流体装置，其还包括允许在与(i)-(iv)中的任一种温育前分离所述样品的组分的至少一个额外隔室。

说明性实施方案33：说明性实施方案18-32中任一项的微流体装置，其中所述第一、第二和第三抗体或其结合片段中的至少一种是多克隆抗体。

说明性实施方案34：说明性实施方案18-33中任一项的微流体装置，其中所述第一、第二和第三抗体或其结合片段中的至少一种是单克隆抗体。

说明性实施方案. 说明性实施方案18-34中任一项的微流体装置，其中所述被分析物是肌钙蛋白I。

说明性实施方案36：说明性实施方案35的微流体装置，其中满足下列中的至少一项：

(a) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:3-7之一内的表位；

(b) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:3内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2和4-7之一内的表位；

(c) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:4内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-3和5-7之一内的表位；

(d) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:5内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-4和6-7之一内的表位；

(e) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:6内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-5和7之一内的表位；和

(f) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:7内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-6之一内的表位。

说明性实施方案37：说明性实施方案35或36的微流体装置，其中：

(i) 所述第一抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11之一的表位，所述第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11之一的表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:10的表位；和

(ii) 所述第一抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12或13的表位，所述第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12或13的表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:14的表位。

说明性实施方案38：用于检测样品中的特定被分析物的存在和/或浓度的方法，其包括以下步骤：

(a) 同时或完全或部分依次组合：

(i) 疑似含有所述特定被分析物的样品；

(ii) 第一组合物，其包含可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第一抗体或其结合片段，其中所述第一抗体或其结合片段是特异性结合特定被分析物的第一表位的检测抗体；

(iii) 第二组合物，其包含可由单线态氧激活的化学发光化合物和与之结合的第二抗体或其结合片段，其中所述第二抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的第二表位的检测抗体，且其中所述第一和第二表位至少部分重叠，使得所述第一和第二抗体或其结合片段不能同时结合单个被分析物分子；

(iv) 第三组合物，其包含第三抗体或其结合片段，所述第三抗体或其结合片段是特异性结合所述被分析物的不与所述第一和第二表位重叠的第三表位的捕获抗体，由此单个被分析物分子可以结合所述第三抗体或其结合片段以及所述第一和第二抗体或其结合片段之一；和

(v) 能够与所述第三抗体或其结合片段结合的敏化剂，所述敏化剂能够在其激发状态生成单线态氧；

(b) 允许(ii)、(iii)和/或(iv)与所述样品内的被分析物结合，其中形成包含被分析物分子以及(ii)和(iv)的第一夹心复合体，且形成包含另一种被分析物分子以及(iii)和(iv)的第二夹心复合体，且其中(v)与所述第一和第二夹心复合物中的(iv)结合，因此使所述敏化剂紧密靠近(ii)和(iii)中的所述化学发光化合物；

(c) 激活所述敏化剂以生成单线态氧，其中所述第一和第二夹心复合物中存在的所述敏化剂的激活引起所述第一和第二夹心复合物中存在的所述化学发光化合物的激活；

(d) 测定由所述第一和第二夹心复合物中存在的所述激活的化学发光化合物生成的化学发光的量；

(e) 任选地重复步骤(b) – (d)；以及

(f) 通过分析如此产生的化学发光的量来检测所述被分析物的存在和/或浓度，其中所述化学发光的量与所述样品中的被分析物的量直接成正比。

说明性实施方案39：说明性实施方案38的方法，其中所述敏化剂是光敏剂，且其中步骤(c)被进一步限定为经由光照射激活所述光敏剂。

说明性实施方案40：说明性实施方案38或39的方法，其中所述样品选自全血、血浆、血清、唾液、痰液、脑脊髓液(CSF)、皮肤、间质液、泪液、粘液、尿液、拭子及其组合。

说明性实施方案41：说明性实施方案40的方法，其还包括将所述样品在与(ii)-(v)中的任一者组合前暴露于分离步骤的步骤。

说明性实施方案42：说明性实施方案38-41中任一项的方法，其中所述第三抗体或其结合片段是生物素酰化的，并且其中所述敏化剂结合有链霉亲和素。

说明性实施方案43：说明性实施方案38-42中任一项的方法，其中所述第一和第二组合物中的所述可由单线态氧激活的化学发光化合物是相同的。

说明性实施方案44：说明性实施方案38-43中任一项的方法，其中所述第一和第二组合物中的所述可由单线态氧激活的化学发光化合物是不同的。

说明性实施方案45：说明性实施方案38-44中任一项的方法，其中所述第一和第二组合物中的至少一种还包含由所述激活的化学发光化合物激发的至少一种荧光分子。

说明性实施方案46：说明性实施方案45的方法，其还包括测量由所述荧光分子发射的光的量以确定所述样品中的被分析物的量的步骤。

说明性实施方案47：说明性实施方案38-46中任一项的方法，其还包括在步骤(c)前稀释(i)-(v)的混合物的步骤。

说明性实施方案48：说明性实施方案38-47中任一项的方法，其中所述第一、第二和第三抗体或其结合片段中的至少一种是多克隆抗体。

说明性实施方案49：说明性实施方案38-48中任一项的方法，其中所述第一、第二和第三抗体或其结合片段中的至少一种是单克隆抗体。

说明性实施方案50：说明性实施方案38-49中任一项的方法，其中所述被分析物是肌钙蛋白I。

说明性实施方案51：说明性实施方案50的方法，其中：

(a) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:3-7之一内的表位；

(b) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:3内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2和4-7之一内的表位；

(c) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:4内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-3和5-7之一内的表位；

(d) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:5内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-4和6-7之一内的表位；

(e) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:6内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-5和7之一内的表位；并且

(f) 所述第一和第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:7内的重叠表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:2-6之一内的表位。

说明性实施方案52：说明性实施方案50或51的方法，其中：

(i) 所述第一抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11之一的表位，所述第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:8、9和11之一的表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:10的表位；并且

(ii) 所述第一抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12或13的表位，所述第二抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:12或13的表位，且所述第三抗体或其结合片段特异性结合SEQ ID NO:14的表位。

序列表

<110> Li, Jay J.

Ledden, David J

Cowden, Eric Scott

Lu, Donglai

<120> 利用三种抗体的发光氧通道免疫测定及其生产和使用方法

<130> 2014P07114WO

<150> 61/970596

<151> 2014-03-26

<160> 18

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 210

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu

20 25 30

Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln

35 40 45

Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu

50 55 60

Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys

65 70 75 80

Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu

85 90 95

Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr

100 105 110

Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu

115 120 125

Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu

130 135 140

Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly

145 150 155 160

Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val

165 170 175

Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg

180 185 190

Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe

195 200 205

Glu Ser

210

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr

1 5 10 15

Arg Ala

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu

1 5 10 15

Asn Arg Glu Val

20

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Asp

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Ala Thr Glu Pro His

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Asp

1 5

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 15

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp

1 5 10 15

Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His

20 25 30

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Lys Val Leu Arg Arg His

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Cys Lys Val Leu Arg Arg His

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg

1 5